利用微卫星dna标记评价猪近交系遗传结构

利用微卫星dna标记评价猪近交系遗传结构

中国是当地猪种最丰富的国家。《中国猪品种年鉴》中包括48个主要品种，占世界总数的1.3%。但对这些宝贵资源的深入研究甚少,目前仅对其中一些显而易见的性状,例如高繁殖力、杂交优势体型矮小等进行了一定程度的开发利用。但对那些稍深层次的特异性状,如耐近交、特殊的抗病性等的认识还不够。国外在20世纪50-60年代就开始了大规摸的近交猪的培育,但至今尚未见成功报道。中国农业科学院北京畜牧兽医研究所早在20世纪80年代,通过将海南岛的同窝2头母猪(后死亡1头)和1头公猪引入到北京,开始了五指山小型猪(WuzhishanMiniaturepig,WZSP)的异地保种。在一公一母的基础上近交繁育了19世代,基本形成了一个近交群体,并已对其矮小性、与人类免疫学的相似性等进行了分子遗传学研究。本研究利用微卫星DNA标记来检测WZSP近交家系的遗传变异程度,评价近交猪群体的遗传结构,揭示近交系猪微卫星基因座上等位基因的变化规律,探讨可能维持WZSP种质特性的等位基因以及遗传稳定性的分子遗传基础,为将WZSP近交系培育成为人类理想的实验动物模型提供理论依据。1材料和方法1.1dna的提取和pcr所用的75份耳皮肤组织样本均采自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所的WZSP近交系培育基地,其中F13世代15头,F14世代13头,F15世代11头,F16世代14头,F17世代14头,F18世代8头,全部样品用75%酒精处理后,于-20℃冰箱保存,备提DNA。10×PCRbuffer、dNTP和TaKaRaTaqDNA聚合酶均购自宝生物工程大连有限公司;ABI3130XL遗传分析仪上样缓冲液去离子甲酰胺(Hi-Di)和分子量内标GeneScan-500LIZ购自ABI公司。1.2方法1.2.1tete参考《分子克隆实验指南》,采用常规的酚抽提法,将提取的DNA溶于TE中,-20℃保存。用琼脂糖凝胶电泳和DU640NucleicAcidandProteinAnalyzer双重检测DNA的纯度和浓度,然后稀释至50ng·μL-1备用。1.2.2微卫星标记选择根据Barker1.2.3pcr扩增14对微卫星标记引物根据其扩增片段的大小和标记的荧光颜色分为5组,每组中的片段大小和荧光颜色不发生重叠,同一颜色内的不同引物彼此扩增的片段大小相差10bp以上。首先对每个基因座进行最佳退火温度的梯度摸索,最后使用如下反应条件完成PCR扩增:95℃预变性5min;94℃变性30s,52~60℃退火30s,72℃延伸40s,40个循环;72℃延伸10min。PCR反应的总体积为15μL:引物F、R各0.2μL,dNTP0.3μL,Taq酶0.1μL,Mg2+0.9μL,ddH2O9.8μL,模板DNA2μL,10×PCRbuffer1.5μL。1.2.4dna测序pcr将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,根据条带的强弱程度确定加入量,一般为0.3~1.0μL,上样缓冲液去离子甲酰胺(Hi-Di)7.75μL,分子量内标GeneScan-500LIZ0.25μL。具体步骤为:①根据样本量计算出所需上样缓冲液去离子甲酰胺(Hi-Di)和分子量内标GeneScan-500LIZ的总体积,用微量加样器量取后充分混合,根据每孔8μL的量分别添加到ABI测序仪专用96孔板的加样孔中;②根据已计算好的PCR产物的量,将PCR产物加到对应的孔中;③3000r·min-1瞬时离心,取出后95℃变性5min,立即冰浴5min;④上样于ABI3130XL遗传分析仪,运行DataCollection程序,开始电泳、收集荧光信号、形成胶图。1.2.5wzsp的基因组织设计利用GeneMapper软件对收集的原始数据进行分析,辅以人工校正,得到WZSP近交系的微卫星基因座等位基因片段的大小和基因型;根据个体的基因型数据来估算总群体、各家系和各世代的基因杂合度(H)、多态信息含量(PIC)和等位基因数(N)。2结果2.1杂合型基因型荧光PCR产物的检测结果如图1所示。各泳带表示WZSP微卫星基因座的等位基因大小和基因型,例如第一条泳带表示S0070基因座在第51号个体的等位基因大小和基因型,其中有2个等位基因片段,大小分别为263.99和276.5bp,为杂合基因型。依次类推,第2、3、4、5条泳带分别表示S0036、Sw1377、Sw2、Sw2409基因座在60、68、60、51号个体的等位基因大小和基因型,其中51号个体在Sw2409基因座上仅存在1个片段大小为93.6bp的等位基因,为纯合基因型。在14个微卫星基因座上共检测到38个等位基因,其中Sw2409、Sw510和Sw713个基因座在13世代时就已经完全被固定而仅表现纯合基因型。2.2基因座的h从表2中可以看出,WZSP近交系的75个个体在14个微卫星基因座上的H为0~0.67,平均为0.42,其中有3个基因座的H为0,另外3个在0.33~0.49之间,其余8个在0.54~0.67之间。14个基因座上的N最多为4个,最小为1个,平均为2.71个。此外,总群体的平均PIC为0.37。2.33基因座等位基因信息分析由表3可以看出,WZSP3个近交家系的平均N和H分别为2.36、2.29、2.50和0.41、0.45、0.42;I、II和III家系中分别有5、6和4个基因座仅拥有2个等位基因;从14个基因座上等位基因数的差异来看,3个家系之间已呈现分化的趋势,如Sw2和Sw225基因座的等位基因数分别为3、2、4和2、4、3。因此,这3个家系正向着与本系相关等位基因纯化的方向选育。3个家系在Sw71、Sw510和Sw2409基因座上等位基因杂合度均为0,但在Sw205、Sw874和Sw936等基因座却表现高度的多态性,每个家系均存在3~4个等位基因和较高的H(>0.57)。其中Sw936基因座上88bp的等位基因已获得国家发明专利(ZL02149030.9)。结果表明:虽然近交使其向不同家系方向分化,但均仍然保持WZSP某些共同的种质特性。2.4fpsdvf8时代基因座的杂合状态由表4可以看出,H和N均随着近交代数的推进而逐渐降低,这是近交系所特有的规律。至F18世代时尤为明显,其平均H和N已由F13世代时的0.31和2.21分别下降到了F18世代时的0.20和1.64,F18世代中有8个基因座上的等位基因已经被固定,说明F18世代中有80%左右个体的基因型已经纯合。但另外一些基因座则表现出明显的异常,例如Sw874和Sw936,这些基因座上的H随近交代数的增高而呈现不规律的波动,并处于高度杂合状态。这些永不纯合的基因座可能与维持WZSP近交系的特异种质特性有关,我们且称之为WZSP近交系的“生命基因”,这一推论需要在今后利用基因敲除等方法进一步加以验证。3讨论3.1品种筛选、h、pic和n大量研究证明,我国4个著名的小型地方猪种:海南五指山猪、滇南小耳猪、贵州小型香猪和巴马香猪均具有遗传多样性的特点。王昕等利用10个微卫星基因座对这4个品种的原种群(分别为60、59、60和46头)进行了遗传学检测,发现其H为0.5990~0.7165,PIC为0.5774~0.6871,N为3.1265~3.8811,其中仅有1个基因座(S0003)在这4个品种中均表现单态;张桂香等采用26个微卫星基因座对香猪、滇南小耳猪和五指山猪(各60头)的遗传多样性分析得出,它们的H为0.78~0.86,PIC为0.76~0.84,N为13.15~15.73,Ne为6.50~8.89。申学林和姚绍宽等又对剑白香猪和久仰香猪、从江香猪和环江香猪等4个香猪地方类群(各50头)的23个微卫星基因座的遗传变异进行了测定,发现所有23个基因座均表现多态,但这4个香猪类群的H、PIC和N分别为0.67~0.70、0.61~0.64和4.69~4.86,均低于张桂香等的结果。主要是由于这4个香猪类群基本均处于相对封闭的半放牧式繁育状态,其中存在一定程度的近交,而张桂香等所分析的3个小型猪种的样品均采自群体规模较大的保种场,而且在保种过程中避免近交。同样Fang等利用34个微卫星基因座对云南滇南小耳猪、贵州香猪及海南五指山猪(各30头)开展了研究,发现这3个品种的H和Ne分别为0.66和2.94、0.67和3.03及0.75和4.00;王希龙等利用32个微卫星DNA标记对海南省五指山猪国家级原种场的保种核心群进行了评价,发现全部32个基因座均表现多态,其H、PIC和N分别为0.558、0.708和9.410;侯冠彧等应用26个微卫星基因座对中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所保种场的五指山小群体(58头)进行了检测,全部基因座均表现多态,观察及期望H、PIC和N分别为0.338、0.835、0.807和11.92。表明我国小型猪原始品种遗传基因丰富、均具有多样性,与本研究中WZSP近交系所测定的结果有较大的差异。3.2广西麻黄小型猪的遗传稳定性封闭或近交培育可使小型猪遗传稳定,但同时造成其基因遗传多样性降低。商海涛等利用35个微卫星基因座对经10余年封闭或近交培育而建立的贵州小型香猪、广西巴马小型猪和版纳小耳猪的近交群体做了测定,其中版纳小耳猪近交系已培育至14世代,分化为体形大小不同的2个亚系;4个群体的样本数量分别为12、12、10和26头,其中2个亚系的样本来源于10至14世代的混合个体,其H为0.3282~0.4027,PIC为0.3456~0.4253,其中仅有1个基因座纯合。牛荣等指出采用与上述研究相同数量的微卫星基因座和相同样本来源,贵州小型香猪和广西巴马小型猪的样本数量均升至14头,其平均H和PIC与前一研究完全相同,而其N及Ne分别降为2.1714、1.9429和1.8026、1.6845。叶香尘采用21个微卫星基因座对广西巴马小型猪近交群体3至7世代的41个个体的基因型进行了测定,发现其中有4个基因座纯合,其总群体的观察及期望H、PIC、N和Ne分别为0.2904及0.3434、0.3048、2.381和1.7683,而且这些参数随近交代数的递增而逐渐降低,与本研究取得的结果一致。本研究总群体的H为0.42,极显著地低于在海南省原地保种、建群的3世代五指山猪近交群体和近交到10至14世代的版纳小耳猪近交家系总群体的杂合度;而18世代的H已降至0.20,即大约80%的个体已经拥有趋于纯合的基因组,这也显著地高于近交至7世代时的广西巴马小型猪近交群体(0.2768)、近交到10至14世代时的版纳小耳猪最好水平的一个近交家系(仅有4份样本的805家系为0.2315)和未知培育程度的贵州小型香猪(0.4027)和广西巴马小型猪(0.3454)的近交群体。本研究总群体的PIC为0.37,与未知培育程度的贵州小型香猪和广西巴马小型猪近交群体接近,极显著地低于3世代时的五指山猪近交群体,但却显著地高于仅有4份样本的版纳小耳猪的805家系(0.1827)和近交至3世代时的广西巴马小型猪近交群体(0.2778)。应该指出的是,H和PIC2个参数的变化范围为0到1,对基因座上等位基因数目的增减很不敏感,而微卫星遗传标记的最重要特征之一就是其丰富的多态性,当然N的变化与样本数量又有直接关系。本研究总群体的N为2.71个,到18世代时已降至1.64个,这极显著地低于3世代时的五指山猪近交群体,也均低于近交至7世代时的广西巴马小型猪近交群体(1.9048)和未知培育程度的贵州小型香猪(2.1714)和广西巴马小型猪(1.9429)的近交群体。此研究结果已被张青峰等采用9个微卫星基因座对本研究所涉及的WZSP3个近交家系14至16世代共50个个体的遗传变异初步分析所证实。因此,可以肯定得出,繁育至18世代WZSP近交家系的遗传同质性已经达到了相当高的水平。3.3家系iii的基因座从WZSP3个近交家系的H和N以及等位基因构成上的差异来看,它们已经逐渐向着特有的方向分化。例如家系I的H为0.41,其中H最小的基因座为S0070(0.37),最大的基因座为Sw205(0.68);家系II的H为0.45,其中H最小基因座为Sw2(0.19),最大的基因座为Sw936(0.79);家系III的H为0.42,其中杂合度最小的基因座仍为Sw2(0.27),最大的基因座则为Sw205(0.69)。另外,各基因座上的N在3个家系之间也表现一定的差异。这一现象也存在于近交到10至14世代的版纳小耳猪2个亚系的5个近交家系和近交至3世代的五指山猪的4个群体,这应该解释为在近交过程中各家系或群体中仅使用了极少数基因型不同的种猪,从而导致了显著的遗传漂变。3.4作/2年生中国基因座基因座牛荣和叶香尘等观察到,WZSP各近交家系的杂合度也随着世代数增高而逐渐减小