牙周病动物模型的建立

牙周病动物模型的建立

牙周病是一种常见的慢性口腔病，直接影响口腔健康。也是导致口腔失牙的主要原因。由于牙周病临床表现复杂,要进一步探讨其发病机制及治疗反应,单凭临床观察是远远不够的。建立稳定、可靠的实验性牙周炎的动物模型,可以为探讨牙周病病因提供科学可信的实验依据,它也是牙周病研究的关键点之一。1影响牙周炎的因素自20世纪60年代中期以来,关于牙周病病因的研究进入了一个崭新的时代,目前公认牙周病是多因素疾病。人们普遍认识到菌斑细菌及其产物是引发牙周病必需的始动因子,同时细菌激发的宿主炎性反应和免疫反应也是造成和影响牙周组织破坏的重要原因。还有一些局部因素会促进或有利于牙菌斑的堆积,或造成对牙周组织的损伤,或加重已存在的牙周病;另外,在菌斑存在情况下,机体反应性的差别对牙周炎的发生发展起着重要作用。为彻底了解牙周炎的发病机制,本文就不同方法建立的一系列牙周炎的动物模型进行综述。2作为牙周炎模型的动物及设备易感牙周炎的动物种属很多,一般可选大鼠、金黄地鼠、兔、犬、小型猪和各种灵长类,其中犬、灵长类、鼠较常用于建立牙周炎模型的研究。灵长类的牙和牙周解剖、组织病理、微生物及免疫学等都与人有极其相似之处,常作为牙周病病因、病理研究的动物模型。但由于价格昂贵,不易购买而难以用来开展大规模的研究。犬的牙周组织结构和组成与人类亦极为相似,也有乳牙和恒牙两副牙列,且价格适中,容易控制,是较理想的用于建立实验性牙周炎模型的动物,尤其是Beagle犬,早在1965年Egelberg已利用毕格犬牙颈部龈缘水平结扎丝线并配以形成牙周炎的食谱建立了理想的牙周炎模型,为国外学者广为接受。大鼠是啮齿动物,其磨牙区牙龈龈沟、牙槽嵴形态及牙周组织学表现与人较为相似,且价格便宜、操作简便。因而,作为一种模型动物,大鼠越来越多的用于牙周病的实验研究。孟焕新等采用小型猪成功地建立了实验性牙周炎模型,实验表明小型猪也有乳牙和恒牙两副牙列,牙的大小与人近似。小型猪在消化系统、皮肤结构、骨骼发育、营养需要以及矿物代谢等方面与人类有较大相似性,而且价格相对较便宜,有较好的应用前景。3模型构建方法3.1局部因素诱导着牙周疾病的形成3.1.1牙周炎的发生即局部结扎实验动物的磨牙或前磨牙。常用的结扎材料是丝线,也有用棉线、弹性橡皮圈、正畸用钢丝作为结扎材料的。国内学者杨少强等利用Beagle犬建立模型时,于实验牙牙颈部龈缘水平结扎丝线,并向根尖方向压入龈沟内,同时配以形成牙周炎的食谱。并于每次检查后把结扎丝线沿根尖方向压入一新深度。随着时间的进展,炎症逐渐由牙龈炎向牙周炎发展,症状也逐渐加重。在1~3个月后逐渐出现了牙龈脓肿和牙石、牙周袋等不同程度的牙周炎表现。最近,有人为防止丝线结扎滑脱,用丝线结扎牙齿并在牙龈上缝2针固定,加高糖饮食的方法成功地诱导鼠牙形成牙周炎。3.1.2重度牙周炎利用高糖黏性软食易黏附于牙面,从而促使细菌的附着滋生。Iwama等的研究中大鼠4~6周即可出现牙龈炎的各种表现,3个月后可观察到重度牙周炎症状。近来有些学者同时加以牙龈剥离造成牙周软组织的急性炎症,牙龈局部剥离为细菌附着和高糖饲料提供固着点,同时易造成食物嵌塞,再配以黏性较强的高糖饲料,则更易形成牙周炎。日本学者Tomofuji等发现,高胆固醇饮食也可以造成大鼠牙周组织的氧化性损伤、破坏。3.1.3牙槽骨吸收检测Li等选用100只C57BL/6大鼠,实验组48只,用牙龈卟啉单胞菌浸湿的棉线结扎于左上第2前磨牙颈部,每天更换1次。分别于第0、3、7、10天处死,牙龈卟啉单胞菌感染组结果显示,上皮根向生长增快,炎性浸润明显,破骨细胞活跃,用形态计量法、组织形态测量和CT3种方法均检测出牙槽骨吸收。王仲杰等采用厌氧菌龈沟接种加局部剥离的方法,将伴放线放线杆菌和牙龈卟啉单胞菌接种于大鼠双侧上颌第1磨牙龈沟内,同时剥离接种区牙龈,降低牙周结合上皮对致病菌的抵御能力,利于放线放线杆菌和牙龈卟啉单胞菌定植成活,以加速牙周炎的形成。结果发现,在实验2周时牙周袋深度明显升高,牙槽骨吸收,固有层炎性细胞和牙槽嵴处的破骨细胞增多,4周时破骨细胞的数量和活性增强,说明2周时牙周炎已经开始形成,4周时牙周炎仍处于活动期。3.1.4牙石植入的时间汪黎明等采用植入牙结石的方法诱导牙周炎。局部麻醉下分离兔上下前牙唇侧的牙龈,使之形成1cm左右的牙周袋。然后植入备用的牙结石(选择临床上1个月内局部及全身未服用抗生素的牙周炎患者的牙石放入肉汤管内,置37℃恒温箱中24h后使用),每周放1次。埋入牙结石第2天,可见牙龈红肿充血等,1周左右挤压牙周袋可有分泌物流出,并持续数周。实验组动物病理表现为充血、水肿及炎性细胞浸润明显,有1/3以上的标本中有变性坏死及脓肿形成。有的学者采用人工去除猴牙槽骨形成骨缺损,然后植入人的牙石以诱导牙周炎。术后10个月发现手术牙局部牙龈红肿,牙周袋深6mm,易出血,X线示牙槽骨吸收,随即作再进入手术复查证实骨缺损存在,说明牙周炎模型已经建立,且病变与人相似。3.1.5菌斑微生物的释放Rogers等在斯-道鼠牙龈内注射从放线共生放线杆菌中获得的脂多糖成功建立牙周病模型,在实验第8周产生典型的牙周炎症,显微CT检测可见到显著的骨丧失。许多资料表明,一些个体可能对某些细胞或脂多糖产生异常强的炎性反应,释放高水平的炎性介质如前列腺素E2、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α。菌斑微生物的脂多糖在牙周袋内释放,可进入牙周组织。脂多糖与脂结合蛋白结合,其结合物与单核-巨噬细胞的CD14受体结合,从而激活单核-巨噬细胞产生前列腺素E2、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和基质金属蛋白,并通过白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α激活成纤维细胞产生更多的前列腺素E2和基质金属蛋白酶,破坏牙槽骨和结缔组织。3.1.6血清学检测大鼠体内中的细胞组织为研究白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α在建立牙周炎动物模型中有重要作用时,马宁等将24只健康大耳白兔随机分为4组,磨牙颈部结扎钢丝,在兔的牙周组织注射白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α,以生理盐水为对照,每隔4d给药。各组给药3次后,第15天各组均处死3只,其余的再给药3次,第30天全部处死。组织学观察结果表明,实验组15d后牙龈组织血管扩张充血,牙槽骨改建活跃,有大量的骨吸收陷窝及破骨细胞,并有新骨形成和成骨细胞出现,30d后仅表现为大量的骨吸收陷窝及破骨细胞,无成骨现象,且以联合应用组最为显著。3.2局部因素和全身因素的结合形成的牙周炎3.2.1中医本虚表现周秀青等将SD大鼠随机分成对照组、激素组、结扎组及实验组,并分别给予生理盐水、醋酸泼尼松龙肌肉注射、左上颌第1磨牙钢丝结扎和肌肉注射激素加结扎处理。给予激素注射的大鼠于用药第3天后便出现了进食下降、少动倦怠等表现,与中医肾虚的症状相似;而未注射激素的大鼠则无上述表现。结扎组大鼠牙间乳头出现了溃疡及慢性炎症变化,牙槽嵴轻度吸收。激素组大鼠的牙槽骨呈骨质疏松性改变,牙周组织则无炎症;而上述所有病理性变化均在实验组大鼠牙周组织中出现,对照组则正常。表明糖皮质激素注射和牙间结扎的方法可成功地建立与临床相符的牙周炎模型,为临床牙周炎研究提供有效的手段。3.2.2造模前后大鼠牙周健康中医常将牙周炎分为3型,胃火型、肾虚胃热型、肾虚型。而牙周炎常以胃火型居多。常用的局部刺激+激素方法造模,易导致肾虚型及肾虚胃热型模型。汪鋆植等采用牙龈剥离+糖饲料+凝胶培养基方法造模,直接引胃火上行,且培养基经动物慢慢吞食后,对胃有一定刺激,同时引起菌群失调,进一步产生胃火,形成胃火型牙周炎。该实验选用雄性Wistar大白鼠48只随机分为4组,正常对照组(喂养普通饲料和冷开水)、糖饲料+结扎组、牙龈剥离+糖饲料组、牙龈剥离+糖饲料组+凝胶组。结扎组右侧上颌第1磨牙牙颈部结扎,喂养糖饲料和冷开水;第3组于实验第1天将右侧下颌第1磨牙牙周与牙根面分离,深度4mm,喂养糖饲料和冷开水;第4组于实验第1天将右侧下颌第1磨牙牙周与牙根面分离,深度4mm,喂养糖饲料和冷开水。于分离后第3天起每鼠每日右侧龈下灌入凝胶0.2mL,尽量缓慢灌入牙周,避免直接吞服,灌后禁水4h。凝胶制备:聚乙烯醇8g、葡萄糖5g、可溶性淀粉2g、蛋白胨1g、酵母浸膏0.5g。先将聚乙烯醇溶在50mL生理盐水中,再加入其他物质溶解;取健康大鼠1只,分离胃及十二指肠,用生理盐水冲洗3次,每次10mL,取上清液加入凝胶中;用磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲溶液调pH至7.4,加水定容到100mL密闭备用。各造模组实验后第3天,牙龈组织出现红肿,食欲下降,出现躁动不安,1周后体质量下降,皮毛疏松不顺,食欲不振,牙龈肿胀暗红。以后逐渐出现牙周袋形成加深。第4组病变发展较快,较重,病变程度较一致。对照组无上述症状。第4组2周时,牙周膜炎症明显,上皮下结缔组织血管扩张充血,并有中性粒细胞浸润;4周时,牙周膜炎症明显,上皮下结缔组织血管扩张充血,并有淋巴细胞浸润,牙槽骨骨髓腔中也可见明显的血管扩张充血及淋巴细胞浸润,牙槽骨破骨细胞吸收明显。3.2.3免疫抑制作用下基因型的检测国内有学者将实验大白鼠的龈袋内接种阿米巴原虫3~30d,发现,接种者出现感染的全身症状,而且牙周脓肿形成,取脓液涂片或培养均发现阿米巴原虫,而且伪足伸缩明显,活动活跃,说明将大白鼠进行免疫抑制后,在阿米巴原虫感染下可形成牙周组织破坏。Nikolopoulos等把SD大鼠分为4组,第2组预先注射阿米巴原虫3次;第3组预先注射阿米巴原虫和共生菌3次。分别在第0、2、4周进行病原生物和病理切片,检验显示第2、3组中注射的共生菌已经繁殖传代,阿米巴原虫和共生菌都占优势;在第2周,病理切片发现各组都有病原体侵蚀和骨质流失,并在第2、3组发现