杂交水稻两优培九抽穗及开花过程中的线粒体结构变化

杂交水稻两优培九抽穗及开花过程中的线粒体结构变化

水稻强和虚弱粒的播种量和丰满度差异很大，达到25%左右。弱势粒约占水稻籽粒的1/3左右(大穗型品种),且随着穗形的增加,弱势粒所占的比例更大。由于弱势粒结实率和充实度较低,极大地限制了水稻高产潜力的发挥。因此,不少学者从植物激素及与籽粒灌浆有关的酶等方面对强、弱势粒进行了一些生理生化特性的研究[2,3,4,5,6,7,8,9,10,11]。揭示了强、弱势粒的结实率和充实度差异的一些生理原因。然而关于强、弱势粒核酸代谢差异的研究尚未见报道,系统进行强、弱势粒胚乳细胞形成及上部一次枝梗和下部二次枝梗维管束结构和生理特性与强、弱势粒的结实率和充实度关系的研究较少。植物体内的功能物质——蛋白质是由脱氧核糖核酸(DNA)转录成核糖核酸(RNA),然后再由RNA翻译而成的。RNA在植物体内不能长期存在,发挥功能后很快被RNA酶降解,RNA含量特别是mRNA含量反映了基因转录活性的高低。因而强、弱势粒RNA含量特别是mRNA含量反映了籽粒(库)活性大小。上部一次枝梗与下部二次枝梗分别是水稻强势粒和弱势粒着生的地方,是营养物质进入籽粒的通道,其维管束发育的好坏直接影响无机物和有机物向籽粒的运输,胚乳细胞的数目和大小反映了籽粒发育的状况。所以探讨强、弱势粒RNA特别是mRNA含量以及上部一次枝梗与下部二次枝梗维管束的结构和生理差异以及强、弱势粒胚乳细胞形成的差异,对于了解强势粒和弱势粒结实率和充实度的差异具有重要意义。1材料和方法1.1各取材粒的剥削对花穗的剥削和保存水稻(Oryzasativa)品种两优培九(培矮64S/9311)。于单穗抽穗当天、第5天、第7天和第12天各取整齐一致的200穗,分别剥取强势粒(上部3个一次枝梗上抽穗当天开花的籽粒,第7天和第12天因其灌浆较多,子房破裂而不取)和弱势粒(下部3个二次枝梗上除去顶粒,抽穗后7d开花的籽粒)的子房,立即投入液氮,置-70℃冰箱保存。1.2neasymini洗脱按Qiagen公司的RNeasyPlantMiniKit的说明书进行。先取100mg样品放入液氮中研磨成匀浆,后加入450μL的胍基硫氢酸缓冲液,并涡旋振荡,使核酸酶变性失活,以得到完整的核酸。把样品液移入QIAshredder旋转柱中,在20℃下18000×g离心2min,上清液中加入225μL的乙醇,提供硅胶膜束缚核酸的条件,把样品加入到含有硅胶膜的RNeasymini旋转柱中,总RNA吸附到硅胶膜上,用缓冲液洗脱各种污染物。最后用无核糖核酸酶的水把总RNA从RNeasymini旋转柱中洗脱下来。用DU-640核酸蛋白分析仪测定其含量和纯度。1.3poli-a与ol空间杂交按Qiagen公司OligtexTMKit说明书进行。在250μL的总RNA样品中加入250μL的OBB缓冲液和15μL的Oligotex悬浮液并混合均匀,在70℃水浴中温育3min,室温下放10min,使mRNA的Poly-A与Oligotex粒子杂交,然后在20℃下以18000×g离心2min,以沉淀oligotex-mRNA复合物。用400μL的OW2缓冲溶液重新悬浮oligotex-mRNA并转移到一个小旋转柱中,在20℃下以18000×g离心1min,重复此步骤1次。最后加OEB缓冲液于小旋转柱中,在20℃下以18000×g离心1min,把mRNA从oligotex-mRNA中洗脱下来。1.4弱势粒和弱势粒房或胚乳于抽穗当天、抽穗后3d及强、弱势粒乳熟期,从整齐一致的穗上分别剥取强势粒和弱势粒子房或胚乳;于抽穗当天、抽穗后15d,从整齐一致的穗上取上部一次枝梗和下部二次枝梗,制成石蜡切片,于Olympus显微镜上观察摄影,记录胚乳细胞的数目,用目镜测微尺测量维管束导管和韧皮部的面积。1.5水浴加热处理取0.5g样品粉末,置50mL三角瓶中,加40mL的蒸馏水,80℃水浴中处理30min,过滤至50mL容量瓶中,定容。吸取提取液1mL放入10mL洁净试管,加蒽酮试剂5mL,混匀,冷却,用721型分光光度计在625nm波长下测定其含量。1.6蛋白质提取液的制备准确称取水稻强弱势粒子房0.5g,放入研钵,加2mL0.1mol/LNaOH,研磨成匀浆,转入10mL离心管,再用6mL0.1mol/LNaOH分3次洗涤研钵,洗液一并转入10mL离心管,用玻棒搅拌,放置30min,其间搅拌数次,3500r/min离心15min,上清液转入50mL容量瓶,用蒸馏水定容至刻度,摇匀,得蛋白质提取液。吸取提取液0.1mL,放入10mL具塞刻度玻璃试管,加5mL考马斯亮蓝G-250试剂,混匀,放置2min,用10mm光径的比色杯在595nm波长下用DU-640核酸蛋白分析仪比色,记录OD值,根据标准曲线计算出蛋白质的含量。2结果与分析2.1形态不良反应发生情况从表1可知,提取的总RNA、mRNA纯度都达1.9以上,达到了两者的纯度要求。水稻抽穗当天,强势粒中总RNA、mRNA含量都高于弱势粒,抽穗后第5天,强势粒中总RNA含量仍然高于弱势粒,mRNA含量两者差异不大,开花当天(强势粒抽穗当天,弱势粒抽穗后第7天)和开花后第5天(强势粒抽穗后第5天,弱势粒抽穗后第12天),强势粒中总RNA、mRNA含量和单粒含量都高于弱势粒。强势粒抽穗后0~5d(即开花后0~5d)总RNA、mRNA含量变化不大。弱势粒抽穗后0~5d,总RNA含量显著上升,mRNA含量变化不大。5~7d,总RNA,mRNA含量进一步增加。7~12d(即开花后0~5d),总RNA、mRNA含量都有所下降。不论是强势粒还是弱势粒,从抽穗、开花到开花后5d,其总RNA、mRNA和单粒含量都有显著的增加。2.2抽穗和湖乳的发育进程和结构观察水稻的胚乳细胞是其灌浆物质的储藏单位,籽粒的灌浆生长以胚乳细胞的增殖和充实为基础,胚乳细胞的发育状况对稻米品质和产量有决定性的影响。强、弱势粒胚乳细胞的结构如图1。实验表明,水稻的强、弱势粒胚乳细胞的发育进程和结构有较大的差异。抽穗当天,强势粒已经开花受精,子房开始膨大,而弱势粒尚未开花受精,子房尚未膨大,抽穗后第3天,强势粒子房进一步膨大,胚囊中已形成较多的胚乳细胞,而弱势粒仍未开花受精,子房仍未膨大(图略)。抽穗后20d,强势粒已经乳熟,而弱势粒尚处于灌浆期,抽穗30d后才达到乳熟,取乳熟的强势粒和弱势粒,剥取胚乳,分中部、腹部和背部制成石蜡切片,并显微摄影,观察到无论是中部、腹部或背部,强势粒胚乳细胞较多,体积较小,细胞壁较厚,而弱势胚乳细胞较大,细胞壁较薄,数目较少。强势粒中部一个纵剖面胚乳细胞数平均为245,弱势粒为186,强势粒比弱势粒要多32%,而单个细胞剖面面积要小32%(如图1)。2.3两优培九上、下二次枝梗维管束结构水稻籽粒的充实有赖于源(主要为叶片)的供应能力和库(籽粒)吸收光合产物的能力以及它们的桥梁——流(维管束系统)的通畅程度,三者缺一不可。现测得杂交水稻两优培九枝梗微管束特征如表2。从表2可知,上部一次枝梗大维管束数目与下部二次枝梗大维管束数目相等,均为1,但导管面积和韧皮部面积均为上部一次枝梗大维管束大于下部二次枝梗大维管束;而小维管束数目和小维管束韧皮部面积则上部一次枝梗小于下部二次枝梗,小维管束导管面积则上部一次枝梗大于下部二次枝梗。上部一次枝梗大小维管束导管面积之和和韧皮部面积之和都大于下部二次枝梗。由于本实验所取枝梗为上部一次枝梗顶端负担2个籽粒和下部二次枝梗负担2个籽粒的部分,它们所负担的籽粒数相等,可见上部一次枝梗维管束与下部二次枝梗维管束相比具有量的优势。当然,仅有量的优势是不够的,还必须具有质的优势才能真正有利于无机物和有机物的运输。杂交水稻两优培九上部一次枝梗和下部二次枝梗维管束结构如图2。从图2可知,上部一次枝梗维管束导管、筛管和伴胞都很清晰,单个导管、筛管和伴胞面积较大,而下部二次枝梗维管束导管、筛管和伴胞则较模糊,单个导管、筛管和伴胞面积较小。可见,上部一次枝梗维管束、导管、筛管都比下部二次枝梗发育得好,分化程度高,具有质的优势。2.4可溶性糖含量变化可溶性糖是枝梗维管束运输的主要物质,蛋白质是细胞的功能物质。两者的含量反映了枝梗细胞的物质代谢状态(表3)。从表3可知,上部一次枝梗可溶性糖含量抽穗当天较低,0~10d迅速上升,10~20d有所下降,20~40d又逐渐上升;下部二次枝梗可溶性糖含量抽穗当天很低,0~10d有所上升,10~20d迅速上升,20~30d有所下降,30~40d明显上升。灌浆初期上部一次枝梗可溶性糖含量高于下部二次枝梗,成熟期低于下部二次枝梗。分析表明,枝梗可溶性糖含量与籽粒灌浆动态及维管束活性有密切关系,抽穗当天,由于强势粒尚未灌浆,流经上部一次枝梗维管束的可溶性糖较少,故含量较低。抽穗后10d,由于强势粒迅速灌浆,流经上部一次枝梗维管束的可溶性糖很多,故含量很高,10~30d强势粒灌浆减少,流经上部一次枝梗维管束的可溶性糖减少,此时虽有少量的糖滞留其中,但与灌浆初期上部一次枝梗维管束内运输的大量的可溶性糖相比,其含量降低。30~40d少量的可溶性糖在源端压力的驱动下,经上部一次枝梗继续向强势粒运输,然而,此时强势粒吸引可溶性糖的活力较低,上部一次枝梗对可溶性糖运输的阻力成为强势粒灌浆的限制因子,可溶性糖便在上部一次枝梗中积累起来。所以其可溶性糖含量上升。下部二次枝梗可溶性糖含量也存在类似的情况,0~20d随着弱势粒灌浆强度的增加,其含量逐渐上升,20~30d有所下降,30~40d弱势粒吸引可溶性糖的活力较低,可溶性糖便在下部二次枝梗中积累起来,所以其可溶性糖含量上升。由于下部二次枝梗维管束发育不良,对有机物运输的阻力更大,所以可溶性糖含量更高。说明成熟期可溶性糖含量反映了上部一次枝梗和下部二次枝梗维管束对有机物的运输能力。从表3还可知,上部一次枝梗与下部二次枝梗从抽穗期到成熟期蛋白质含量都呈下降趋势,各时期上部一次枝梗蛋白质含量都低于下部二次枝梗。上部一次枝梗维管束发育较好,导管和韧皮部面积较大,薄壁细胞面积较小。导管是特化的死细胞,仅存细胞壁,无细胞质,蛋白质含量自然很低,为非质体,有利于水和矿物质的运输。韧皮部主要由筛管组成,筛管细胞无细胞核,仅存部分细胞质,蛋白质含量可能也较低,有利于有机物的运输。而薄壁细胞为活的细胞,代谢较旺盛,蛋白质含量较高。由于上部一次枝梗导管和筛管面积较大,且发育较好,薄壁细胞总面积较小,所以各时期蛋白质含量都低于下部二次枝梗。说明蛋白质含量高,意味着维管束发育不良,不利于无机物和有机物的运输。3形态变异的原因从本研究可知,水稻强弱势粒核酸代谢存在着差异。抽穗当天,强势粒总RNA、mRNA含量都高于弱势粒,说明强势粒抽穗后,与籽粒灌浆有关的基因优先大量转录,翻译出与籽粒灌浆有关的蛋白质(酶),所以强势粒库活性高,灌浆较早,结实率和充实度较高;而弱势粒则相反,抽穗后,由于没有立即启动与籽粒灌浆有关的基因转录,不能产生相应的功能蛋白质(酶),所以弱势粒库活性升高较晚,灌浆较迟,结实率和充实度较低。强势粒之所以能优先启动与灌浆有关的基因表达,与其开花受精较早有关,强势粒抽穗当天即开花受精,由于受精作用,启动了新的基因转录,而弱势粒开花受精作用要晚7d左右,其启动与灌浆作用有关的基因表达较迟,此时,水稻群体相对衰弱,源的供应不足。这种基因表达的时序差异导致籽粒灌浆期的营养差异是强弱势粒结实率和充实度差异的重要原因。开花当天和开花后第5天,强势粒中总RNA、mRNA含量和单粒含量都显著高于弱势粒,说明强势粒开花受精后基因表达的强度高,能产生较多与籽粒灌浆有关的功能蛋白质,所以库(籽粒)活性高,吸引营养物质的能力强。这种基因表达的强度差异是导致强、弱势粒结实率和充实度差异的又一原因。张祖建等研究表明,弱势粒的充实主要受制于胚乳细胞数目。杨建昌等研究表明,在品种(组合)内,胚乳重和籽粒充实度与胚乳细胞数呈极显著的正相关,与单个胚乳细胞重相关不显著。推测弱势粒胚乳细胞少,发育不良,灌浆初期生理活性低是其结实率和充实度低的重要原因。本研究表明,强势粒比弱势粒受精早7d左右,其胚胎发育进程也较早,最终胚乳细胞数也较多,然而细胞体积较小,细胞间隙也较小,籽粒灌浆的物理障碍较小,故结实率和充实度较高。从本研究可知,两优培九上部一次枝梗维管束与下部二次枝梗维管束相比发育较好,导管、筛管和伴胞都分化程度高,导管面积和韧皮部面积以及单个导管、筛管和伴胞都较大,而下部二次枝梗维管束导管、筛管和伴胞则较模糊,单个导管、筛管和伴胞都较小。特别是伴胞对物质的运输可能起着的重要作用,它和筛管都起源于单个形成层细胞,与筛管关系密切,有许多分枝的胞间连丝相连,具有相对稠密的细胞质和细胞核,液泡较小,线粒体、高尔基体和内质网丰富,能以ATP的形式向筛管提供能量,这些能量在推动有机物在韧皮部运输中起重要作用。另外,伴胞还能把叶肉细胞产生的同化产物传递到筛管。因而伴胞可能在有机物韧皮部装载和运输中起重要作用。有些伴胞具有许多内生生长的细胞壁,大大增加了细胞膜的表面积,促进同化物从叶肉细胞转移到筛管。上部一次枝梗维管束与下部二次枝梗维管束相比由于具有较多发育良好的导管、筛管和伴胞,所以强势粒结实率和充实度都较高。从本研