光对烟草修养成分及物质代谢的影响

光对烟草修养成分及物质代谢的影响

这是植物生长的重要因素之一，超过90%的干物质来自光合作用。卷烟是一种耐旱的叶子植物，对植物的生长和发育的影响尤为重要。光能影响叶片的碳结合作用，改变叶片结构和叶脉含量，激活或抑制各种与生长发育相关的酶的活性，改变养分代谢和次生代谢的生理强度和方向，最终影响叶片的产量、形状和质量特征。茎是植物表面的一个特殊官，具有“受刺激器”和“分泌器官”的双重功能。它不仅能感觉外部环境的微妙刺激，还能诱导各种抗反应，分泌重要的气味前体物质，提高叶片的质量。之前，关于卷烟和植物血浆的光因子研究主要集中在傅体密度和表面活性剂的含量上，但很少报告光度以及毛主席的发育和物质代谢。分析其原因可能是由于毛体的独特生理位置和结构的研究。在本试验中，选择具有波动育种期条件的香烟，控制光照度，采用改进的毛囊分离提取技术，确定高纯度的毛发和冠层植物。在不同的光度处理下，不同程度的光对侧的浓度、形状、物质分泌以及毛囊双层合成的重要遗传因素的形态强度存在差异。光度对预防和转化毛羽的影响。1材料和方法1.1光照度试验与大田期开放式的环境相比,室内(或棚内)育苗期的环境更容易被调节和掌控,因此,试验以苗期的K326为材料,依照《优质烟栽培技术规范》进行催芽和漂浮育苗,于苗龄45d(大十字期)时将烟苗分组进行光照度试验.1.2测试方法1.2.1中间光照度控制光周期恒定(12h光照/12h黑暗),按光照度不同分为3组处理:处理1:高光照度15380lx;处理2:中间光照度9610lx;处理3:低光照度7500lx.试验过程中室温规律一致(白天26℃/夜间22℃),各组烟苗均为36株,试验处理30d后混合取样,光照度值均使用DigitalLuxMeterAR823(SmartSensor公司,中国香港)仪器测得.1.2.2叶片表面毛细效应取处理烟株第1片新叶(叶长10cm),用镊子直接撕取叶脉一侧下表皮在MOTIC光学显微镜下统计腺毛密度.从叶脉另一侧切下约5mm×8mm的平整叶片小块,使用NikonSMZI500体视显微镜(Nikon公司,日本)观察叶片表面腺毛形态并拍照.1.2.3色谱法制备待测液西柏烷类物质是腺毛分泌物的主要成分,参考蔡莉莉等的提取方法并进行改良,对处理后的叶表腺毛分泌物进行提取.称取0.400g烟叶冻干粉末,置于40mL色谱瓶中,加入0.5mL内标溶液(1.2125g正十八烷醇、1.0005g蔗糖八乙酸脂的500mL二氯甲烷溶液),加入10mL乙腈,超声萃取10min后加入无水硫酸钠适量除水,用移液枪移取1mL上清液加入到1.5mL的色谱瓶中,然后用氮气吹干,向吹干后的1.5mL色谱瓶中加入DMF和BSTFA各250μL,在75℃水浴中进行衍生化反应60min,取出来后加入吡啶和N,O-双乙酰胺各125μL完全溶解,即为待测液.待测液用GC/MS与微机联用进行定性、定量分析.色谱仪型号HP-5890,质谱仪型号vc-70SE.色谱柱:DB-5MSUI石英毛细管柱(30m×0.25mmi.d.×0.25μmd.f.);进样口温度:250℃;程序升温:40℃保持2min,然后以6℃·min-1升温至180℃保持2min,以2℃·min-1升温至280℃保持20min;载气:高纯氦气;载气流速:恒流0.8mL·min-1;进样量:1.0μL;分流比:15∶1.MS条件:传输线温度250℃;EI离子源温度280℃;电离能量70eV;质量数范围50~650amu;检索谱库NIST08.结果经Excel计算扣除内标整理成图表.1.2.4rt-pcr检测烟草核糖干预变性叶面腺毛的提取参考ERMING等的方法并进行改良.选取幼嫩健康的叶片液氮中低温固定形态5min,使用硬度适中的毛刷由叶基向叶尖方向将腺毛刷至盛有适量液氮的研钵中,每个样品刷取约100cm2的叶片,刷取完成后直接研磨提取.RNA提取使用QIAGEN公司的MiniKit试剂盒,反转录使用NEWBIOINDUSTRY公司生产的M-MLV反转录酶,反转录的cDNA用于RT-PCR检测.引物设计采用PremierPrime5.0软件,根据Genbank发布的L25,DXR,CBT和CYP71D16序列设计各基因扩增引物(表1),进行RT-PCR.其中L25是烟草核糖体蛋白,本研究中作为内参基因.PCR反应体系为20μL.PCR扩增程序为:94℃5min预变性;94℃30s变性,48~51℃30s退火(具体按各引物Tm值设定),72℃1min延伸,共30个循环;72℃延伸10min.PCR产物使用1.5%琼脂糖凝胶进行检测,并观察拍照.2结果与分析2.1中间光照度对腺头激素含量的影响选择生长发育一致的烟苗在不同光照度下处理30d,对叶面腺毛进行观察统计,结果如图1所示.由图1可以看出,3种光照度下叶片腺毛结构相似,多为长柄多细胞腺头腺毛,柄细胞为3~5个,腺头细胞1~3个.但高光照度下腺毛个体较大,柄细胞发达,腺头多为单细胞,内含物少,颜色浅淡(图1-A);中间光照度下腺毛柄较细弱,腺毛腺头发育充分,腺头细胞多,细胞质充盈,颜色呈现深绿色,表明叶绿体发达,叶绿素含量较高(图1-B);低光照度下腺毛腺头多为单细胞,还有一定数量的叶绿体,但胞质不饱满(图1-C).不同光照度下腺毛密度统计发现(图1-D),中间光照度下腺毛密度极显著高于低光照度和高光照度,并以长柄腺毛的差异为主,短柄腺毛在不同光照度下差异并不显著;低光照度下的叶面腺毛密度略高于高光照度下,但两者之间没有显著差异.2.2不同光照度叶片中西柏三烯二醇的分离效果腺毛分泌西柏烷类化合物的组分中以西柏三烯二醇含量为最高,占叶面化学物质的60%~80%,其分泌量与腺毛类型、密度及发育状态关系密切.采用GC/MS技术,对不同光照度下叶片中西柏三烯二醇进行检测分析,结果如图2所示.由图2可以看出,α-西柏三烯二醇和β-西柏三烯二醇的比例在不同光照度下大致相同,大约为后者的3倍;在中度光照度下西柏三烯二醇含量为最高,其次是高光照度,低光照度下西柏三烯二醇含量为最低,这说明光照度较高和较低均对腺毛分泌产生了抑制.2.3醇合成酶系统脱氧磷酸木酮糖还原异构酶(DXR)催化脱氧磷酸木酮糖形成甲基赤鲜糖醇-4-磷酸,是双萜和四萜代谢前体物质———IPP合成的关键酶基因;西柏三烯一醇合成酶(CBT)可以催化牻牛儿牻牛儿基焦磷酸(GGPP)向西柏三烯一醇的转化生成;而西柏三烯二醇合成酶(CYP71D16)则可催化西柏三烯一醇向西柏三烯二醇转化:3种酶与西柏烷类分泌物的合成密切相关.以不同光照度处理的叶片为材料,刷取叶面腺毛,利用RT-PCR技术检测DXR,CBT,CYP71D16基因转录水平的表达变化,结果如图3所示.由图3可以看出,低光照度下与西柏三烯二醇合成相关的基因在转录水平表达更为活跃.3高光照度对肾上腺素合成相关基因表达的影响本试验对不同光照度下烟苗叶面腺毛的比较研究证明,光照度对腺毛发育及物质代谢有较大影响.中间光照度处理下,叶面腺毛密度大,腺头细胞发育充分,西柏烷类化合物含量较高.光照过强或过弱,腺毛密度及生长发育都受到负影响.低光照度下,腺毛密度明显降低,腺头细胞发育受阻,得西柏烷类化合物含量均较低.翁梦苓等研究也发现,在大田遮荫条件下烟株叶面腺毛密度较小,腺毛叶绿素荧光强烈,但腺毛分泌物含量却明显降低,与本研究结果一致.高光照度下,腺毛密度也有所降低,虽然腺毛柄细胞比较发达,但腺头细胞明显发育迟缓,尤其是叶绿素含量明显较低,这或许是因为产生了“光抑制”.王瑞等和江力等的研究均表明,高光照度下叶片PSⅠ,PSⅡ及全电子传递活性和碳酸酐酶(CA)活性下降,光合能力下降.而本研究证实高光照度对腺毛的形态发生及物质代谢也有一定的抑制作用.对腺毛基因表达的分析发现,腺毛中西柏烷类化合物合成相关基因的表达与物质含量之间并不呈现紧密相关性.虽然低光照度下DXR,CBT,CYP71D16基因的表达水平最活跃,但中间光照度下西柏烷化合物含量最高.推测有2个方面的原因:一方面,光照度对腺毛密度、腺头细胞发育和分化的影响大于对腺