植物精油对烟草黑胫病的抗治作用

植物精油对烟草黑胫病的抗治作用

草场上的黑胫骨疾病是由杂草杆菌（dat.）引起的。这是世界上最严重的卷烟植物栽培疾病之一，也是中国烟草种植区的主要疾病。据不完全统计,平均每年因该病给烟草种植造成的损失达1亿元以上。目前烟草黑胫病防治药剂主要是甲霜灵,但由于其作用位点单一、药剂选择压力及天然抗性群体的存在,使烟草疫霉抗药性逐年增强,对烟草黑胫病的大范围发生难以起到控制作用。因此,新型烟草黑胫病防治药剂的开发与应用势在必行。植物源农药作为生物农药的一类,其开发利用对有害生物防治的前景十分广阔。植物源农药与化学农药相比具有低毒、无残留、选择性高及不易使害虫、病菌产生耐药性的特点,是一种与环境有良好相容性的新型环保农药。精油源于植物的果实、叶片、茎秆、种子、花和根等,是植物次生代谢的香气成分和挥发性产物,是一种重要的植物源农药。目前已有文献报道植物精油对疫霉属病害抑制作用的研究。对烟草疫霉的防治,仅Bowers等通过丁香油和胡椒芥子油混合液、肉桂提取物以及合成肉桂油对土壤中烟草疫霉菌丝、孢子囊及厚垣孢子的抑制作用进行了相关报道,但未在烟草体内进行相关评价。柠檬草、罗勒、椒样薄荷、茶树和桉叶在中国普遍种植,材料来源广泛,精油的化学成分和抗细菌、抗真菌活性已有大量报道,但其体外和体内的抗烟草疫霉活性尚未见评价。本研究通过体外菌丝生长抑制试验筛选抑制烟草疫霉菌丝生长的有效精油及浓度,并结合温室体内预防和治疗试验确定烟苗病情指数,计算相对防效,以期为新型农药的开发与应用奠定理论基础。1材料和方法1.1材料表面1.1.1试验中的蘑菇烟草黑胫病菌株由云南省农业科学研究院环境资源研究所植物病理室提供。采用燕麦培养基(OA),培养温度26℃。1.1.2给草药的连接主栽品种K326为黑胫病接种材料。采用漂浮盘育苗,于玻璃温室内进行。期间剪叶2次,待苗龄60～70d时进行接种试验。1.1.3提取的提取材料柠檬草、罗勒、椒样薄荷、茶树和桉叶鲜叶均采自上海交通大学农业与生物学院植物园,采摘后平铺于摊晾室,待阴干后作为精油提取材料。1.1.4给药处方的比较以市售药剂烯酰氟吗·甲霜灵锰锌58%可湿性粉剂2000倍(推荐浓度190μg/mL,JSL2000)药液为阳性对照。1.2方法1.2.1精油的提取分别准确称取5种植物材料500g,注入蒸馏水3L,采用水蒸气蒸馏法提取精油,3h后收集精油并用无水Na2SO4干燥,置于棕色瓶内4℃低温保存。1.2.2油乳液以吐温-80为乳化剂,无菌双蒸水为溶剂配制成浓度为48mg/mL的精油药剂母液,吐温-80终含量为0.5%。1.2.3真菌生长率试验(1)精油的稳定性测定取培养3周的烟草疫霉平板,用打孔器沿其外围取5mm菌丝块,将其均匀摆放于精油浓度为240μg/mL的OA培养基内,每平板接种3个菌丝块,设置3个重复,以0.5%吐温-80为对照。培养3d后采用十字交叉法测定菌落直径,计算菌落生长抑制率,计算公式如下:(2)培养基平板选取柠檬草、罗勒和椒样薄荷精油,分别配制含精油浓度为400、320、240、160、80、40、20、10μg/mLOA培养基平板。具体接种及计算方法参照(1)。1.2.4温室预防和治疗(1)棉田浅排液对棉花保湿的作用参考Keller等方法并稍加改进,具体步骤如下。预防试验:取苗龄60～70d烟苗,使用刀片轻轻划伤茎基部表皮,立即进行基部药剂喷施处理,覆棉花保湿,24h后将直径0.5cm菌丝块置于基部划伤处。治疗试验:取苗龄一致的烟苗并使用刀片轻轻划伤茎基部表皮,将直径为0.5cm的菌丝块置于基部划伤处,并覆棉花进行保湿,24h后去除棉花并对基部喷药处理,并再次覆盖棉花保湿。精油药液浓度分别为160、320、480和640μg/mL,以JSL2000为药剂阳性对照,0.5%吐温-80水溶液为空白对照。每处理6株烟苗,设置3个重复,于7d后记录病情。(2)病情调查及评价标准以株为单位进行调查,病害严重程度依据茎基部病斑扩展程度分级。病害分级标准、调查方法及病情指数、相对诱导效果计算按照中华人民共和国国家标准(GB/T23222-2008)的规定进行。病情指数和相对诱导效果计算公式如下:1.2.5数据分析主要由Excel、SPSS统计软件完成。2结果2.1真菌生长率试验2.1.1植物精油的抑制作用将直径5mm菌落置于精油浓度为240μg/mL的OA培养基平板上,采用菌丝生长速率法,3d后进行统计。结果图1所示:5种植物精油对烟草疫霉均有一定程度的抑制作用。其中,柠檬草和椒样薄荷效果明显,菌落生长百分抑制率分别为90.06%和89.86%,两者之间无显著性差异,但与另外3种精油有极显著差异;罗勒精油次之,抑制率为84.42%,与其他4种植物精油有极显著差异;茶树和桉叶油效果最差,菌丝生长抑制率分别为32.1%和27.3%。由此可见,柠檬草、椒样薄荷和罗勒精油在240μg/mL浓度下抑菌效果较好,均在80%以上。2.1.2种含精油药剂平板对烟草疫霉生长的影响为进一步确定柠檬草、罗勒和椒样薄荷精油最低抑菌浓度,将其分别配制成浓度为400、320、240、160、80、40、20和10μg/mL的OA培养基平板上,3d后进行统计。结果如图2所示:3种含精油药液平板随其浓度的降低,对烟草疫霉的菌丝生长抑制率均呈现逐渐降低的趋势。柠檬草、椒样薄荷和罗勒精油分别在320、400、400μg/mL时可以完成抑制菌丝生长。由此可见,柠檬草精油抗烟草疫霉效果最好,最低抑菌浓度为320μg/mL。2.3温室内草流行草的繁殖2.2.1柠不同草精油的病情指数表1预先对烟苗茎基部刀片划伤处喷施精油药剂处理,24h后进行菌丝接种,7d后统计结果。结果如表1所示:病情指数随柠檬草精油浓度的升高而呈现逐渐降低的趋势,相对诱导效果呈现逐渐升高的趋势。柠檬草精油640μg/mL时病情指数为16.67,与160、320μg/mL存在显著性差异,与480μg/mL和JSL2000(190μg/mL)无显著性差异;柠檬草精油640μg/mL时相对诱导效果为81.93%,与160、320μg/mL存在显著性差异,但与480μg/mL和JSL2000无显著性差异。2.2.2柠不同品种草的病情指数分布预先对烟苗茎基部伤口处进行菌丝接种,24h后进行药剂喷施处理,7d后进行结果统计。结果如表1所示:病情指数随精油浓度升高呈现逐渐降低的趋势,相对诱导效果呈现逐渐升高的趋势。柠檬草精油640μg/mL病情指数最低,为56.79,与柠檬草480μg/mL和JSL2000无显著性差异,与柠檬草160、320μg/mL存在显著性差异,与160μg/mL存在极显著差异;柠檬草640μg/mL相对诱导效果最高,为38.44%,与柠檬草480μg/mL、JSL2000无显著性差异,与柠檬草160、320μg/mL存在极显著性差异。3柠柠檬草精油的抑菌活性研究柠檬草、椒样薄荷、罗勒、茶树和桉叶精油抑制植物致病真菌活性已有大量研究,它们对不同致病菌的抑制活性具有较大差异。本研究发现,柠檬草精油对烟草疫霉菌丝生长具有显著的抑制活性。有研究证实植物精油的抑菌活性主要取决于它的主要成分。本研究中柠檬草精油主成分的定性定量分析及其抑菌活性有待进一步研究。精油体外抗植物致病菌试验已有很多报道,但很少研究应用于活体植株中。本研究通过温室预防和治疗试验发现柠檬草精油对烟草疫霉有一定的控制作用。这或许归因于的柠檬草精油对烟草疫霉菌丝生长的直接抑制作用,另外植物精油对真菌的孢子囊、厚垣孢子和孢子发芽抑制活性也有大量报道。另外本研究发现柠檬草精油对烟草黑胫病的预防效果明显优于治疗效果,主要是由于喷施精油药剂后其吸附于伤口、茎秆表面及土壤中,从而直接阻止致病菌的感染;另外植物精油药剂喷施烟草叶片后可提高烟草抗性,间接抑制病原菌的侵染。4