蛋白质印迹免疫印迹课件

实验一蛋白质印迹/免疫印迹Westernblotting/Immunoblotting基本操作流程提取组织或细胞蛋白，蛋白含量测定制备SDS凝胶蛋白质变性，电泳分离蛋白质电泳转膜封闭，加一抗清洗，加二抗清洗，底物显色（曝光）结果分析实验时间安排

1.SDS胶制备

2.样品蛋白质含量测定

3.电泳4.提取小鼠基因组DNA

1.转移电泳

2.蛋白质胶考马斯亮蓝染色分析

3.膜封闭

4.加一抗（过夜温浴4℃）

1.洗膜、考马斯亮蓝染色胶脱色

2.加酶标二抗（温浴37℃，1h）3.洗膜与显示4.结果分析第一天第二天第三天

实验原理第一部分：1.SDS（polyacrylamidegelelectrophoresis）CH2CHCNH2OCH2CHCNHOCH2CH2CHCNHOAcrylamideN,N'-MethyleneBisacrylamide[CH2CH]nCNH2OCH2CHCNHOCH2CH2CHCNHO[CH2CH]nCNH2O[CH2CH]nCNH2O[CH2CH]nCNH2O[CH2CH2CHCNHOCH2CNHOCH2CHpolyacrylamide

实验原理SDS浓度与分离蛋白质范围丙烯酰胺浓度（％）线性分离范围（kD）1510~431212~601020~807.536~945.057~212

实验原理

实验原理第一部分：SDS电泳2、蛋白中含有很多的氨基(+)和羧基(-)，不同蛋白在不同pH下表现出不同的电荷；为使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，上样前应进行处理，即在样品中加入含有SDS和β-巯基乙醇的上样缓冲液。经高温处理，使SDS与蛋白质充分结合，蛋白质完全变性和解聚，形成棒状结构，同时使整个蛋白带上负电荷，电泳时凝胶中所含的SDS负电荷多肽复合物向正极泳动。

实验原理第一部分：SDS电泳3.蛋白样品处于pH6.8压缩胶的上层，pH8.8的分离胶层在下层。由于pH不连续和胶孔径大小不连续，在浓缩胶泳动时，Pro-受阻小，在慢离子（Gly-）和快离子（Cl-）的共同作用下，不同蛋白质可在压缩胶上被压缩成一薄层，使全部蛋白质在进入分离胶前位于同一“起跑线”上；当蛋白质进入分离胶时，不同蛋白以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异，最终达到彼此分开。

实验原理第二部分：样品的印迹（转膜）1.选择适当的膜并进行预处理：

NC膜的预处理：剪裁与胶大小一致的NC膜，将其浸入1×转移缓冲液浸泡，使NC膜得到彻底浸润，一般5分钟以上。

PVDF膜的预处理：剪裁与胶大小一致的膜泡入甲醇中，约1-2分钟。膜的选择PVDF膜硝酸纤维素膜

0.45um和0.2um孔径

简单快速封闭非特异性抗体结合价格昂贵价格便宜特点蛋白较硝酸纤维膜的结合能力强背景较NC膜深洗脱抗体后可再使用

实验原理第二部分：样品的印迹（转膜）2.电流1mA-2mA/cm2，通常200mA/膜，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间。目的蛋白分子大小(kDa)胶浓度转移时间（h）801408%1.52.0258010%1.5154012%0.75﹤2015%0.5

实验原理第三部分：特异抗体与抗原（靶蛋白）结合、显色转移后的硝酸纤维素膜就称为一个印迹(blot),用于对蛋白质的进一步检测。封闭后，用针对目的蛋白的特异抗血清（一抗）处理，印迹中只有待研究的目的蛋白质与一抗结合，而其它蛋白质不与一抗结合。清洗后，再用适当标记的二抗处理（二抗是指抗一抗的抗体），与适当底物溶液反应后即可产生可见区带，指示目的蛋白的位置。WesternBlotting化学增强发光，X光胶片曝光显影结果实验操作一、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS,SDS-PolyacrylamideGelElectrophoresis1.胶模准备与灌胶：取制胶玻板，平板、凹板各一；平板板平置桌面，左右和底部各放一塑料垫条（为防止胶液泄漏，可以在塑料垫条的两面都涂上一层薄薄的凡士林）；然后盖上凹板，底部对齐,左右和底部三侧用夹子夹紧，直立于桌面上。实验操作一、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS,SDS-PolyacrylamideGelElectrophoresis1.胶模准备与灌胶：配分离胶：取一个250ml烧杯，加入以下成分:

分离胶缓冲液（pH8.8）2.5ml40%丙烯酰胺胶液2.5mlH2o4.9ml10%过硫酸铵0.1ml轻摇混匀后，8μLTEMED，再次混匀后立即加入玻板中。P.174.表21-1，小胶10ml/块实验操作一、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

1.胶模准备与灌胶：灌入胶模，至距胶顶约1.5cm（制胶模具不同，分离胶高度有区别，一般为梳齿前沿至胶面约1～1.5cm）；徐徐加入0.5-1ml水覆盖胶顶。室温放置待胶凝聚（约需30分钟），其间配压缩胶。实验操作一、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

1.胶模准备与灌胶：压缩胶配制

压缩胶缓冲液（pH6.8）1ml40%丙烯酰胺胶液0.5mlH2o2.5ml10%过硫酸铵40μL轻摇混匀后，加入4μLTEMED，再次摇匀后灌入胶模待分离胶与上面的水层之间的界限由清晰逐渐消失，又重新出现后，倾去上层水，用滤纸吸干；向压缩胶混合液中加入4μLTEMED，立即摇匀，灌入胶模至距胶顶约0.5cm；徐徐插入上样梳，勿留任何气泡于胶液中；放置1小时以上。P.174.表21-1，小胶4ml/块实验操作二、Bradford法蛋白质含量测定:取7只试管，按以下顺序加入各种试剂：管号空白12345血清样品标准蛋白mL(Conc.1mg/mL)01020304050样品mL------2（鼠）2（兔）0.15MNaClmL300290280270260250298298向每只管中各加入显色试剂3ml，立即混匀，放置10min后，于分光光度计上，595nm比色测定OD值；以OD值为纵坐标，标准蛋白质浓度为横坐标，作图求出血清中蛋白质的浓度。V样品体积:V工作液体积=1:10实验操作三、电泳样品制备

分别各取取含200μg、20μg蛋白质的鼠血清放入两只1.5ml离心管中，再取200μg兔血清放入一只1.5ml离心管中（阴性对照），200μg样品管根据定量结果，加生理盐水稀释至其浓度为：6-8μg/μL，20μg样品管加生理盐水至与200μg管等体积。分别加相应体积的4×SDS电泳上样缓冲液（4×Loadingbuffer），混匀；95℃加热10min。实验操作四、电泳模具装配胶凝后，去除夹子和垫条；将电泳仪的下槽中注满电极液，将胶模的凹板板面向电泳仪的支架，插入电泳仪下槽；用大夹子将胶模上部与支架夹紧；向电泳仪上槽中加入电极液，至没过短玻板上缘1cm；观察上槽液有无泄漏。无泄漏时，拔除上样梳，整理上样井。实验操作五、上样向上样井中顺序加入样品，鼠血清总蛋白50μg、10μg；兔血清总蛋白50μg、10μg；蛋白分子量标准物6μL；预染色的蛋白分子量标准物5μL。一份用于蛋白印迹分析，一份用于染色分析。Pre-stainedproteinmolecularladder10μg50μg兔血清总蛋白10μg50μg鼠血清总蛋白10μg50μg兔血清总蛋白10μg50μg鼠血清总蛋白Pre-stainedproteinmolecularladder实验操作六、电泳将电泳电源与电泳仪用导线相连，负极接上槽，正极接下槽；按压缩胶80V，分离胶10V过夜电泳。实验操作第二部分转移电泳（TransferElectrophoresis）

1.电转移准备（湿转）：盛有电转移缓冲液的塑料盘中，按顺序浸入垫网，二张滤纸(与垫网同大)，剪一与分离胶同大的硝酸纤维素膜，先让其漂在液面上，待液体浸透膜，无任何白斑后，让液体没过膜，再浸入二层滤纸和一层垫网。

2.转移夹装配：

向转移电泳仪中注入转移电泳缓冲液至三分之一高度；盛有转移电泳缓冲液的塑料盘中，将转移夹板打开，夹板的一扇板平置入塑料盘中，另一扇板直立；然后按顺序逐层移入一层垫网和两层滤纸，层间不可留有气泡；

实验操作第二部分转移电泳（TransferElectrophoresis）

电泳完毕，取下电泳胶模，将有耳玻板面向下平置桌面上，向下端两玻板间插入刀片将玻板分开；用刀片切去压缩胶，再将分离胶从中分为两半，一半用于电转移一半用于考马斯亮蓝染色（参见附1）；将胶平放在滤纸的中央，其与滤纸之间不可留气泡；再顺序逐层覆盖上硝酸纤维素膜，二层滤纸和垫网；扣上转移夹，将其夹扣位于上方插入转移电泳槽中，注意令硝酸纤维素膜所在一侧对向红色接线柱，绝不可颠倒。NC膜滤纸滤纸SDS滤纸滤纸＋－SDSNC膜实验操作第三部分酶标免疫反应显示

Immuno-detectionofProteinBlotswithHRP-labeledAntibody1.蛋白转移膜的丽春红染色显示：（使用预染Marker此步骤可省略）

转移电泳完毕，断电，取出转移夹，取出转印膜于20ml蒸馏水中漂洗一遍，然后用10ml丽春红染液（0.2%丽春红-1%乙酸）染1min；用蒸馏水漂洗至背景近白色，漂洗应少量多次，每次30ml左右；照相留底；继续用蒸馏水漂洗至色带消失或者基本消失。实验操作第三部分酶标免疫反应显示2.封闭加入封闭液（5%脱脂奶粉TBST溶液或3%BSATBST溶液），以液体展开后刚刚没过膜表面为宜，室温下置摇床1h；3.加入适量一抗（根据抗体说明书确定相应用量），4℃摇床过夜；4.取出膜条，TBST彻底清洗一抗，加入酶标二抗，37℃保温1h。实验操作第三部分酶标免疫反应显示5.显色检测：根据酶标所用酶选用适当的显示方法。本实验采用辣根过氧化物酶标记抗体，相应地采用氯萘酚成色显示方法。倾去含酶标抗体的封闭液，用TBS漂洗硝酸纤维素膜3遍，各振摇5分钟；蒸馏水漂洗1遍，漓去水后在显色液中显色，轻轻振摇至显色深度不再增加，然后放入水中漂洗停止显色，照相存底，移到滤纸上干燥保存。小鼠基因组DNA的制备

(PreparationofGenomicDNA)1.肝组织的消化取100-200mg肝脏，用剪刀剪碎，移入7ml离心管中，加入2ml消化缓冲液，混匀。再加入20μl蛋白酶K，盖紧管盖，充分颠倒混匀。置50℃水浴箱中，过夜。第一天操作步骤2.加入2ml苯酚：氯仿，盖紧管盖，振荡器上剧烈震荡30秒，12000rpm，10min。3.取上层水相1ml转移入一只新的7ml的离心管中，加入1/2体积（0.5ml）的7.5M乙酸铵，混匀；再加入2体积（3ml）的无水乙醇，颠倒混匀，12000rpm，10min。4.去上清，加入1ml70%乙醇清洗沉淀，离心1min。5.去上清，干燥后加入200μlTE溶液，-20℃冻存备用。第二天操作步骤附1：SDS考马斯亮蓝染色显示方法1.染色（Staining）：加入5倍体积的染色液，于摇床上振摇2小时。2.脱色（Destaining）：倾去染色液，加入5体积脱色液，于摇床上振摇至背景脱净（其间至少更换3次脱色液），照相保存结果。4.干胶保存（GelDrying）：取玻璃板，裁取两张比玻璃板长出和宽出5-6cm的玻璃纸，浸泡入水中10分钟。然后于玻璃板上铺一张浸泡过的玻璃纸，每边超出框架3cm左右，将胶块置中间；再覆盖上一张浸泡过的玻璃纸，注意勿在胶块与玻璃纸之间留存气泡，最后将每边长出的玻璃纸翻向玻璃板下方卷折，四周用