藤茶提取物藤茶总黄酮、二氢杨梅素及杨梅素抗凝血及溶栓作用研究

藤茶提取物藤茶总黄酮、二氢杨梅素及杨梅素抗凝血及溶栓作用研究

多羟基黄酮酸是植物中最常见的黄酮酸。二羟杨梅和杨树脂是多羟基黄酮酸。二氢杨梅素(3,5,7,3’,4’,5’-六羟基2,3-双氢黄酮醇,dihydromyricetin,DMY)广泛存在于葡萄科植物中,在蛇葡萄属植物中含量尤其丰富。杨梅素(3,5,7,3’,4’,5’-六羟基黄酮醇,myricetin,Myr)异名杨梅树皮素、杨梅黄酮、杨梅酮,属黄酮醇类化合物,存在于壳豆科、豆科、报春花科、葡萄科、菊科等植物中。研究发现,DMY具有明显的抗血栓作用。以Myr为主药制成的Myr分散片具有明显的抗凝血效果。Myr可抑制血小板活化因子(PAF)介导的兔血小板聚集、5-羟色氨(5-HT)释放及血小板内钙离子浓度升高,从而起到保护心血管的作用,且其抗PAF作用比红花的有效成分羟基红花黄色素A作用强。DMY和Myr均为藤茶的有效活性成分,且DMY单体含量高达30.60%。药理研究表明,藤茶总黄酮具有抗血栓作用。为探讨DMY和Myr是否为藤茶总黄酮抗血栓作用的主要活性物质,本研究采用毛细玻管法和静脉血栓模型,观察并比较藤茶TF、DMY及Myr的抗凝血及溶栓作用。1材料和方法1.1超声溶解液的制备藤茶总黄酮(TF)、二氢杨梅素(DMY)及杨梅素(Myr),均为自制,含量分别为74%,90%,83%,以1%DMSO超声溶解成适宜浓度备用;川芎嗪,美国Sigma公司,批号:1000783180;肝素钠,国药集团化学试剂有限公司,批号:63007131。1.2大鼠、大鼠、大鼠、红大鼠昆明种小鼠,SPF级,体质量18~22g;SD大鼠,SPF级,体质量180~250g,均由桂林医学院动物中心提供,许可证号:SCXK桂2007-0001。1.3方法1.3.1tf、tabler和dmy对小鼠内中小型血柱的影响将80只小鼠随机分为正常对照组,阳性药对照组,TF、Myr及DMY高(2.0mg·kg-1)、低剂量组(0.5mg·kg-1),共8组,每组10只,按每公斤体质量腹腔注射给药10mL。正常对照组注射生理盐水,阳性药对照组注射肝素钠,TF、Myr和DMY组分别注射不同剂量的TF、Myr和DMY。给药20min后,用内径为1mm的毛细管插入小鼠内眦静脉,至毛细管血柱达到约5cm时取出,平放于桌上。每隔30s折断约5mm,缓慢拉开,观察有无血凝丝出现,从毛细管采血到出现血凝丝的时间为凝血时间。1.3.2尾静脉血栓形成将80只大鼠随机分成8组,分别为正常对照组、阳性药对照组、TF,Myr及DMY高(2.0mg·kg-1)、低剂量组(0.5mg·kg-1)。参照文献制备大鼠静脉血栓模型,按1.5g·kg-1乌拉坦溶液腹腔注射麻醉大鼠,仰卧位固定,做腹部手术以分离下腔静脉,于左肾静脉与下腔静脉交叉处结扎下腔静脉,然后缝合腹壁。结扎前10min正常对照组尾静脉注射0.9%磷酸盐缓冲液,阳性对照组尾静脉注射川芎嗪,TF、Myr及DMY组分别尾静脉注射不同剂量的TF、Myr及DMY,注射容积均为1mL。下腔静脉结扎4h后,重新打开腹腔,在结扎下方2cm处夹闭血管,剪开管腔,取出栓子,用滤纸吸去残余血液后用微量电子天平称湿重,再将栓子放在烘箱中,70℃,2h后称干重,按下式计算血栓形成抑制率。血栓形成抑制率(%)=(模型组血栓重量-给药组血栓重量)/模型组血栓重量×100%。1.4实验结果总样本t采用SPSS17.0统计软件,所有实验数据进行K-S检验,均符合正态分布。实验结果以均数±标准差表示,组间差异用独立样本t检验(方差不齐时采用t检验校正公式)。P<0.05为有统计学意义。2结果2.1tf、dmy及tabler对小鼠凝血时间的影响见表1。与正常对照组比较,肝素组能显著延长小鼠凝血时间(P<0.01);TF、DMY及Myr高剂量均能明显延长小鼠凝血时间(P<0.05,P<0.01);TF、DMY及Myr低剂量组虽有延长小鼠凝血时间的趋势,但与正常对照组比较,差异无统计学意义。2.2两组血栓湿重、干重的比较见表2。阳性对照川芎嗪组、Myr及DMY各剂量组的血栓干重均明显低于正常对照组(P<0.01,P<0.05),Myr高剂量组和川芎嗪组的血栓湿重也低于正常对照组(P<0.01,P<0.05),TF组的血栓湿重、干重与正常对照组比较,差异均无统计学意义。结果提示,TF低剂量组、TF高剂量组、DMY高剂量组、Myr低剂量组、DMY低剂量组、川芎嗪组、Myr高剂量组抗血栓作用依次增强。3藤茶提取物对血栓形成的影响血栓形成是许多心脑血管疾病的主要发病原因,如能有效地控制血栓的形成,对防治缺血性心脑血管疾病有着深远的意义。钟正贤等研究发现,藤茶总黄酮能明显抑制大鼠体外血小板聚集和体内血栓形成。藤茶黄酮类化合物包括Myr、DMY、福建茶素、杨梅黄素、杨梅苷等,其中DMY含量较高。潘照斌等采用大鼠静脉血栓模型、颈总动脉-颈外静脉血流旁路法及小鼠静脉注射胶原蛋白-肾上腺素血栓模型研究DMY的抗血栓作用,结果发现,DMY能明显减轻静脉血栓湿重和干重,抑制大鼠颈总动脉-颈外静脉血流旁路血栓形成,提高胶原蛋白-肾上腺素诱导小鼠瘫痪的恢复率。覃洁萍报道,从广西藤茶中提取得到的Myr为主要原料研制而成的Myr分散片对大鼠实验性脑缺血具有明显保护作用,并有明显抗血栓形成作用,机制可能与其抑制脂质过氧化物损害及提高抗氧化酶活性、改善凝血状态、抑制血小板依赖性血栓的形成有关。为进一步明确藤茶不同提取物藤茶总黄酮、DMY和Myr的抗血栓活性,本文采用毛细玻璃管法、腔静脉结扎大鼠血栓模型,分别检测小鼠的凝血时间和血栓湿重和干重,研究藤茶不同提取物的溶拴作用。结果发现,阳性药川芎嗪、Myr和DMY各剂量组的血栓干重均明显低于正常对照组(P<0.01,P<0.05),2mg·kg-1Myr高剂量及川芎嗪组的血栓湿重明显低于正常对照组(P<0.01,P<0.05),但是,TF各剂量组的血栓湿重、干重与正常对照组比较,差异均无统计学意义。Myr高剂量组对血栓的抑制率最明显,其次是川芎嗪组,DMY低剂量组次之,Myr低剂量组、DMY高剂量组、TF高剂量组则作用依次减弱,TF低剂量组对血栓的抑制率作用最弱。Myr对血栓的抑制作用有一定的