黄酮类药物与牛血清白蛋白相互作用研究

黄酮类药物与牛血清白蛋白相互作用研究

血清是人和动物血清中最丰富的蛋白质，与各种带正、负电负荷物质和电中性材料相互作用。各种药物进入人体首先与血清白蛋白结合,通过血浆的存贮和运输,到达受体部位产生药理作用。测定血清白蛋白的变化,可为疾病诊断、疗效观察提供有价值的资料及数据。因此,从不同角度研究以白蛋白为代表的蛋白质与具有生物活性小分子间的相互作用目前已成为药物领域的研究热点之一。荧光光谱法是研究生物大分子,特别是蛋白质与各种有机小分子、离子或无机化合物相互作用的重要手段。通过荧光光谱技术可以获得蛋白质分子中荧光生色基团的种类、结构和所处微环境及其分布情况等有用信息,同时还可以得到外源物质与生物大分子相互作用的有关数据。黄酮类化合物是指以黄酮(2-苯基色原酮)为母核而衍生的一类黄色色素。其中包括黄酮的同分异构体及其氢化的还原产物,也即以C6-C3-C6为基本碳架的一系列化合物。黄酮类化合物大多数具有药理活性,木犀草素、芹菜素和葛根素均属于黄酮类药物,结构式见图1。本工作通过荧光光谱方法研究了木犀草素、芹菜素和葛根素3种黄酮类药物与牛血清白蛋白(BSA)间的相互作用,探讨了其与BSA作用的机理、荧光猝灭常数以及与BSA作用的结合常数和结合位点数等信息。1试验部分1.1配制0.0.0.0.0.5%10-1的缓冲溶液,在溶液中混溶。请如下做法RF-5301型荧光分光光度计;TB-85型恒温水浴;pHSJ-4A型pH计。牛血清白蛋白(BSA)标准储备溶液:称取牛血清白蛋白(相对分子质量为65000)0.6500g,加5g·L-1氯化钠溶液溶解,定容至100mL容量瓶,浓度为1.0×10-4mol·L-1。三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲溶液:用0.20mol·L-1Tris和0.10mol·L-1盐酸在试验温度下用0.50mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH至7.40。木犀草素、芹菜素、葛根素标准溶液:用TrisHCl缓冲溶液为溶剂配成1.0×10-3mol·L-1,在0~4℃冰箱中保存。所用试剂均为分析纯,水为双重蒸馏水。1.2荧光光谱测定在10mL比色管中依次加入pH7.40的TrisHCl缓冲溶液2mL,1×10-4mol·L-1BSA溶液1mL,以及一定量木犀草素、芹菜素、葛根素标准溶液,用水稀释至刻度混匀,在试验温度下恒温1h,采用1cm石英比色皿,选择激发波长为285nm绘制荧光光谱,以及Δλ为60nm或15nm同步荧光光谱,木犀草素与葛根素荧光测定中激发和发射通带均为5nm,测定芹菜素激发和发射通带为3nm。2结果与讨论2.1谱图的建立按试验方法分别测定了木犀草素、芹菜素和葛根素浓度对牛血清白蛋白荧光光谱的影响,荧光光谱图见图2。由图2可知:随着木犀草素、芹菜素、葛根素浓度逐渐增大,牛血清白蛋白的荧光强度均逐渐降低,这是由于蛋白质中存在的色氨酸和酪氨酸,使其具有内源荧光,加入的外源性药物木犀草素、芹菜素及葛根素与BSA之间产生相互作用导致BSA内源荧光强度有规律地降低。2.2荧光加强研究的静态猝灭类型引起BSA荧光猝灭的原因可能有动态猝灭和静态猝灭两种。动态猝灭过程遵循Stern-Volmer方程。式中:F0和F分别为不存在和存在猝灭剂时荧光物质的荧光强度;[Q]为猝灭剂的浓度(mol·L-1);KSV为动态猝灭常数(即Stern-Volmer猝灭常数,L·mol-1);Kq是由扩散过程控制的双分子动态荧光猝灭速率常数(L·mol-1·s-1);τ0为没有猝灭剂存在下荧光分子平均寿命,生物大分子荧光平均寿命约为10-8s。静态猝灭过程遵循下式关系:式中:Ks为静态猝灭常数(即配合物的缔合常数)。随温度的升高动态猝灭常数增大,而静态猝灭常数减小,可由此判断荧光猝灭类型。在不同的温度下,以F0/F对相应的[Q]作图,可得到木犀草素、芹菜素、葛根素对BSA荧光猝灭的Stern-Volmer方程及猝灭常数,见表1。一般认为,各类猝灭剂对生物大分子的最大动态猝灭速率常数为2×1010L·mol-1·s-1,而从表1结果可知:木犀草素、芹菜素和葛根素对BSA荧光猝灭的猝灭速率常数Kq数量级均在1012以上,可以初步判断加入木犀草素、芹菜素及葛根素导致BSA荧光猝灭过程是以静态猝灭为主,又随温度升高Stern-Volmer方程的斜率减小,进一步表明该过程是以静态猝灭为主。2.3f0-f/f对lg[q]的双对数图当小分子与大分子结合时其表观结合常数Kb与结合位点数n由下式求出:分别在292K,311K温度下做木犀草素、芹菜素和葛根素与BSA的lg(F0-F)/F对lg[Q]的双对数图,根据截距和斜率求得不同温度的Kb和n,见表2。由表3可看出:木犀草素与BSA的结合位点数n接近2,说明木犀草素与BSA可形成两个结合位点。而芹菜素和葛根素与BSA的结合位点数n接近1,表明芹菜素和葛根素与BSA的结合位点数n接近1。木犀草素、芹菜素和葛根素与BSA的结合常数均大于104数量级,表明木犀草素、芹菜素和葛根素与BSA之间有较强的结合作用,可以被蛋白质运输和储存。2.4温度对牛血清白蛋白作用的影响药物等有机小分子和蛋白质等生物大分子之间的结合力主要包括氢键、范德华力、静电引力和疏水作用力等。根据反应前后热力学焓变ΔrHm和熵变ΔrSm的相对大小,可以判断药物与蛋白质之间的主要作用力类型,在温度变化不大时,反应的焓变ΔrHm可以看作一个常数,通过热力学公式:式中:K类似于在相应温度T下Stern-Volmer方程中的猝灭常数KSV;R为气体常数,计算出不同温度下木犀草素、芹菜素和葛根素与牛血清白蛋白作用的自由能变ΔrGm、焓变ΔrHm和熵变ΔrSm,见表3。木犀草素、芹菜素和葛根素与BSA的热力学参数ΔrHm<0和ΔrSm>0,根据Ross等总结的判断生物大分子与小分子结合力性质和生物大分子自身结合力性质的热力学规律,推断出木犀草素、芹菜素和葛根素与BSA之间的作用力是以静电引力为主的。2.5forer偶极-偶极非辐射能量转移的曲线根据Förster偶极-偶极非辐射能量转移理论,当供能体发射荧光,其荧光发射光谱与受能体的吸收光谱有足够程度的重叠,且供能体与受能体之间的最大距离不超过7nm时,将会发生非辐射能量转移,导致荧光猝灭,由此可求出小分子化合物和蛋白质分子的结合位置相对于发射荧光的基团之间的距离。据此理论,非辐射能量转移效率E,供能体与受能体之间的结合距离R及临界能量转移距离R0之间有下列关系:式中:F和F0分别为存在和不存在受能体时供能体的荧光发射强度;K2为偶极空间取向因子;N为介质折射常数;Υ为BSA的荧光量子产率,试验条件下,K2取受能体和供能体各项随机分布的平均值2/3,Υ取蛋白质中色氨酸的量子产率0.15;N取水和有机物折射指数的平均值1.334;J为给体荧光发射光谱与受体吸收光谱的重叠积分,可表示为:式中:F(λ)是BSA在波长λ处的荧光强度;ε(λ)是受能体在波长λ处的摩尔吸光率。采用矩形分割法可以求出光谱重叠区域的积分值J,继而求出R06,E和r的数值。根据木犀草素、芹菜素和葛根素在292K时与BSA的物质的量之比为1比1时的吸收光谱与荧光光谱的重叠图(图略),以Förster偶极-偶极非辐射能量转移机理,积分图中光谱重叠部分,求得重叠积分值J,进而根据上式求出R0,E和r的值见表4。由表4可知:木犀草素、芹菜素和葛根素与BSA分子间的距离r<7nm符合能量转移理论,说明木犀草素、芹菜素和葛根素与BSA是足够靠近,其结合是通过非辐射能量转移而促使蛋白质的荧光猝灭。2.5-l-110.110.1的荧光光谱由Δλ=15nm所作同步荧光光谱只显示酪氨酸残基的光谱特征,而Δλ=60nm的同步荧光光谱仅显示色氨酸残基的光谱特征。因芳香氨基酸残基的最大发射波长与其所处环境极性有关,若最大发射波长改变,说明残基所处的微环境发生了改变,由发射波长的改变可判断BSA中芳香氨基酸残基所处微环境的变化。在BSA浓度为0.1×10-5mol·L-1时,逐渐增加木犀草素、芹菜素和葛根素浓度,并逐步测定Δλ为15nm和Δλ为60nm时的同步荧光光谱图。随着木犀草素、芹菜素和葛根素的加入,酪氨酸残基和色氨酸残基的荧光光谱峰均产生猝灭,其中木犀草素的加入导致酪氨酸残基的荧光光谱峰位发生了紫移,色氨酸荧光光谱峰位置无明显变化,表明木犀草素的加入使得酪氨酸残基所处的微环境疏水性增加,亲水性降低,而对色氨酸残基微环境构象的改变不大;芹菜素的加入对酪氨酸及色氨酸荧光光谱的位置均无明显移动,表明芹菜素对蛋白质分子构象的改变不大;葛根素的加入对酪氨酸残基的荧光峰的位置