聚酰胺柱色谱分离黄酮醇与二氢黄酮醇类化合物

聚酰胺柱色谱分离黄酮醇与二氢黄酮醇类化合物

黄酮类化合物广泛存在于植物中，具有各种生物学活性，如抗心力衰竭、抗自由基、抗心力衰竭、肝脏保护、抗炎抗剂等。黄酮类化合物由于其结构的相似性,分离与提纯较困难。本研究主要为分离黄酮醇和二氢黄酮醇提供较稳定的、简便的提纯方法。1材料和方法1.1仪器、试剂和仪器UV-2501型紫外光谱仪(日本岛津);IRPRESTIGE-21傅里叶变换红外光谱仪(日本岛津);52旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);YXYQ型循环水多用真空泵(山东城华鲁电热仪器有限公司);WFH-203三用紫外分析仪(上海精科实业有限公司);X-4数字显示显微熔点测定仪(北京泰克仪器有限公司)。聚酰胺薄膜(浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂);薄层聚酰胺(200～400目)(浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂);95%乙醇(哈尔滨市新达化工厂)。1.2实验方法1.2.1样本来源藤茶(购于哈尔滨市药材公司);槲皮素与二氢槲皮素混合物(二氢槲皮素含量88%)由黑龙江省宏科生物技术科技有限公司提供。1.2.2化合物的合成藤茶用8倍量水煎煮,提取液浓缩,静置过夜,有大量结晶析出,滤取结晶,用水洗涤2次。结晶用乙醇-乙醚(1∶2)混合溶液溶解,与聚酰胺拌样,待溶剂完全挥干后,加到预处理过的聚酰胺柱。依次用水、20%、30%、40%、50%、70%及95%乙醇梯度洗脱。按保留体积收集各馏分,减压浓缩后经聚酰胺薄层色谱检测(展开剂:氯仿-甲醇-甲酸=50∶48∶2),合并Rf值相同馏分。将20%～30%乙醇洗脱部分减压浓缩,浓缩液置冰箱冷却过夜,析出白色针状晶体(化合物Ⅰ)。聚酰胺薄层色谱(展开剂:氯仿-甲醇-甲酸=50∶48∶2)检测为单一斑点,Rf值与二氢杨梅素标准品一致,其紫外、红外特征吸收及熔点均与文献报道一致,确定化合物Ⅰ为二氢杨梅素。将40%～50%乙醇洗脱部分减压浓缩,放置数天后,有大量黄色针晶体析出(化合物Ⅱ)。滤取结晶,并用水洗涤多次,聚酰胺薄层色谱(展开剂:氯仿-甲醇-甲酸=50∶48∶2)检测为单一斑点,Rf值与杨梅素标准品一致,其紫外、红外特征吸收及熔点均与文献报道一致,确定化合物Ⅱ为杨梅素。槲皮素与二氢槲皮素混合物同上采用乙醇-乙醚(1∶2)混合溶液溶解,与聚酰胺拌样,经聚酰胺色谱柱,乙醇/水梯度洗脱,得到白色结晶(化合物Ⅲ)与黄色结晶(化合物Ⅳ)。分别与二氢槲皮素和槲皮素标准品进行薄层检测,其紫外、红外特征吸收及熔点均与文献报道一致,故确定化合物Ⅲ与Ⅳ分别为二氢槲皮素和槲皮素。1.2.3对化合物的检测1.2.3.1、紫外检测将化合物Ⅰ～Ⅳ分别溶于甲醇,置紫外光谱仪检测,在200～400nm下进行扫描。1.2.3.2.红外试验将化合物Ⅰ～Ⅳ分别取约2mg,与适量的KBr混合压片,置于红外吸收池,在400～4000cm-1下进行扫描。1.2.3.3.冷却测试将干燥的化合物Ⅰ～Ⅳ,分别制片,置于数字显示显微熔点测定仪下,逐渐升温,并进行观察晶形的变化,记录熔程。2axenm,uvmehsmaxmehs-1,mehs-1,cm-1,3,5,4-三烷基-5,5,4-亚甲基-5,4-氢-1,3,4-吡啶二氢-3,5,5,5,4-镁粉标准品,5,4,5,4-吡啶二氢-1,3,5,4-亚,7,4-镁粉标准,5,4-氢,5,4-异亚,7,5,4-氢,5,4-异亚,7,5,4-氢化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的紫外与红外特征吸收图谱如图1,2。化合物Ⅰ:白色结晶,mp.239～241℃,盐酸-镁粉阳性。IR(KBr,cm-1):3300～3650,1640,1595,1500,1465。UVλMeOHmaxmaxΜeΟΗnm:291.5,328(sh.)。化合物Ⅱ:黄色结晶,mp.256～258℃,盐酸-镁粉阳性。IR(KBr,cm-1):3200～3650,1647,1612,1550,1506。UVλMeOHmaxmaxΜeΟΗnm:376.5nm,254nm。化合物Ⅲ:白色结晶,mp.210～212℃,盐酸-镁粉阳性。IR(KBr,cm-1:3200～3550,1632,1472,1356,1288,1160。UVλMeOHmaxmaxΜeΟΗnm:288,320(sh.)。化合物Ⅳ:黄色结晶,mp.310～313℃,盐酸-镁粉阳性。IR(KBr,cm-1):3400,1663,1608,1522,1500。UVλMeOHmaxmaxΜeΟΗnm:255,373。3不同富里尼亚胺的色谱行为聚酰胺吸附属于氢键吸附,特别适合分离黄酮类化合物。黄酮类化合物分子中酚羟基的数目及位置影响其与聚酰胺形成氢键缔合的能力,因此它们在聚酰胺上的色谱行为不同,从而得到分离。杨梅素与二氢杨梅素酚羟基数目相同,区别仅在2,3位饱和度不同,它们在聚酰胺上的色谱行为差别较小。如果采用聚酰胺柱色谱用填料进行分离时,很难得到纯品。后选用聚酰胺薄层填料进行柱色谱,其粒度较小,因此柱效较高,可得到纯品。但由于填料粒度较小,流速将不断减慢,后期需加压操作。聚酰胺对芳香化程度高的化合物吸附性强,因此杨梅素较二氢杨梅素后出柱。槲皮素与二氢槲皮素同样酚羟基数目相同,区别仅在2,3位饱和度不同,采用与杨梅素和二氢杨梅素相