复杂基体中微量化合物的定量测定方法

复杂基体中微量化合物的定量测定方法

维生素通常存在于所有食品中，与人体的生长发育和健康密切相关。尽管有许多方法可以测定食品中的维生素,但是由于大部分维生素的稳定性不高,而且食品基体比较复杂,所以维生素的高准确度分析是有待研究的课题。测定维生素的常规方法是选择与待测物性质相似的内标物,以抵消样品处理过程的待测物损失。由于待测物的稳定同位素(13C、2H等)标记试剂与待测物具有最为接近的物理与化学性质,所以是最理想的内标物。同位素标记的内标物已经应用于水、血浆、酱油、奶粉、蜂王浆、炸薯条与面包等多种样品的分析检测中。但是由于这种内标物与待测物的化学性质极为接近,两者在液相色谱中通常不可分离,而通过与质谱法联用,可通过两者的相对分子质量的差异进行检测。液相色谱-同位素稀释质谱法(LC-IDMS)利用理想的内标物,克服了样品处理过程中待测物与内标物在回收率方面存在的差异问题,因此准确性高、重复性好,可实现复杂基体中微量组分的准确测定。国外已将LC-IDMS用于维生素A、维生素B5(泛酸)、维生素B9(叶酸)、维生素E、维生素PP(烟酰胺)等的准确测定。而国内使用同位素稀释质量法测定复杂基体中的维生素含量,尚未见报道。在烟酰胺的测定分析中,已有采用常规的高效液相色谱法(HPLC)对复合维生素注射液与多维片等样品中的烟酰胺进行测定的报道,测定值的相对标准偏差(RSD)可以达到1%以下,但是对于奶粉这样的复杂基体,RSD则是2.8%及以上。为了排除复杂基体的干扰,对于需要进行较高准确性分析检测的情况,可以采用同位素稀释质谱法。本文采用D4-烟酰胺标记物作为烟酰胺分析的内标物,对质谱条件进行了优化,采用了“括号法”进行校正,实验过程中所有称量与取样都以精密天平称重,以确保分析方法的准确性。烟酰胺的分子结构如图1所示。采用本文所建方法参加国际物质量咨询委员会(CCQM)的国际比对实验CCQM-P78,测定结果理想,表明本文所建方法不仅具有高的准确性,还具有国际等效性。1实验部分1.1表面活性剂和标准品液相色谱-质谱联用仪(Agilent1100Series,LCMSDXCTPlus,Agilent,美国);分析天平(SartoriusME235S型,最大称量为230g,精度为0.01mg,德国);分析天平(SartoriusCP324S型,最大称量为320g,精度为0.1mg,德国);超声波清洗机(新芝CQ25-12D,上海);电动移液器(德国Eppendorf公司);烟酰胺标准品(Sigma公司,纯度99.9%);D4-烟酰胺标记物(纯度大于98%,CambridgeIsotopeLaboratories公司,美国);高纯三次水(Millipore,0.22μm滤膜过滤);NaOH、HCl(北京化学试剂公司,分析纯);乙酸胺(Dikma公司);甲醇(Merck公司);微孔过滤膜(0.45μm,Chromspec公司)。1.2烟酰胺和d4-烟酰胺标准储备溶液的配制以下溶液的配制皆采用重量法。烟酰胺标准储备溶液:精确称取一定质量的烟酰胺标准品于容量瓶中,加入一定质量的水,使其质量浓度为140μg/g,摇匀,密封、避光保存。D4-烟酰胺标准储备溶液:精确称取一定质量的D4-烟酰胺于容量瓶,加入一定质量的水,使其质量浓度为280μg/g,密封、避光保存。低标溶液:分别精确量取烟酰胺和D4-烟酰胺标准储备溶液于同一容量瓶中,加入一定质量的水,确保烟酰胺和D4-烟酰胺的质量浓度比例为0.9∶1,两者质量浓度分别约为3.3μg/g与3.7μg/g。密封、避光保存。高标溶液:分别精确量取烟酰胺和D4-烟酰胺标准储备溶液于同一容量瓶中,加入一定质量的水,确保烟酰胺和D4-烟酰胺的质量浓度比例为1.1∶1,两者质量浓度分别约为4.0μg/g与3.7μg/g。密封、避光保存。1.3d4-烟酰胺的制备奶粉样品溶液的配制:精确称取2.0g奶粉于50mL锥形瓶中,加入D4-烟酰胺标准储备溶液(根据初步实验确定用量,确保奶粉中的烟酰胺与D4-烟酰胺质量相近);向瓶中加入5mL60℃的蒸馏水,摇匀,超声振荡10min,降至室温。用5mol/LHCl调pH至1.7±0.1(去除蛋白质的干扰),放置2min,用5mol/LNaOH溶液调pH至4.5±0.1。转移溶液至50mL容量瓶,用水冲洗4次,合并溶液于容量瓶中,定容,摇匀。用0.45μm微孔膜过滤,转移至棕色自动进样小瓶内。1.4流动相、流速色谱柱:Waters公司AtlantisC18柱(2.1mm×150mm,5μm);流动相:5mmol/L乙酸铵溶液(pH5.5)-甲醇(体积比为90∶10);流速:0.22mL/min;进样量:10μL。1.5离子模式电喷雾离子化以定量离子m/z123的响应最优为指标进行质谱条件优化。优化后的条件:正离子模式电喷雾离子化;雾化器压力为206.7kPa(30psi);干燥气流速为10L/min;干燥器温度为340℃;目标离子为m/z123(烟酰胺),m/z127(D4-烟酰胺);毛细管电压为-3500V。1.6进样顺序按“低标溶液—样品—高标溶液—样品—低标溶液—样品—高标溶液”的顺序进样,每个样品至少被测定3次。1.7分析物与标记物配比的确定通常的校正方法有标准曲线法、单点校正法。本文采用了“括号法”,即使用比样品中分析物与标记物的量在比值上略高一点和略低一点的两个标准,使高标溶液、样品、低标溶液中分析物与标记物的比值分别为1.1∶1、1∶1、0.9∶1。而且,采用“低标溶液—样品—高标溶液—样品—低标溶液—样品—高标溶液”的反复夹心式的进样方法,紧紧将样品卡在中间,从而将由于时间、非线性等因素造成的波动减至最小。2结果与讨论2.1o等同位素考虑到安全原因,同位素标记物所用的同位素通常为稳定的2H(即D)、13C、18O等同位素。本文采用的是D代标记物。由于测定的是待测物与标记物的质谱峰强度比,所以为了减少质谱峰的相互干扰,标记物与待测物的相对分子质量最好相差3个单位或以上,但是考虑到价格因素,本文购买了4个氘原子取代的烟酰胺作为标记物。2.2均混合、预处理样品处理过程中为了确保标记物与待测物具有相同的损失水平,必须在最开始就加入标记物,并且充分均匀混合,然后再进行酸化等处理。此外,本文所用样品处理过程的回收率为98.4%,其相对标准偏差为2.1%,但是由于使用了同位素标记物,抵消了回收率的影响,所以回收率的相对标准偏差不会引入到最终结果中,从而确保了较好的测定结果,相对标准偏差仅为0.94%。2.3色度条件的选择(1)atlatoris18柱试验了AtlantisC18柱(2.1mm×150mm,5μm)、InertsilC18柱(2.1mm×150mm,3,5μm)的分离效果,AtlantisC18柱较好。(2)不同甲醇的分离本文使用液相色谱-紫外检测器进行条件优化,在流动相乙酸铵溶液(pH5.5)中加入甲醇。甲醇过少,则分离时间较长;甲醇过多,则分离效果有所降低。本文尝试了加入5%,8%,10%,15%的甲醇,结果表明样品在含10%甲醇的流动相中,分离度与分离时间都比较理想。(3)色谱峰面积测定乙酸铵溶液是LC-MS常用的流动相。文献使用液相色谱-紫外检测器分析,并且指出pH6左右时,水溶性维生素的色谱峰面积基本达到最大值。本文在LC-MS中尝试采用不同pH值(pH4.0,5.0,5.5,6.0)的乙酸铵溶液作为流动相,结果表明烟酰胺在pH5.5的乙酸铵溶液中,峰面积达到最大值。最后选择5mmol/L乙酸铵溶液(pH5.5)-甲醇(体积比为90∶10)作为流动相。2.4结果计算样品中烟酰胺与D4-烟酰胺的浓度比和响应峰面积比在两个校正标准溶液之间,符合线性关系,样品中烟酰胺的含量由式(1)计算得到。C=[(RAS−RAL)(RWH−RWL)(RAH−RAL)+RWL]×WlabelWsample×P(1)C=[(RAS-RAL)(RWΗ-RWL)(RAΗ-RAL)+RWL]×WlabelWsample×Ρ(1)式中:C为样品中烟酰胺含量(mg/kg);RAS为奶粉样品中烟酰胺与D4-烟酰胺的峰面积比;RAL为低标溶液中烟酰胺与D4-烟酰胺的峰面积比;RAH为高标溶液中烟酰胺与D4-烟酰胺的峰面积比;RWL为低标溶液中烟酰胺与D4-烟酰胺的质量比;RWH为高标溶液中烟酰胺与D4-烟酰胺的质量比;Wlabel为加入奶粉样品中的D4-烟酰胺的质量;Wsample为待测奶粉样品的质量;P为烟酰胺的纯度。2.5定量限和检出限LC-MS的结果如图2所示。可以看出,由于使用了MS的选择离子模式,排除了奶粉基质大量干扰峰的出现,提高了分析特异性与灵敏度,分析的定量限(LOQ)(S/N=10)为30ng/g,检出限(LOD)(S/N=3)为10ng/g。由于采用了同位素内标物,排除了各种干扰,结果准确性较高,相对标准偏差仅为0.94%(n=6)。2.6测结果对比本单位采用本文所建方法参加了国际物质量咨询委员会的国际比对实验CCQM-P78,对3份比对样品按照上述检测方法与计算公式,得出的检测结果为(94.6±1.9)mg/kg(1.9为置信区间为95%的不确定度)。参加本次比对并且上报结果的是中国(本单位)、美国、巴西和泰国等国家级计量实验室。其结果如图3。由图3可知,除了实验室4的结果离群偏低之外,其他三国的结果相近,本单位的测定结果(实验室2)与各国国家级计量实验室测定结果具有等效一致性。这表明本单位采用的烟酰胺检测方法与国际水平的实验室的检测水平相同,具有国际等效性。3回收率差异的检测本文采用液相色谱-同位素稀释质谱法测定了配方奶粉中烟酰胺的含量。本法具有以下特点:(1)利用同位素标记试剂这种内标的物理、化学性质与被分析的目标化合物最为接近的特点,可以消除样品在化学和物理的前处理步骤中所引起的回收率差异,使结果准确性高、重复性好,此方法可实现复杂基体中维生素含量的准确测定;(2)与色谱/质谱的高灵敏度和处理复杂样品的能力结合起来,使分析特异性高;