藤茶黄酮的提取分离与分离纯化

藤茶黄酮的提取分离与分离纯化

藤蔓茶的学名是草莓属的一种四维线植物。它主要分布在我国湖南、湖北、云南、贵州、广东、广东和福建。它是湖南、湖北和其他省份的人工品种。藤本植物是一种用于医疗和食品的两类植物。它最初被用作石油和天然气的药物。十多年来，中国对藤茶植物资源的开发利用主要是初步加工产品。也就是说，在春天和夏天收集植株上的幼茎和叶子，并按照茶叶加工工艺加工成具有泡沫的“藤茶”。由于其外观和冲饮的感觉，“白猴”、“甘露醇”、“茂岩霉茶”、“野生藤茶”和“龙须茶”等茶产品。随着人类对植物活性成分和功能食品的深入研究，我国对藤茶资源的深度开发和开发主要集中在其主要成分和生物活性上。特别是对藤茶中含量丰富、二羟杨梅素含量高的黄酮类成分的提取、分离及其定量方法的深入研究与藤茶资源的深度开发利用密切相关。在这项工作中，我们重点是对我国藤茶中黄酮类成分的提取、分离和定量方法的探讨。1藤茶中总黄酮的化合物黄酮类化合物是广泛存在于自然界的一大类化合物,属于植物次级代谢产物,其母核结构多为C6-C3-C6的基本骨架,即两个苯环(A环、B环)通过三碳链相互联结而成(如图1所示),母核上常有羟基、甲氧基、甲基等取代基,据取代基和C环氧化程度可将黄酮类化合物分为黄酮与黄酮醇、二氢黄酮与二氢黄酮醇、异黄酮和二氢异黄酮等类型.自然界的黄酮类化合物多以甙类形式存在,通常将甙类的黄酮部分称为甙(或苷)元,与甙元相连接的部分称配基,多为各种单糖或低聚糖.现有研究资料显示,藤茶中总黄酮含量高达45%左右(干重),但因原材料来源和提取分离、测定方法等不同,相关文献中报道的藤茶黄酮含量存在较大的差异.藤茶黄酮的两种主要成分为二氢杨梅树皮素(DMY,dihydromyricetin,C15H12O6)和杨梅树皮素(MY,myricetin,C15H10O6),简称二氢杨梅素和杨梅素(如图2所示),二者均属于黄酮醇类,其中,二氢杨梅素又被称为蛇葡萄素或福建茶素(ampelopsin).此外,藤茶中还含有藤茶甙(grossedentataside,4′-羟基-3′-甲氧基异黄烷-7-0-α-L-鼠李糖(1→6)-β-D-葡萄糖甙)、藤茶素(grossedentstasin,4′-羟基-3′-甲氧基异黄烷-7-0-α-L-吡喃鼠李糖甙)、芦丁、杨梅甙(杨梅素-鼠李糖甙)、槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖甙等黄酮及黄酮甙类化合物.2藤茶中相关二氢杨素的提取植物黄酮类化合物的提取,以溶剂浸提法为主.(1)广泛采用有机溶剂提取,如甲醇、乙醇、丙酮等作溶剂,其中以乙醇提取为主,有冷浸或热回流法;(2)热水提取;(3)碱液提取;(4)系统溶剂提取;(5)超临界流体萃取等.在溶剂浸提的基础上,辅以超声波、微波手段,以强化提取效果.藤茶中的两种主要黄酮成分均属多羟基黄酮醇类化合物,具极性,易溶于热水、乙醇等,迄今为止,对藤茶黄酮,尤其是二氢杨梅素的提取,以热水提取、乙醇回流提取为主,以超声波或微波加以辅助.周天达和何桂霞等将藤茶粗粉末以石油醚脱去脂溶性色素,再用95%乙醇回流提取,收集乙醇提取液,经浓缩除醇、分离纯化,得到二氢杨梅素和杨梅素.袁阿兴等将显齿蛇葡萄地上部分粉碎成粗粉,热水煎煮3次,2h/次,趁热过滤,冷却、沉淀,收集沉淀部分,再经分离纯化得到双氢黄酮类.覃洁萍等先用工业酒精对藤茶进行回流提取,对醇提液脱醇后,再用石油醚萃取,下层液静置、分步结晶,分别得到杨梅素和二氢杨梅素;后改用水煎煮藤茶,趁热收集滤液,经浓缩结晶得到粗品黄酮,再分别以丙酮和乙醇对粗品进行提取、分离和加水重结晶得到二氢杨梅素和杨梅素.王岩等专门研究了乙醇回流提取藤茶黄酮的乙醇浓度、用量、提取时间和次数,确定以80%乙醇、1∶10的料液比、加热回流提取2次、60min/次为最佳提取工艺条件.基于二氢杨梅素在热水和冷水中溶解度的显著差别,以水作为提取剂,逆流提取法成为一种改进的环保、节能节水的二氢杨梅素水提取法,采用三级逆流、30min/级、1∶10的料液比、提取温度100℃,辅以弱碱性(pH8-9)条件,提取效果优于3次单级提取的效果.较为先进的提取法是微波动态循环阶段连续逆流提取(microwavedynamicmultistagecountercurrentextraction,MDMCE)技术,它结合了微波辅助提取中药有效成分的优势和连续逆流提取的特点,采用先进的具精密控温、控制加热功率和时间的MARS5微波装置(美国),对藤茶中的二氢杨梅素进行微波动态循环连续逆流提取,效果优于微波静态间歇提取(microwavestaticbatchextraction,MSBE).3氢杨树素的分离纯化对藤茶黄酮的初步分离主要用结晶法.由于藤茶黄酮的冷水不溶性,无论采用热水煎煮所获的水提取液,还是乙醇回流提取、脱醇后的水溶液,均可在加热溶解和充分过滤后,将滤液浓缩、放置冷却析出结晶(黄色),分离得到藤茶黄酮粗品.进一步的纯化分离可用重结晶、柱层析法.初步分离得到的黄酮粗品可用水反复重结晶得白色针晶,或直接将粗品上硅胶层析柱,用甲苯-乙酸乙酯-甲醇(10∶8∶5)洗脱,硅胶薄层层析检查,合并相同组分处理后,得到白色针状结晶,鉴定为二氢杨梅素(3′,4′,5′,3,5,7-六羟基-2,3-双氢黄酮醇,dihydromyricetin);将粗品重结晶的母液合并、浓缩至干得黄色沉淀物,用少许甲醇溶解并加硅胶拌样,水浴蒸干后再上硅胶层析柱中以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10∶8∶5)洗脱,硅胶薄板层析检查,合并相同组分处理后得黄色针晶,鉴定为杨梅素(即3,5,7,3′,4′,5′-六羟基黄酮醇,myricetin).根据两种主要黄酮成分在丙酮中的溶解性差异,可对藤茶黄酮粗品进行纯化分离.将适量黄酮粗品加丙酮回流提取5～10min,重复1次,分别收集丙酮提取液和不溶性残渣;对提取液浓缩除丙酮后,加水放置析出大量白色结晶,过滤,重复一次,得白色细针晶或粉末状结晶,即为二氢杨梅素;对不溶性残渣加适量乙醇-水(1∶1)回流提取20min,趁热过滤,滤液经浓缩、放置,逐步析出棕黄色簇状或小颗粒状结晶,即为杨梅素.还可对黄酮粗品用乙醇、氯仿-乙醇反复重结晶,得白色结晶(二氢杨梅素).也可对黄酮粗提除醇后的水溶液采用分段放置结晶、分段收集,达到分离纯化两种黄酮的目的,放置后先析出黄色菊花状结晶,分离结晶(I),再对液相进一步浓缩后再放置,析出粉末状结晶(Ⅱ);对结晶(I)加丙酮重结晶一次,再用甲醇二次重结晶,得黄色簇状小针晶(杨梅素),对结晶(Ⅱ)用乙醇一水加活性炭重复重结晶,得白色细针状结晶(二氢杨梅素).此外,可对乙醇回流提取、除醇、浓缩后的黄酮粗提液(或浸膏),经适当处理,再用乙酸乙酯或乙醚提取,获得相应的乙酸乙酯浸膏或乙醚浸膏;乙醚浸膏上100～200目聚酰胺层析柱,以乙醇-水溶剂系统梯度洗脱,洗脱液再经sephadexLH-20柱层析纯化,得到杨梅素与杨梅甙;乙酸乙酯浸膏经聚酰胺柱层析,可分离纯化出二氢杨梅素(蛇葡萄素).“增温溶解,保温过柱,温水洗脱”为纯化、制备二氢杨梅素的新方法.利用D16树脂吸附杂质的能力大于吸附二氢杨梅素的能力的特点,将二氢杨梅素粗提液上D16树脂柱,溶解和洗脱水温度以60℃较好,适宜的上样量与过柱速度、适宜的水解吸速度,收集洗脱液后,再利用二氢杨梅素易溶于热水难溶于冷水的特性进行重结晶,加活性炭处理,纯度可达到96.3%.藤茶中两种主要黄酮成分的基本性质.二氢杨梅素:白色针状结晶,mp:245～246℃.易溶于热水、热乙醇、丙酮,溶于甲醇、乙醇,微溶于水、醋酸乙酯,难溶于氯仿、石油醚.杨梅素:黄色结晶,mp:324～326℃,溶于甲醇、乙醇、热水,微溶于水,难溶于氯仿、丙酮、石油醚.4藤茶中二氢杨素和杨树莓原素含量的检测对藤茶黄酮的定量方法主要有光谱法和色谱法.光谱法有:荧光光度法、紫外光度法、A1Cl3显色法、差示分光光度法等.色谱法则主要采用硅胶薄板层析、HPLC等.朱炯波等根据黄酮类化合物本身具有荧光的性质,研究了荧光分析法直接测定显齿蛇葡萄中总黄酮含量的条件.以芦丁为标样,激发及发射波长分别为424nm和530nm,以pH2的95%乙醇作溶剂,2～4h内稳定,检出限为2.07×10-9mol·L-1,样品测定重现性较好.魏捷以蛇葡葡萄素为标样,用95%乙醇为溶剂,直接于292nm处测定紫外吸光度并计算样品中蛇葡萄素含量.何桂霞等以二氢杨梅素为对照品,用A1Cl3显色法(最大吸收波长314nm)和硅胶薄层扫描法分别测定藤茶总黄酮含量和二氢杨梅素含量,结果显示藤茶总黄酮含量为43.4%～44.0%,二氢杨梅素的含量高达37.4%～38.5%.熊皓平等以二氢杨梅素为标样,采用A1Cl3分光光度法,于294nm测定藤茶总黄酮含量,结果表明:标液浓度在5～50μg·mL-1范围内,吸光度与浓度呈良好的线性关系,4h内稳定.陈凤桂等比较了“二氢杨梅素”的紫外吸收光谱和“二氢杨梅素+A1Cl3”显色后的紫外吸收光谱,发现两者在最大吸收波长下的吸光度值差别不大,只是显色导致了红移,而二者吸光值差值较大的波长是375nm,此时吸光度值却很小,而且A1Cl3显色法稳定性较差,从而提出以二氢杨梅素为标样,不显色直接用紫外法于291nm处测定藤茶总黄酮含量更方便、稳定、节省试剂,测得总黄酮提取得率在35～39%.覃洁萍等利用藤茶样品溶液中黄酮类成分与ZrOCl2络合后,在(318±1)nm波长下吸光度值发生显著变化、而其它共存成分(如叶绿素等)不发生吸收性质改变的特点,采用差示分光光度法,通过在(318±1)nm处测定络合前后的吸光度差值,消除背景吸收(共存成分)的干扰,测定藤茶样品中黄酮类成分的含量.何桂霞等采用薄层扫描法测定藤茶中二氢杨梅素和杨梅素的含量,点样于硅胶G-CMC-Na薄层板,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10∶8∶5)为展开剂,层析后,用3%FeCl3乙醇溶液喷雾显色后,覆盖玻璃板并密封四周,二氢杨梅素和杨梅素斑点呈紫色,对薄层色谱图进行扫描测定各斑点的面积积分值,3h内面积值稳定,通过标准曲线计算样品中的含量,结果显示:藤茶中二氢杨梅素和杨梅素的含量分别为38.17%～38.81%和1.72～1.78%.高效液相色谱法(HPLC)是近几年发展起来的测定藤茶及其深加工产品中二氢杨梅素和杨梅素含量的方法,研究者多采用RP-HPLC法.藤茶素片是一种处于研究中的抗氧自由基药物,由藤茶经乙醇提取精制,其主要成分为二氢杨梅素,以二氢杨梅素为对照品,采用AllsphereODS柱(4.6×250mm,5μm),流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液(15∶85),检测波长290nm,流速1.0mL·min-1,柱温30℃,测定藤茶素片中的二氢杨梅素含量,精密度高,稳定性好,二氢杨梅素溶液在0.0744～0.3720mg·mL-1的浓度范围内具有良好的线性关系.对不同采收时期和不同部位的藤茶中二氢杨梅素含量的测定,采用NovapakC18柱(4.6mm×150mm,5μm),甲醇-水-磷酸(27∶73∶0.1)为流动相,流速1.0mL·min-1,紫外检测波长290nm,柱温为25℃,结果表明,二氢杨梅素在4.32～69.12μg·mL-1范围内,峰面积与浓度呈良好的线性关系;测得5月份藤茶叶中二氢杨梅素含量最高,达27.8%～31.2%.田森林和张友胜等分别以二氢杨梅素、杨梅素为标准品,采用Nova-PakC18不锈钢柱(3.9mm×150mm),检测波长分别为294、254nm,流动相为甲醇-水(40∶60和24∶76,用磷酸调pH),流速1.0mL·min-1,进样量10μL,柱温30℃,二者检测限量分别为10、15ng;测得湖南藤茶总黄酮含量大于40%,不同部位的二氢杨梅素含量在11.87%～40.66%之间,杨梅素含量在2%左右,分离效果好,干扰少.覃洁萍等采用ShimpackCLCODS柱(4.6mm×150mm,5μm)分析,流动相为甲醇一水一冰醋酸(50∶50∶1),流速1.0mL·min-1,检测波长275nm,