质粒DNA的小量快速提取

质粒DNA的小量快速提取第五次实验质粒DNA的小量快速提取制备目的：为了证实所得的转化子的重组质粒DNA是否确实由载体质粒与目的基因组成，已排除其它可能方式的连接。常用鉴定方法：小规模制备质粒DNA进行限制酶切分析；

互补；插入失活；杂交筛选。正常重组DNA：经酶切电泳，可获得5.4kb的载体和1.1kb的目的基因。错误基因插入：不能酶切或片段大小不同。反向连接（出现在平端连接）：不被酶切或片段大小不同。载体自我环化：没有小片段。一、基因工程简介概念：应用酶学的方法,在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA)与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子(复制子replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子。也称基因克隆或重组DNA

(recombinantDNA)

过程

特点1.连续性2.微量操作3.防止污染

化学试剂外源DNA生物公害载体包括质粒、病毒、噬菌体等。质粒的特点细菌细胞染色体外的共价的闭合的环状的dsDNA分子，能自主的自我复制并表达，并能稳定的遗传给子代。二、碱变性法的原理主要利用变性和复性的差异分离染色体DNA和质粒DNA分子染色体DNA质粒DNApH12.6完全变性不完全变性双链完全解开双链局部解开pH4.8不能复性复性NaAc高盐缠连网络结构溶解沉淀其他杂质的去除细菌细胞破坏后，细胞内容物释放出来，除了DNA外，还有RNA、蛋白质、细胞器碎片、可溶性杂质如糖、有机酸碱及盐分等。这些都必须通过相应的技术手段去除。碱变性中所用的NaOH-SDS溶液还可沉淀大分子RNA及部分蛋白质。酚、氯仿可去除蛋白质。无水乙醇、异丙醇可沉淀核酸，去除可溶性杂质。两者的区别？RNase可降解RNA。操作步骤：见P100关键词EP管、EP离心机、微量移液器（加样枪）、Tip头（枪头）、震荡器等溶液1溶液2溶液3-20,10min12000rpm,10min质粒DNA的酶切一、原理限制性核酸内切酶定义：识别dsDNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统,限制外源DNA,保护自身DNA。分类：Ⅰ、Ⅱ(重组DNA技术中常用)、ⅢⅡ类酶作用特点能在特殊位点识别和切断dsDNA，识别序列4-6bp，具有回文结构（180度旋转对称结构）HindⅢ

产生5‘粘性末端AAGCTTTTCGAASstⅠGAGCTCCTCGAG产生3’粘性末端GTCCAGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口酶的命名以酶所来源的微生物的学名进行命名。第一个大写字母是来源菌的种名的第一个字母；接着的两个小写字母，是属名的头两个字母；第四个字母或数字代表株系；最后的罗马数字代表在同一菌株中发现的酶的编号（通常按发现的先后顺序）如在Haemophilusinfluenzaed株中发现的第三种限制酶（Ⅲ），被称作HindⅢ。酶活性单位指在限定条件下（温度、Buffer），1hr消化1ugDNA的酶量称为一个酶单位（unit）。实际工作中，为保证消化完全，1ugDNA的消化需要3-5个单位的酶，反应时间也要适度延长，通常是反应过夜。酶切反应系统的设计酶通常保存在50%的甘油中（？），使用时甘油浓度必须小于5%，故酶至少稀释10倍。实际酶的用量应是理论用量的3-5倍。Buffer通常是10×，使用时稀释10倍。总反应体积20-50ul，不足用d3H2O补足。注意加样顺序。混匀反应物。二、操作步骤：见P101-102可在酶解系统中同时加入RNase进行RNA降解。注意控制反应的条件。酶切体系的设计质粒DNA10ul（10ug)HindIII(20U/ul)2ul10x缓冲液

2ul三蒸水6ul_____________________________________总体积

20ulDNA片段的琼脂糖凝胶电泳一、原理分离原理：电荷效应、分子筛效应显色原理：溴化乙锭（EB）