降解菌hn36对烟苗茎尖和顶叶二氯喹啉酸的降解动态

降解菌hn36对烟苗茎尖和顶叶二氯喹啉酸的降解动态

二氯弥勒草是一种具有特殊的选择性杂草活性物质的脱希尔杂草（guson，1998）。对于在农业生产区前田种植的二氯弥勒草剂残留在土壤中，降低速度缓慢，导致晚草的生长畸形，严重制约了植烟区叶片的生产，严重影响了叶片的产量和质量。微生物技术的抗旱性土壤中的二氯弥勒草剂为恢复污染土壤提供了一种新的环境保护方法。沈标等(2002)、陈泽鹏等(2004)、胡江等(2005)、杨基峰等(2006)、汤洪等(2008)已报道有关除草剂污染土壤生态环境及其修复方面的研究,Zabaloy等(2010)研究了微生物降解菌在土壤中对2,4-D的降解效果,但是关于二氯喹啉酸污染土壤的修复报道较少。陈泽鹏等(2007)研究结果证明施用活性炭对土壤中残留二氯喹啉酸致烟草畸形症状有一定的减轻作用,但不能使烟草恢复正常生长。刘华山等(2010)的研究结果表明,在二氯喹啉酸胁迫下,喷施不同浓度的硝普钠(SNP)能减少烟叶活性氧的产生和丙二醛的积累,对烟苗保护酶系统具有修复作用。目前尚无关于利用微生物修复受二氯喹啉酸污染土壤的最佳技术报道,对受害的烟草茎尖和叶片细胞超微结构影响更无报道。本文在含二氯喹啉酸的土壤中加入降解菌HN36后,在电镜下观察烟株细胞超微结构的变化,利用高效液相色谱测定土壤中二氯喹啉酸浓度,采用微生物技术降解二氯喹啉酸,旨在为土壤健康质量的修复和促进稻烟轮作地区烟叶生产的发展提供理论依据。1材料和方法1.1性添加剂nicotiagman二氯喹啉酸降解菌HN36(博德特氏菌Bordetellasp.)由河南农业大学环境微生物实验室提供;50%二氯喹啉酸可湿性粉剂由江苏绿利来股份有限公司生产;供试普通烟(Nicotianatabacum)品种为‘K326’;盆栽试验用的土取自河南农业大学科教园区,为砂壤土,pH为7.97,含有机质12.93g·kg–1,全氮0.87g·kg–1,全磷0.42g·kg–1,碱解氮57.43mg·kg–1,速效磷27.75mg·kg–1,速效钾164.15mg·kg–1。1.2方法1.2.1烟苗的处理及样品的制备试验共设3个处理:(1)健康烟株(不施二氯喹啉酸和降解菌);(2)受害烟株(施二氯喹啉酸,有效浓度为0.085mg·kg–1;不施降解菌);(3)修复烟株(施二氯喹啉酸,有效浓度为0.085mg·kg–1;降解菌HN36数量为3×1010个·g–1干土)。将水、二氯喹啉酸溶液及加入降解菌的二氯喹啉酸溶液喷洒到3kg过筛(直径2mm)风干的土壤上,拌匀后装入高15cm、直径为20cm的塑料盆中,每个处理重复3次,保持土壤含水量为田间最大持水量的60%。将生长健壮一致的五叶期烟苗移栽到盆中,待烟株长至8片叶时取样在电镜下进行观察。分别取烟株的茎尖、顶叶和中部叶(自上而下第4片叶)进行处理。叶片取自中脉附近的叶肉组织用刀片切成1mm×1mm的小片。样品用戊二醛-锇酸双重固定法固定。材料先经4%戊二醛固定,经过磷酸缓冲液冲冼后,再用1%四氧化锇固定。磷酸缓冲液冲洗,系列丙酮30%→50%→70%→80%→90%进行脱水,梯度渗透液渗透后,用Epon812环氧树脂包埋,钻石刀切成超薄切片,经醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色,在JEM-100SX型透射电镜(JEOLLtd.,Akishima,Japan)下观察并拍照。1.2.2土壤二氯羟基酸含量测定土壤中加入二氯喹啉酸的有效浓度为0.085mg·kg–1(商品推荐量为0.375kg·hm–2,代号为A)同时加入不同量降解菌设4个处理:T0:A+0个·g–1干土(CK),T1:A+3×108个·g–1干土,T2:A+3×109个·g–1干土,T3:A+3×1010个·g–1干土。将二氯喹啉酸和降解菌溶液拌到20kg过筛(2mm)的风干土中拌匀后装入高45cm、直径为35cm的塑料盆中,每处理重复3次,室温下放置。保持土壤含水量为田间最大持水量的60%,处理后15、30、45和60天取0–15cm土层的土测定二氯喹啉酸含量,在中国科学院南京土壤研究所采用ProminenceUFLCXR型高效液相色谱仪(Shimadzu,Tokyo,Japan)测定。色谱操作条件:(1)选150mm×4.6mm(内径)不锈钢色谱柱,内装ODS-(2)填充物,粒径5μm;流动相:甲醇+水+冰乙酸=85+15+0.1(V);流量:0.8mL·min–1;检测波长:238nm;进样体积:10μL。二氯喹啉酸降解率(%)=(C0–Ct)/C0×100%;C0:土壤中初始二氯喹啉酸浓度(mg·kg–1),Ct:t时刻取样时土壤中二氯喹啉酸浓度(mg·kg–1)1.2.3抗硝泮hn36对二氯丁基二胺酸群落质量的影响试验处理同1.2.1,在烟叶成熟时,按王瑞新(2003)的方法,测定烟叶中常规的化学成分。2结果2.1叶绿细胞的组织结构在电镜下观察到健康烟株茎尖细胞能正常生长和分化,细胞内有大量的细胞核和叶绿体等细胞器,结构完整清晰,叶绿体结构完整,片层清晰质膜紧贴在细胞壁上(图1A、1D)。受二氯喹啉酸危害的烟株茎尖细胞受到破坏,细胞内大量的细胞器溶解,出现空泡化现象。叶绿体结构发生变形,基粒片层模糊(图1B、1E)。施用二氯喹啉酸降解菌的烟株茎尖细胞中,细胞器增多,细胞内大部分细胞正常,叶绿体所含淀粉粒数目增多,基粒片层较清晰(图1C、1F)。受害状况得到一定程度的修复。2.2细胞内质壁分离在电镜下观察到健康烟株顶叶细胞器紧贴细胞壁排列,叶绿体结构完整,叶绿体由双层外被膜包围,外膜清晰完整。叶绿体内含有较少的淀粉粒(图2A、2D)。受害的烟株顶叶细胞内发生质壁分离现象,叶绿体结构受到严重破坏,甚至发生变形,叶绿体外膜受到破坏,细胞内含物质发生溶解(图2B、2E)。修复烟株的顶叶细胞受到破坏的程度减轻,质体紧贴细胞壁排列,细胞器得到修复,基粒片层结构虽然还有些模糊,但比受害烟株有明显的修复(图2C、2F)。2.3基粒片层结构在电镜下观察到健康烟株中部叶叶片细胞结构完整清晰,细胞壁光滑,细胞之间有较小的间隙,质膜紧贴在细胞壁上,内部片层系统发育良好,基粒片层结构清晰,叶绿体内含有淀粉粒(图3A、3D)。受害烟株中部叶片细胞中叶绿体形态变化较小,叶绿体结构完整,片层结构模糊(图3B、3E)。修复的烟株中部叶片细胞结构完整,片层结构清晰,细胞器形态变化较小(图3C、3F)。2.4氯喹啉酸降解率由表1可知,随着处理时间的延长,土壤中二氯喹啉酸的浓度呈下降趋势而降解率逐渐升高。到第45天时,加入的降解菌处理的土壤中二氯喹啉酸降解率均高于未加降解菌的处理,且降解率随着菌种量的增加而提高。到第60天时,当加入降解菌数量为3×109个·g–1干土和3×1010个·g–1干土时,二氯喹啉酸浓度未检测出,而对照仍残留50%以上的二氯喹啉酸,表明降解率随着菌种量的增加而提高,其中菌种量为3×1010个·g–1干土(T3)时降解效果最佳。2.5总糖、还原糖、淀粉和烟碱含量由表2可以看出,在受二氯喹啉酸危害的烟叶成熟时,总糖、还原糖、淀粉和钾含量均明显低于对照,而总氮和烟碱含量明显高于对照;但是加入降解菌处理的修复烟叶化学成分与对照基本近似,表明修复效果明显。3氯喹啉酸对烟草超微结构的影响在稻烟轮作区,由于水稻田施用的二氯喹啉酸降解慢,残留期长,对后茬烟草产生危害。陈泽鹏等(2004)研究表明二氯喹啉酸可导致烟草出现畸形生长,新叶向叶背面内卷皱缩,并逐渐发展成线状叶型,对产量和品质都有很大的影响。研究证明二氯喹啉酸对烟草的危害还表现在烟株茎尖和叶片超微结构受到严重破坏,其中茎尖和上部叶受害程度大于中下部叶(图1B、1E;图2B、2E;图3B、3E),这和于红丽等(2010)关于铜胁迫下小麦(Triticumaestivum)幼苗细胞不同部位或不同细胞器的伤害程度存在一定差异的研究结果基本相似。商文静等(2007)、张景云等(2010)和宇克莉等(2010)的研究表明细胞器及膜系统会受到不同程度的破坏特别是叶绿体、线粒体及细胞核等超微结构都发生不同程度的变化。汤洪(2008)等研究结果也表明,草甘膦处理烟草对烟叶细胞中叶绿体基粒片层结构有破坏作用,本研究结果表明,二氯喹啉酸胁迫下的烟株茎尖和叶片细胞中叶绿体及膜系统等都受到破坏,与已有研究结果相一致。左涛等(2010)研究表明,向土壤中施用二氯喹啉酸降解菌不仅对受害烟株的保护酶系统有一定修复作用,而且对受害烟株的茎尖和叶片的超微结构也有明显的修复作用(图1C、1F;图2C、2F;图3C、3F)。二氯喹啉酸在酸性土壤中分解缓慢,陈泽鹏等(2007)的研究表明,土壤中施用生石灰对受害烟苗有一定的修复作用,可能是通过提高土壤的pH值从而促进二氯喹啉酸分解而实现的,但由于土壤是一个大的缓冲系统,施用生石灰调节土壤pH有一定限度,因此施用生石灰对受害烟株修复虽然有一定作用,但不能修复正常。Zhang等(2006)筛选分离出一株菌株DDV-1(Ochrobactrumsp.)以敌敌畏作为唯一碳源,能够修复土壤的污染。本研究结果表明,土壤中施用二氯喹啉酸降解菌,能增强土壤微生物活性,受害烟株修复效果更明显,可能是基于降解菌能加速二氯喹啉酸的降解,当降解菌降解60天后,土壤中已检测不出二氯喹啉酸,而未加降解菌处理的土壤中,尚残留有50%以上的二氯喹