从肉鸡冷冻肌肉组织中提取线粒体的方法

从肉鸡冷冻肌肉组织中提取线粒体的方法

线条是细胞中的重要细胞器之一。它的基本功能是氧化和磷酸化，这是细胞产生pd的重要场所。线粒体作为机体的“动力工厂”,历来是生物学研究的焦点之一。现代动物医学研究表明,动物机体线粒体功能失调时会诱发很多疾病,如肉鸡腹水症和细菌内毒素血症等。近十多年来,随着分子生物学和生物遗传学研究技术突飞猛进的发展,对线粒体的研究已取得许多重大进展,其焦点已转向线粒体与细胞死亡,线粒体的进化生物学,线粒体分子病等。线粒体在许多生命现象中扮演着重要的角色。所以,从动物组织中提取线粒体作为研究的基础模型很有意义。关于从动物组织中提取线粒体方法的研究报道很少,且条件控制很不相同,且大多条件控制不甚严格,尤其是提取所用缓冲液的成分过于单一,提取过程中的很多细节问题注意不够,这些都会直接影响到提取的线粒体的质和量,以及针对线粒体所进行的下一步研究。所以,本文以从肉鸡冷冻肌肉组织中提取线粒体的提取方法为例,结合我们在线粒体的提取实践中的切身感受,讨论如何从动物组织中正确提取线粒体。由于动物细胞的线粒体较小,而真核细胞及其碎片、蛋白质沉淀物都比较大,所以用差速离心的方法可以将它们分离开来。差速离心法又叫分级离心法,是当非均一粒子(大小、密度各不相同)的悬浮液被离心时,各种粒子将以各自的沉降速率移至离心管底部,逐步在管底形成沉淀。为了分出特定组分,需进行一系列离心。首先选择一个离心速度和离心时间,第1次离心时把大部分不需要的更大粒子沉降去掉。这时所需要的组分大部分还留在上清液中,又选择第2个离心速度和离心时间,使大部分不需要的更小的粒子留在上清液。去掉上清液后,添加相同介质把沉淀悬浮起来,重复上述的差速离心,反复几次,直至达到所需要的粒子纯度为止。(1)打开冷冻离心机,把转子置于离心机中,降置低温15min。(2)将聚碳酸酯离心管、缓冲液A、B和C,置于冰浴中冰冷。(1)称取8.0～8.5g超低温冷冻的心肌组织,置于冰浴中的小烧杯内。(2)倒入50mlA液,用冷冻后的剪子在小烧杯中把组织剪碎。(3)倒掉A液,将组织移入预冷的聚碳酸酯离心管中,换上B液100ml。(4)在组织捣碎机(DY89-I型)中均质(5次共20s)。(5)用提取B液稀释至140ml,转移同等量于50ml聚碳酸酯离心管中。(6)离心力600g离心10min。(7)用4层粗棉纱布过滤悬浮液,弃去沉淀。(8)离心力10000g离心15min,弃上清,留沉淀。(9)用B液洗沉淀,混合于1试管中。(10)离心力10000g离心15min,弃上清,C液洗沉淀。(11)离心力8000g离心10min,即得线粒体沉淀。(12)重新将线粒体沉淀悬浮于3mlC液中。(13)分装成6管,待测定用。如暂时不用,则液氮迅速冷冻,低温冷冻存放。(1)pH7.4A液:Sucrose34.2,EDTA2.92,Tris-HCl15.76,KCl3.4296,配制成1000ml。(2)pH7.4B液:Sucrose34.2,EDTA2.92,Tris-HCl15.76,KCl3.4296,BSA5,配制成1000ml。(3)pH7.4C液:甘露醇41.906,Sucrose23.94,Tris-HCl3.152,KH2PO40.6845,EDTA-2Na0.00584,配制成1000ml。提取得到淡黄色的线粒体悬浮液。可对其进行鉴定:JanusGreenB是对线粒体专一的活性染料,具有脂溶性,能跨过细胞膜,有染色能力的基团带正电,结合在负电性的线粒体内膜上,内膜的细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态,呈现蓝绿色,而在胞质内,染料被还原成无色。线粒体浸没在该染料中能维持活性数小时,可直接观察到生活状态线粒体的外形、分布及运动。其纯度因动物情况不同、提取的组织器官不同、组织器官离体存放时间不同、具体操作过程不同等差异较大。在此不再提供具体的参考指标。(1)整个提取过程应在冰浴中进行,密切防止氧化问题。因线粒体是细胞有氧呼吸的主要场所,是呼吸链存在的主要部位,很多和呼吸代谢有关的重要酶类(如ATP酶,超氧化物歧化酶,谷胱甘肽过氧化物酶等)及线粒体DNA等重要物质都存在于此,它们的提取均要求低温条件。低温操作对其这些物质的活性至关重要,所以,整个提取过程应在冰浴中进行,密切防止氧化问题。这也直接影响测定结果的准确度和我们对线粒体的研究。(2)线粒体提取所用缓冲液宜现用现配,低温存放。提取所用缓冲液为含多种成分的酸碱度稳定的良好缓冲体系,可以最大程度地保持线粒体提取所需的内环境及各种活性物质的生理活性。在某些提取方法的报道中,缓冲液的成分过于简单,这对于线粒体活性的保持很不利。缓冲液的成分是否完备非常重要。且缓冲液宜现用现配,一次不宜配置太多,最好2天内用完,放置过久亦会影响到指标测定的准确性。试液配好后先放于冰箱充分预冷后再用。且整个提取过程中缓冲液都应置于冰浴中存放,这样才能保证线粒体提取的低温环境。(3)提取采用低温冷冻离心机,注意控制离心速度和时间。线粒体的提取主要是采用差速离心的方法进行,离心速度和时间应严格控制,才能有效提取到线粒体。(4)新鲜组织和冷冻组织线粒体提取有所不同。新鲜组织和冷冻组织线粒体提取方法基本相同,但从新鲜组织中提取线粒体,现提现测,各种活性物质的活性保持较好,对缓冲液的要求没有冷冻组织高,而从冷冻组织中进行线粒体提取对缓冲液的要求则相对更高,因冷冻需更加保持活性物质的条件。(5)不同组织线粒体提取方法有所差别。由于不同组织生物氧化进行的强弱不同,线粒体含量亦有所不同,所以,提取难易程度及线粒体含量均不同,由易到难依次为肝脏、小肠黏膜、肌肉,肺组织较难提取。基本提取方法相同,不同组织有所差别,主要体现在缓冲液的不同,离心速度和时间的不同。应视具体情况选择所需器官参考相应方法进行提取。(6)提取所需组织的量和缓冲液用量应根据实际情况灵活掌握。如果可供提取用的组织量没有上述方法要求的多,亦可进行提取,只需改变相应提取用缓冲液的量就可以了,最终提取到的线粒体的浓度自然也相应降低,但仍可按上述方法进行悬浮分装保存。(7)提取得到的线粒体应妥善保存。正常的动物线粒体寿命一般仅为1周时间。离体的线粒体在低温下(0～8℃)其活性可以保存3～7天,冷冻条件下(-18℃)