第六章 蛋白质工程

第六章蛋白质工程学习目的初步了解蛋白质结构，以及蛋白质分子设计和蛋白质修饰和表达等的基本原理。了解如何利用蛋白质工程技术和其他相关技术获得更加符合人类需求且比天然蛋白质更优良的蛋白质。一、蛋白质结构基础1、蛋白质结构的基本构件

蛋白质、核酸、多糖和脂类等生物大分子的结构与功能。（1）蛋白质的化学组成基本元素:

有机元素:碳、氢、氧和氮无机元素:碱金属、碱土金属和重金属

蛋白质:

基本结构单元是氨基酸氨基酸分类:

非极性R基氨基酸

不带电荷的极性R基氨基酸带正电荷的R基氨基酸带负电荷的R基酸性氨基酸

（2）氨基酸的物理性质

无色结晶特殊晶型溶点极高两性离子形式存在氨基和羧基接受质子和释放质子

两性电解质

（3）蛋白质的一级结构各种氨基酸的简写符号名称三字母符号单字母符号名称三字母符号单字母符号丙氨酸AlaA异亮氨酸IleI精氨酸ArgR亮氨酸LeuL天冬酰胺AsnN赖氨酸LysK天冬氨酸AspD蛋氨酸MetMAsn或AspAsxB苯丙氨酸PheF半胱氨酸CysC脯氨酸ProP谷氨酰胺GlnQ丝氨酸SerS谷氨酸GluE苏氨酸ThrTGln或GluGlxZ色氨酸TrpW甘氨酸GlyG酪氨酸TyrY组氨酸HisH缬氨酸ValV多肽链

:由许多氨基酸按一定的排列顺序通过肽键相连而成。酰胺键

:一个氨基酸的氨基与另一氨基酸的羧基缩合失去一分子水。

肽键结构

XYZ人ThrThrIle猪AlaThrIle牛AlaAlaVal图6-2猪、牛和人的胰岛素的一级结构2、蛋白质的高级结构分子结构:一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。分子构象:空间结构、高级结构、立体结构、三维结构。二级结构

:指多肽链主链骨架中的若干肽段，各自沿着某个轴盘旋或折叠，并以氢键维系，从而形成有规则的构象。

α螺旋、β折叠和β转角α螺旋结构

β折叠结构

三级结构:在三维空间中沿着多方向进行卷曲、折叠、盘绕而成的近似球形的结构。蛋白质构象作用力:R基之间的氢键非极性R基之间的疏水基相互作用α螺旋和β折叠中的肽链内或肽链间的氢键带正负电荷的R基之间的离子键亚基(三级结构)

一条多肽链组成。

数条多肽链组成，这些多肽链通常以二硫键相连接成为亚基。

四级结构亚基聚合而成亚基之间非共价键结合均一四级结构非均一四级结构

维持四级结构的主要力:

疏水键、氢键、离子键和范德华引力

常见的聚合体:

二聚体、三聚体、四聚体、五聚体，最多可聚合成六十聚体

3、蛋白质分子之间的相互作用

钼铁蛋白和铁蛋白相互作用示意图(引自Schlessmanetal.)铁蛋白钼铁蛋白4、蛋白质结构与功能的关系蛋白质必须具备特定的结构，才能表现特定的功能，在蛋白质肽链中有一些基团对特定功能而言是必需基团，另一些是非必需基团。在体内，蛋白质分子是如何利用它的特定结构执行特定的生物功能的。

同源蛋白质指在不同的有机体中实现同一功能的蛋白质，但这些同源蛋白质中的氨基酸序列存在着种属的差异性。

结构域

多肽链之间以共价键方式连接功能区域

铁蛋白的分子结构是由铁核和蛋白质壳组成的。

铁蛋白的隧道可分为电子隧道和物质交换隧道，前者起着传递电子的作用，后者起着物质交换的通道作用。

铁蛋白蛋白质壳通过柔性调节产生电子传递现象。

铁蛋白分子结构图A：蛋白质壳；B：铁核；C：三相物质交换隧道Aproteaseinhibitor-proteasecomplexinhibitor

丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpins)抑制蛋白酶活性的途径与机理

模拟核小体分子

二、蛋白质工程的研究方法1、蛋白质工程的研究策略

蛋白质工程的基本途径：从预期功能出发，设计期望的结构，合成目的基因且有效克隆表达或通过诱变、定向修饰和改造等一系列工序，合成新型优良蛋白质。

蛋白质工程的主要研究手段:利用所谓的反向生物学技术，其基本思路是按期望的结构寻找最适合的氨基酸序列，通过计算机设计，进而模拟特定的氨基酸序列在细胞内或在体内环境中进行多肽折叠而成三维结构的全过程，并预测蛋白质的空间结构和表达出生物学功能的可能及其高低程度。

2、蛋白质的全新设计（1）设计目标的选择蛋白质全新设计功能设计、结构设计。研究重点和难点从结构设计出发，从蛋白质的二级结构开始，以摸索蛋白质结构的稳定性。（2）蛋白质设计技术与方法

常用的蛋白质设计思路

是否存在蛋白质多聚体状态；二级结构与预期目标是否吻合。

是否具有预定的三级结构。圆二色谱和核磁共振技术可用于研究蛋白质。

是否以单分子或多聚体形式存在。三级结构测定目前主要依靠荧光和核磁共振技术。体积排阻色谱法也可以用于判断分子体积大小、聚合体数目和蛋白质结构是处于无规则状态或三级结构等生化参数。

天然的锌指多肽FSD-1多肽(从头设计)（3）改变现有蛋白质的结构分离纯化目标蛋白质。

分析目标蛋白质的一级结构；分析目标蛋白质的三维结构以及结构与功能的关系。

根据蛋白质的一级结构设计引物，克隆目的基因。

根据蛋白质的三维结构和结构与功能的关系以及蛋白质改造的目的设计改造方案。

对目的基因进行人工定点突变。

改造后的基因在宿主细胞中表