分子生物学课件

癌基因与抑癌基因癌基因和抑癌基因癌基因和抑癌基因在细胞增殖调控中的作用癌基因和抑癌基因与肿瘤发生捕获致癌凶手

—病毒致癌理论，劳斯(Rous)

获1966年诺贝尔生理学和医学奖Rous：1907年，从母鸡身上的恶性结缔组织（肉瘤）中提取滤液，接种到健康的鸡体内，鸡患上同样的肿瘤。表明：滤液中含致病原，可传播肿瘤。1932年，Shope发现，野生棉尾兔的皮肤肿瘤也可借助无细胞滤液传播。肿瘤进展：开始，癌细胞处于“休眠”状态，被化学因子、病毒等唤醒后，变的无法无天。病毒致癌理论：即传播肿瘤的无细胞滤液中含的是病毒。劳斯(Rous)，获1966年诺贝尔生理学和医学奖改写中心法则

—逆转录酶的发现

特明(Temin)和巴尔的摩(Baltimore)

获1975年诺贝尔生理学和医学奖转化：通过病毒的诱导，正常细胞可转化成肿瘤细胞。转化细胞中不产生病毒粒子。结论：病毒的遗传物质被结合到转化细胞的遗传物质中，细胞获得来自病毒的遗传特性。Temin：劳氏肉瘤病毒（RSV），RNA病毒。推测：RNA逆转录成DNA后，整合到细胞的遗传物质中。Baltimore：发现逆转录酶。癌基因探密

—毕晓普(Bishop)和瓦慕斯(Varmus)获1989年诺贝尔生理学和医学奖Bishope,Varmous：劳氏肉瘤病毒如何使正常细胞转化为恶性生长的？研究表明：劳氏肉瘤病毒的致癌能力与病毒基因组的单个基因有关，即src基因。

src基因本是正常细胞基因组的一部分（原癌基因），被病毒“劫持”后，病毒则具有致癌能力。原癌基因在正常细胞中的地位：调控细胞的分裂和生长。肿瘤细胞中癌基因的变化：过分活跃或突变，使其编码产物改变。癌基因和抑癌基因癌基因(oncogene,onc)控制细胞生长的基因，具有潜在的诱导细胞恶性转化的特性病毒癌基因(virusoncogene,v-onc)病毒所携带的致转化因子命名：逆转录病毒株结合其所转化的宿主细胞，3个字母，如abl等细胞癌基因(celloncogene,c-onc)即原癌基因(protooncogene)：未激活的癌基因，促进正常细胞生长、增殖、分化、发育等

v-onc与c-onc的不同V-onc无内含子外显子有微小差别V-onc常出现碱基取代或缺失等突变癌基因家族据基因结构和功能特点分为：

src家族：abl、fes、fgr、fps、fym、kck等，编码产物多具有蛋白酪氨酸激酶活性

ras家族：H-ras、K-ras、N-ras，表达产物为信息传递分子，编码的蛋白质为P21myc家族：c-myc、fos等，表达产物在细胞核内，属DNA结合蛋白sis家族erb家族：表达产物为细胞骨架蛋白myb家族：表达产物为转录调节因子抑癌基因(tumorsuppressorgene)正常细胞内，抑制细胞生长，潜在抑癌作用的基因此类基因突变、缺失或失活，引起细胞恶性转化，导致肿瘤调控细胞增殖和分化、负调节表达产物：跨膜受体、胞质调节因子、转录因子、细胞周期因子等癌基因表达产物在细胞增殖信号转导中的作用生长因子及其类似物受体类：蛋白酪氨酸激酶低分子量G蛋白胞内蛋白激酶胞浆调节蛋白核内转录因子癌基因和抑癌基因在细胞周期调控中的作用细胞周期及其调控细胞间期(G1期、S期、G2期)和有丝分裂期两个调控点：G1/S转折点、G2/M转折点从增殖角度，细胞可分为三类连续分裂的细胞：周期性细胞，如小肠绒毛上皮隐窝细胞休眠细胞（G0期细胞）：暂时脱离细胞周期，如肝、肾细胞终端分化细胞：如神经、肌肉细胞原癌基因在细胞周期调控中的作用有些原癌基因是细胞周期蛋白的成员抑癌基因在细胞周期调控中的作用抑制细胞周期于静止期，并使复制不完全或受损伤的DNA不能进入分裂期。Rb基因在细胞周期调控中的作用P53基因在细胞周期调控中的作用WT1基因癌基因恶性激活的机制原癌基因点突变原癌基因基因获得外源启动子而激活原癌基因甲基化程度降低而激活原癌基因的拷贝数增加而激活基因易位或重排使原癌基因激活癌基因激活与肿瘤的发生肿瘤发生学说启动阶段、促癌阶段、演进阶段癌基因激活与肿瘤发生Ras基因变异与肿瘤发生Myc基因变异与肿瘤发生抑癌基因失活与肿瘤发生Rb基因P53基因P16基因肿瘤发生的多基因协同学说亨廷顿舞蹈症表现：生理上失控，如肌肉萎缩；身体衰弱，痴呆中年发病，遗传缺陷被保留，代代相传1968年，魏斯乐、艾丽丝、南西、李诺委内瑞拉，收集家族图谱，采血样，空运1982年，谷塞拉，DNA探针（RFLP）与DNA比对第三个G8探针，配合病人DNA一起出现，不配合健康者，康尼利，电脑分析，连锁比率很高，“幸运吉姆”，1983年，Nature，在4号染色体上杜氏肌营养不良（DMD）肌肉萎缩症，始于童年早期，渐渐消耗病人肌肉，X染色体缺陷，找不到病因。“反转遗传学”：从疾病源头找起1970年，布莱尔，三种疾病：慢性肉芽肿（免疫）；视力恶化（色素性视网膜炎）；DMD猜测：X染色体有较大的缺失1979年，女孩，DMD。X染色体短臂（XP21）一段DNA缺失，该位置是否是DMD基因所在位置1981年，康克尔，BBcell，将正常X染色体DNA切割后，与BB细胞XDNA切割后杂交，有8段不能杂交上，说明在BB细胞中缺失；用这8段作探针，与其他DMD患者杂交，第8号无法与其他5人杂交，说明该探针与DMD有关。1985年，探针太短，DMD基因出奇长新问题：鉴定出一段DNA后，如何知道它是DMD的一部分，因不知DMD产物DNA动物园，探针检查，鼠、猴等也可黏附，可能是基因的一部分，1986年，Nature1987年，8段DMA基因，平均150bp，散在13万bp的DNA片段上，占人类基因组的1/1000找关键蛋白质，“抗体”。鼠DMD基因片段→植入细菌→产生蛋白质→接种兔子→抗体→对正常人肌肉组织起反应，对DMD肌肉不起反应抗肌萎缩蛋白作用：极薄的组织鞘，包在肌纤维外薄膜上，提高机械强度治疗：提供抗肌萎缩蛋白或另一替代蛋白，建立鼠模型双重打击理论1985年，5周大男孩，视网膜母细胞瘤，放射线治疗，预测癌症卡威尼，RB，13号染色体缺失一段，太复杂克努森，1971年，多重打击女孩，RB，智力障碍，13号损伤标记：酯酶D，紧密连锁，RB基因代理人寻找第二个打击：失去单个酯酶D基因，酯酶D量减半；失去两个酯酶D基因，无酯酶D3岁女孩，患RB，全身酯酶D只有正常人一半，而眼癌中组织，无酯酶D寻找该基因，RFLP从病孩13号染色体切下的两截片段，竟一样长，都与父亲一样，似乎从父亲传到两段受损的染色体，而未传到母亲的。解释：父亲缺损的染色体又复制一次，替代了母亲的。原因：互换，父母染色体同一段交叉，子代有成对父亲染色体，若是RB异常基因，子代将有两条缺少该基因的13号染色体，即“第二次打击”。1983年，Nature，卡威尼证实了克努森的“双重打击学说”。RB基因被称为抑癌基因，有一个，不患癌症；都缺失，患癌症。卡威尼，完成首例癌症预测克努森，癌症生成的新理论之父，“原创、清晰的想象”。结肠癌美国第二号癌症死因，家族遗传异常。进程：直肠息肉→恶性→布满肠壁→恶性细胞进入血液→流传到其他器官1981，史古尼克，查家族息肉，摩门教徒的犹他家族，191人，21%患腺瘤息肉，配偶组，9%患病，显性遗传弗吉斯坦，维耳姆氏瘤（儿童肾脏癌），11号染色体缺失。查结肠癌，癌症进程清楚，是否不同病程，失落不同基因？查11号、13号，没收获。查文献，看是否有人看到DNA缺失遗传学杂志，一结肠癌病例，肿瘤细胞中17号染色体两只长臂融合，短臂失落；18号缺损。查17号，肿瘤细胞17号缺损，健康组织中存在，息肉中无DNA缺失怀特，水牛城男童，患FAP（遗传性腺瘤息肉）和智障，5号染色体；包得摩，5号染色体探针，正常人有，FAP没有；遗传到一个，长息肉；两个缺失，息肉转变为癌症疾病相关染色体：17、18、5、11（ras）1989，寻找基因：17号，p53基因，健康组织，双套p53基因；肿瘤单个p53基因且点突变。“双重打击”，p53基因为抑癌基因。P53基因重要性不仅限于结肠癌，其他如乳腺癌、脑癌、肺癌等，“分子警察”。1990，18号，DCC基因，制造的蛋白质具胶合功能，基因改变，细胞胶消失，细胞生长限入混乱。一、试述真核生物转录起始的调控。二、举例说明G蛋白偶联受体介导的信号转导过程。三、说明“插入灭活法”如何筛选带重组体克隆。四、反义RNA如何用于基因治疗？五、请你为《分子生物学》课程提意见或建议一、试述真核生物DNA水平的调控。二、举例说明单次跨膜受体介导的信号转导过程。三、说明“α-互补法”如何筛选带重组体克隆。四、核酶如何用于基因治疗？五、请你为《分子生物学》课程提意见或建议

第三节癌基因癌基因已被证实是正常存在于生物(包括人类)基因组内的,它的结构异常或表达异常,也的确可以引起细胞癌变.一癌基因本世纪初发现某些病毒对动物有致癌作用70年代从逆转录病毒中发现癌基因(oncogene,onc)80年代初在人膀胱癌细胞株中证实有oncogene(一)病毒癌基因1911PeytonRous发现鸡肉瘤病毒(RSV)可以致癌,其中与致癌有关的基因src称为癌基因1966诺贝尔奖Bishop,Varmas证实RSV中的src不是逆转录病毒固有的,而是来自宿主基因组的src基因1989诺贝尔奖致瘤病毒中存在的某些核苷酸序列称为癌基因,即病毒癌基因(v-onc)人类常见的致瘤病毒RNA病毒人类T淋巴性病毒Ⅰ(HTLV-Ⅰ)DNA病毒EBV,HSV,HCMV,Ad习惯上,将逆转录病毒上所含的致癌基因称为v-onc,而将宿主细胞基因组中的同源基因称为原癌基因或细胞癌基因(二)细胞癌基因(cellularoncogene,c-onc)细胞癌基因是指真核细胞中存在的一段核苷酸序列,这段核苷酸序列在正常细胞中以非激活形式存在,故又称原癌基因(proto-onc).在某些特定条件下激活可致癌变原癌基因具有内含子和外显子(三)原癌基因分类原癌基因表达的蛋白产物分布于细胞膜,细胞质,或细胞核根据蛋白产物的功能分为几大类:1.生长因子(growthfactor,GF)及其类似物,以及生长因子受体(GF--R)2.酪氨酸蛋白激酶:某些酶蛋白磷酸化(ser)3.GTP结合蛋白:影响细胞内的信号系统4.核内蛋白质:结合DNA发挥转录调控作用,甚至影响复制由此可将癌基因分为相应的几类,或称癌基因家族用三个字母来表示,超过100个src家族ras家族myc家族sis家族erb家族(四)癌基因的激活原癌基因正常情况下行使正常的调控功能,,在某些特定因素作用下,其结构或调控发生异常,使之激活才具有致癌活性致癌机理1.调节序列的插入启动子,增强子2.基因突变膀胱癌细胞株EJ和T24中,点突变激活C-rasH癌基因,造成细胞癌基因大量表达3.基因重排染色体异位burkitt淋巴瘤

t(8;14)8q24→14q32C-myc被激活4.基因扩增原癌基因复制多个拷贝5.基因偶联某些原癌基因在特定条件下因其它原癌基因首先激活而序贯活化称为基因偶联癌变的发生是多阶段，不同阶段相继或同时又不同癌基因激活二抑癌基因(tumorsuppressergene)遗传性肿瘤细胞中特定染色体或染色体的某一部分丢失丢失的这一部分可能对细胞的恶性转化有抑制作用因此推测在此染色体上存在抑癌基因1986年视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,Rb)隐性癌基因Rb被克隆并测序,抑癌基因首次被证实已发现的抑癌基因有10余种,都是通过缺失或失活而致细胞恶性转化的1.P53基因1979年发现,53kD的磷酸化蛋白,细胞核内,17p13.1野生型p53基因称为抑癌基因,正常p53的生物功能好似“分子警察”:G1期检查DNA损伤点,监视细胞基因组的完整性.如有损伤,P53蛋白阻止DNA复制,以提供足够的时间让损伤DNA修复.如果修复失败,P53蛋白则引发细胞程序性死亡,阻止具有基因损伤,可能诱发癌变的细胞产生.2.Rb基因13p14105kDP105-Rb细胞核内一类DNA结合蛋白Rb蛋白的磷酸化/去磷酸化是调节细胞生长的主要形式3.其他抑癌基因:DCC基因,NF1基因,MCC基因抑癌基因作用机制涉及基因表达调控,细胞分裂,分化过程,也可能与GF,激酶,信息在胞内的传递密切相关三、重组DNA技术与医学的关系

分子医学molecularmedicine（一）疾病基因的发现（二）发展生物制药基因工程药物基因工程疫苗（三）DNA诊断基因诊断

基因诊断—用分子生物学的技术对引起疾病的原因--遗传基因,致病微生物和寄生虫,以及某些恶性肿瘤在基因水平上进行病原学和细胞遗传基因的检测和分析.DNA/RNA（四）基因治疗genetherapy基因治疗—就是向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。基因置换基因修正基因修饰产物补偿缺陷细胞基因失活反义技术封闭基因,抑制有害基因对象体细胞生殖细胞1990.9.14首例基因治疗4岁女孩严重免疫缺陷症(SCID)缺乏腺苷酸脱氨酶(ADA)2--脱氧腺苷含量升高毒性严重破坏免疫功能ADA基因LN逆转录病毒载体靶细胞为病人淋巴细胞回输（五）遗传病的预防产前诊断携带者测试症候前诊断遗传病易感性第二节蛋白质蛋白质的一级结构与功能的关系蛋白质的空间结构与功能的关系

蛋白质二级结构与功能蛋白质的超二级结构与结构域蛋白质三级结构与功能蛋白质四级结构与功能

一级结构与功能一级结构是蛋白质功能的结构基础，也决定蛋白质的空间结构。蛋白质一级结构中也有一些特定的序列能阻碍蛋白质表现出生物功能，只有将其切除后才能形成有活性的蛋白质。如牛胰岛素原和酶原。分子病：基因突变导致蛋白质的一级结构改变，表现出生理功能的异常，使机体出现病态现象。如镰刀状红细胞贫血。二级结构与功能α-螺旋（α-helix）、β-折叠（β-pleatedsheet）、β-转角、无规卷曲（randomcoil）、π-螺旋及Ω环（Ω-loop）。α-螺旋多的蛋白质分子紧密、稳定。如毛发、细菌纤毛的蛋白质。富含β-折叠的蛋白如丝心蛋白柔软有强度,但缺乏弹性.蛋白质超二级结构和结构域超二级结构(supersecondarystructure):相互邻近的二级结构单元相互聚集，形成更高一级的有规律的结构。1973年，Rossman提出。三种基本形式：(αα)、（βαβ）、（βββ）.超二级结构的形成主要是氨基酸残基侧链基团间相互作用的结果。结构域（domain）：某些较大的球状蛋白质分子多肽链往往形成几个紧密的构象，彼此分开，各行其功能。1970年Edelman描述IgG分子构象提出。功能域是蛋白质分子中能独立存在的功能单位，可以由一个或几个结构域组成。一些具有不同功能的蛋白质可能具有某个相似的结构域。如枯草杆菌蛋白酶、己糖激酶和磷酸化酶中都含有一个核苷酸结合的结构域。三级结构与功能蛋白质分子的一条多肽链在二级结构和超二级结构的基础上进一步盘旋和折叠形成的空间结构，靠次级键维系，二硫键加固。亲水基团朝外翻，疏水基团朝内钻。三级结构的完整性是其功能的基础。若蛋白质严密有序的空间结构遭到破坏，则其生理功能丧失。四级结构与功能蛋白质分子中亚基的空间排布和相互间的布局。具有四级结构的蛋白质的功能活性可以通过变构作用（allostericeffect）而被调节。蛋白质变构有两种模式：

第三节生物大分子的相互作用生物大分子相互作用的力

非共价键的作用。离子键、氢键、vanderwaals力、疏水键。信息的传递及利用极大地依赖弱的非共价键。它们不仅决定着生物大分子的三维结构，还决定着这些结构如何与其它结构相互作用。蛋白质-蛋白质的相互作用

（protein-proteininteraction）蛋白质通过分子之间的相互作用实现其特异的生物学功能。如蛋白质酶的催化作用需要酶与特异作用物之间的相互识别、结合成中间复合物；抗体参与的防御功能需要抗体与抗原之间的特异识别与结合。1、蛋白质的基元（motif）与结构域由α螺旋和β片层参与的特定组合称为基元或模体。常见模体有：β发夹：由位于同一层面内的两条反向平行β折叠链与一股环形肽链连接而成。β拱形：由位于不同层面内相对的两条β折叠链共价连接一个环拱结构组成。β-α-β模体：由两个相邻的平行β折叠通过一定长度的α螺旋连接在一起α-α模体：一个蛋白质分子可包含一个或多个结构域，结构域的核心由模体组成。一级结构决定空间结构，除一级结构，特异折叠的空间结构形式的形成尚需分子伴侣（chaperone）存在及适当的溶液环境。2、蛋白质的结合位点一个蛋白质分子与其配体之间的结合需要在两个分子的特定部位之间形成很多弱化学键，两分子间相互作用的部位称为结合位点。仅仅属于多肽链的一小部分，其余的氨基酸残基为维持正确的空间位置所必需。3、蛋白质之间相互作用的特异性由其结合位点决定。两分子的结合位点必需存在能够配对形成非共价键的基团，而且每对基团在空间上恰好能达到形成非共价键的最佳距离。信号传递过程中，正是通过蛋白质分子之间相互作用的特异性而保证信号传递的特异性。DNA-蛋白质相互作用（DNA-proteininteraction）一、DNA-蛋白质相互作用的化学键1、氢键:具有识别功能蛋白质的螺旋结构常与DNA的大沟相互作用。2、疏水键：暴露于大沟侧缘的T-CH3基团是疏水性的，可与疏水氨基酸残基侧链相互作用。3、离子键：二、DNA-蛋白质相互作用中的序列特异性1、序列特异识别的结合能：依赖两种类型的相互作用。一是多肽链与DNA大沟暴露的碱基之间通过氢键和范德华力建立的联系；二是多肽链中的碱性氨基酸与戊糖-磷酸骨架之间的电荷联系。2、序列特异结合的结构基元：螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helixHTH），锌指结构（zincfingermotif）HTHHTH基元：最初发现于λ噬菌体的阻遏蛋白中，现发现在很多原核及真核DNA结合蛋白中存在。由两个较短的α螺旋与其间含Gly残基的绞链组成。如大肠杆菌的CAP蛋白含一HTH结构域，HTH通过DNA双螺旋大沟识别、结合反向重复序列TGTG/CACA。锌指结构首先发现于非洲爪蟾卵母细胞纯化的TFⅢA，它是5SrRNA基因转录激活因子，结合50bp5SrRNA编码基因的内调控区。含有9个相同的锌指结构。TranslationTranslationinprokaryotes蛋白质生物合成体系氨基酸的活化与搬运核糖体循环多聚核糖体TranslationineukaryotesPosttranslationalprocessing蛋白质生物合成体系1、mRNA2、核糖体3、tRNA4、起始因子、延长因子和终止因子5、氨基酰-tRNA合成酶mRNA：模板遗传密码(geneticcodon)：三联体密码（tripletcode)遗传密码的破译：遗传密码表遗传密码的特点：连续性(commaless)有起始密码(AUG)和终止密码(UAA,UAG,UGA)简并性(degeneracy)摆动性(wobble)通用性(universal)mRNA(messengerRNA)是翻译的直接模板实验1：系统中加入RNase，蛋白质合成立刻终止；实验2：系统中加入DNase，蛋白质合成在30分钟后终止。说明：蛋白质合成是以RNA为模板；而RNA合成又是以DNA

为模板的。DNARNA前体成熟mRNAmRNA蛋白质转录加工运输翻译细胞核细胞质三联体密码（tripletcode)mRNA5′AUCGACCUGAGC3′420(×)42=1620(×)43=6420(√)mRNA5′AUCGACCUGAGC3′mRNA5′AUCGACCUGAGC3′mRNA5‘UUUUUUUUUUUU3‘多肽NPhe-Phe-Phe-PheC密码子与反密码子配对的摆动现象tRNA反密码子碱基IUCmRNA密码子碱基A,C,UA,GC,G,U核糖体（ribosome)：场所1、有容纳mRNA的通道2、能结合起始、延长及终止因子等。3、有A位（acceptorsite)和P位(donorsite).4、有转肽酶活性，催化肽键形成5、大亚基上有延长因子依赖的GTP酶活性，可为转肽提供能量。tRNA：接合器一种tRNA只能与一种氨基酸结合，一种氨基酸可与几种tRNA结合。结合位点为：3`端CCA-OH。Ala-tRNAala;met-tRNAemet;携带延长中的肽链上的蛋氨酸fmet-tRNAfmet：起始tRNA(原核生物）Met-tRNAimet接头假说：起始因子（initiationfactor)

参与蛋白质起始复合物的形成。IF-1：促进IF-2和IF-3的活化。IF-2：促进fmet-tRNAfmet与30S小亚基结合的作用，并有依赖核糖体的GTP酶活。IF-3：使30S亚基释放，辅助mRNA与小亚基结合，并阻止大小亚基重新聚合。延长因子(elongationfactor)EF-Tu:与氨酰-tRNA及GTP结合形成EF-Tu.GTP.AA-tRNA，将氨酰tRNA转入A位。EF-Ts：在GTP供能时，使EF-Tu.GDP转变为EF-Tu.GTP.EF-G：依赖于核糖体的GTPase，使GTP水解，并有移位酶作用。终止因子(terminationfactor

又称为释放因子(releasefactor,RF)功能是识别mRNA上的终止密码子,终止肽链的合成并释放出肽链。RF-1:识别密码子UAA及UAGRF-2:UAA及UGARF-3:结合GTP,并促进RF-1及RF-2与核糖体的结合。氨基酰-tRNA合成酶既能识别特定的氨基酸，又能识别转运该氨基酸的tRNA。氨基酸+ATP+tRNA氨基酰-tRNA+AMP+PPi氨基酰-tRNA合成酶可发挥较对功能，使误载的氨基酰-tRNA从tRNA上释下，保证遗传信息翻译的准确性。核糖体循环（ribosomecycle)起始（initiation)延长(elongation)终止（termination)起始（initiation)

1、核糖体大小亚基的解离：IF-3、IF-12、mRNA与小亚基结合。AUG上游8~13个碱基处存在SD序列（Shine-Dalgarnosequence),能与小亚基中16SrRNA3`端序列互补。3、fmet-tRNA的结合：IF-2、GTP、IF-14、大亚基结合：IF-2有GTP酶活，各IF释放。延长(elongation)

进位（注册）：先形成EF-Tu.GTP.AA-tRNA复合物转肽肽酰转移酶，不需GTP，位于大亚基，中心含23SrRNA。移位

EF-G，GTP供能。终止（termination)

RF核糖体转肽酶变为水解酶活性。多聚核糖体（polyribosome)在一条mRNA链上常结合有多个核糖体，呈串珠状排列，同时进行多肽链的合成。每个独立的核糖体都能合成一条完整的多肽链，因此从同一模板上同时能合成多条多肽链。可提高mRNA的利用率和蛋白质生物合成的速度。真核生物蛋白质合成的特点起始阶段（1）在核内合成mRNA前体，加工并与多种蛋白质结合成核蛋白颗粒，转入胞浆。起始时其二级结构需要松解，并放出多余的蛋白质。（2）Met-tRNAiMet（3）起始复合物：40S-mRNA-Met-tRNAiMet（4）没有SD序列。帽子结合蛋白结合mRNA上的帽子结构。（5）至少9种起始因子。eIF-2：GTP结合蛋白，与GTP结合后携带起始Met-tRNAiMet进入40S小亚基。eIF-4A：ATPase，eIF-4B：解链酶，松解mRNA二级结构eIF-4E：帽结合蛋白（cap-bindingprotein,CBP)eIF-4F:通过eIF-4E与mRNA的5`帽结构结合，eIF-3参与寻找AUG。延长、终止阶段延长：仅延长因子不同

eEF-1α相当于EF-TueEF-1β相当于EF-TseEF-2相当于EF-G。终止：仅一种释放因子，可识别3种密码子（UAA、UAG、UGA），并需GTP。肽链的翻译后加工新生肽链的折叠肽链中氨基酸的共价修饰糖苷共价修饰（covalentmodification)脂质共价修饰其它共价修饰新生肽链的水解修饰亚单位聚合新生肽链的折叠折叠酶(foldase)或分子伴侣(molecularchaperone)分子伴侣:是一个结构上互不相同的蛋白质家族,可识别肽链的非天然构象,促进蛋白质正确折叠。如热休克蛋白（heatshockprotein,HSP)70与60。肽链中氨基酸的共价修饰糖苷共价修饰（covalentmodification)：多肽链的糖苷化与肽链的合成同时进行。脂质共价修饰：脂肪酸与多肽链中的丝、苏氨酸的羟基以酯键结合，影响蛋白质的生物功能。其它共价修饰：羟基化、磷酸化、甲基化、乙酰化等。新生肽链的水解修饰蛋白质生物合成的抑制利福霉素及其衍生物利福平：与原核细胞RNA聚合酶的亚基结合抑制转录。抗菌药。白喉毒素（diphtheriatoxin)对真核生物剧毒，实质是一种修饰酶，对真核生物的EF-2起共价修饰作用，使其失活。由于肿瘤细胞对白喉毒素比正常细胞更敏感，故用它与抗肿瘤细胞的特异抗原结合以消灭肿瘤细胞。干扰素（interferon)由真核生物细胞感染病毒后分泌的具有抗病毒作用的蛋白质。可抑制病毒繁殖，保护宿主。干扰素在双链RNA（某些RNA病毒）存在时，作用于蛋白质合成的启动阶段，使蛋白质合成受抑制。干扰素还可诱导生成一种寡核苷酸，活化RNaseL，由RNaseL降解病毒RNA。作业核酶反义RNAHIV病毒基因组的结构与功能端粒与端粒酶RFLP人类基因组多样性计划常用抗生素的作用机制谈谈你对《分子生物学》的认识Chapter4replicationDNAreplicationDNAdamageandrepairReversetranscriptionRNAreplicationDNA复制的基本特点半保留复制（self-conservativereplication）复制子（replicon)半保留复制1958年，Meselson和Stahl首次用实验证实了DNA的半保留复制。步骤：用普通培养基（14N）培养15N标记的大肠杆菌。用CsCl密度梯度离心法分析DNA。加热子一代DNA分子。复制子（replicon)复制子:基因组中能单独进行复制的单位。每个起始点到终止点的区域为一个复制子。起始点（originofreplication,ori):原核生物DNA分子中只有一个，长度200bp左右。大肠杆菌oriC有245bp。真核生物有多个复制起始点。终点（ter）：D、A、C、B（23bp共有序列）Tus（terminatorutilizationsubstance）识别终止序列。复制的方向：单向或双向原核生物DNA聚合酶（DNApolymerase,DNApol)1958年Kornberg首先从大肠杆菌提取DNApolⅠ：聚合作用：5`→3`3`→5`外切酶活性：校对功能5`→3`外切酶活性：引物切除、损伤修复主要功能是切除引物，填补冈崎片段产生的空隙及DNA损伤的修复DNApolⅠ是单一肽链的大分子,分子量为109kD,二级结构以α-螺旋为主。用特异的蛋白酶处理，可把DNApolⅠ水解为两个片段，即在F，G螺旋之间发生断裂。小片段：323个氨基酸残基，5`→3`外切酶活性大片段或称Klenow片段：604个氨基酸残基，DNA聚合酶活性和3`→5`外切酶活性DNApolⅡ：5`→3`聚合酶活性及3`→5`外切核酸酶活性。DNApolⅢ:由10个亚基组成，分别为α、ε、θ、τ、δ、δ`、β、κ及ψ。是原核生物体内真正起复制作用的酶。α亚基：5`→3`聚合酶活性ε亚基：3`→5`外切酶,校对和编辑θ为装配必须大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ真核生物DNA聚合酶α、β、γ及δ四种，都有5`→3`聚合功能。α及δ参与核DNA复制；

α：链合成的引发，δ：链的延长

polδ；切除引物后填补空隙

β：外切核酸酶

γ：线粒体DNA复制其它环状DNA分子的复制

1、θ复制:首先由J.Carins从大肠杆菌中观察到,又称为Carins复制。2、滚环复制（rollingcirclereplication)3、D环复制（Dloopreplication)：线粒体DNA复制端粒与端粒酶(telomerase)

Telomere:真核生物线性染色体3末端的一种特殊结构。核苷酸重复序列富含G，和端粒结合蛋白组成核蛋白复合物。人的DNA端粒含有TTAGGG重复序列，长度5~15kb。作用：保护染色体末端免于化学修饰或核酸酶降解；解决染色体复制时末端丢失问题。

Telomerase:由RNA和蛋白质组成的酶。兼有模板和逆转录酶两方面的作用。1995年，JunliFeng等克隆了人类端粒酶RNA基因，长约450个碱基的RNA序列中有一段长11个核苷酸的区域（5-CUAACCCUAAC-3）与人的端粒序列（TTAGGG）n互补。端粒酶蛋白质的分离：四膜虫端粒酶两个多肽成分p80和p95。端粒与衰老实验：在无端粒酶活性的成纤维细胞中表达端粒酶时，端粒的缩短和细胞的衰老都受到抑制。结论：细胞的衰老是由端粒驱动的。体外培养的细胞端粒的长度随细胞逐代相传而缩短，丢失到一定程度便失去对染色体的保护作用。细胞随之发生衰老和死亡。可把端粒看成一面钟，端粒的长度是钟上的刻度，记载了细胞分裂的次数，称为“端粒钟”，或有丝分裂钟或“生命的时钟”，可通过测定端粒的长度预测细胞的寿命。胚胎细胞和生殖细胞端粒的长度并不随细胞分裂次数的增加而缩短，具有无限的分裂能力，原因在于端粒酶的存在。端粒酶与肿瘤人体内除了生殖细胞和少数一些体细胞如淋巴细胞等细胞外，绝大多数体细胞中无法检测到端粒酶的活性，而在多数肿瘤细胞中能检测到端粒酶的活性。肿瘤的端粒长度很短，其继续缩短导致染色体融合、细胞死亡，而端粒酶的激活可以维持端粒的长度，维持肿瘤的继续分裂、增殖。端粒酶的表达可能是肿瘤形成和发展的共同途径。端粒酶与恶性肿瘤之间有相关性使之在肿瘤的诊断和治疗上有望成为新的靶目标。可以通过各种途径抑制端粒酶的活性有效抑制大多数肿瘤的生长，而对正常细胞没有影响。逆转录（reversetranscription)逆转录酶（reversetranscription)逆转录病毒的基因组复制过程乙肝病毒基因组的复制逆转录酶（reversetranscription)

1964年，Temin发现Rous肉瘤病毒等RNA病毒所造成的感染可被DNA合成抑制剂遏制。表明：RNA肿瘤病毒的RNA复制过程中要合成DNA。Temin又发现放线菌素D能抑制致癌RNA病毒的复制，但不能抑制一般RNA病毒的复制。表明：转录对于RNA病毒增殖是必需的。Temin提出前病毒假说：原病毒DNA是RNA肿瘤病毒在复制和致癌中的中间物。1970年，Temin在Rouse肉瘤病毒、Baltimore在白血病病毒中发现逆转录酶。多功能酶：1、RNA指导的DNA聚合酶活性2、RNA酶H（RNaseH）活性：水解RNA-DNA杂交体上的RNA3、DNA指导的DNA聚合酶活性：合成互补DNA。4、没有3`→5`外切酶活性。特点：含有Zn2+DNA合成反应要求有模板和引物。需适当浓度的二价阳离子（Mg2+、Mn2+）5’→3’→逆转录病毒的基因

组复制过程第一阶段：合成负股cDNA的大部分第二阶段：以负股DNA为模板合成一小部分正股DNA链。第三阶段：完成cDNA的全部复制。乙肝病毒基因组的复制其复制需通过逆转录过程经RNA中间体实现，其DNA聚合酶也是一种逆转录酶。逆转录病毒：RNA→DNA→RNA乙肝病毒：DNA→RNA→DNA试管内cDNA的合成常用于获得或研究真核生物基因的方法。提取某一种特定的mRNA，经逆转录生成的cDNA可代表某一特定基因。常用的逆转录酶有两种：来自鸟类成髓细胞瘤逆转录病毒称为AMV-RT；来自鼠白血病毒称为MMLV-RT。病毒RNA复制的主要方式1、病毒含有正链RNA，如灰质炎病毒。RNA（+）→蛋白质（酶）→RNA复制2、病毒含有负链RNA和复制酶如狂犬病毒。RNA（—）→RNA（+）→蛋白质、复制病毒RNA。3、病毒含有双链RNA和复制酶。如呼肠孤。双链RNA→RNA（+）→蛋白质→RNA（—）→双链RNA4、逆转录病毒。讨论题如何知道DNA复制中先要有RNA引物的合成？原料新合成DNA序列分析专一核酸酶水解某种病毒DNA的碱基组成（摩尔百分比）如下：

A=32；G=16；T=40；C=12

该病毒DNA的特点如何？简要说明怎样进行构建cDNA文库？组织培养的哺乳动物细胞S期长达5小时，经放射自显影测定DNA复制的速度是0.5微米/分，已知哺乳动物细胞DNA全长1.2米，计算染色体复制时共有多少复制叉在复制？8×103已知抹香鲸和猪的胰岛素具有相同的氨基酸序列，然而某些抗血清却能将它们区别开来，这岂不与“蛋白质的一级结构决定其高级结构”的理论相矛盾吗？你如何解释？将某种纯蛋白1mg进行氨基酸分析，得19.5ug的异亮氨酸（分子量=131.2），那么该蛋白质的最小分子量是多少？质粒DNA的提取与纯化1、细菌的培养2、细菌的收集与裂解3、质粒DNA的纯化：碱裂解法原理：在pH12.0~12.6的碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体变性，而共价闭环的质粒DNA仍为自然状态2023/12/28195核酸的体外扩增2023/12/28196第一节聚合酶链式反应polymerasechainreactionPCR2023/12/28197一、PCR的基本原理PCR的基本原理变性、复性、半保留复制PCR三步曲变性90～97℃退火45～55℃延伸72℃左右2023/12/281982023/12/28199二、PCR引物设计一对引物，与3′端互补长度：15～30个核苷酸碱基分布随机引物内、引物间不应有互补序列引物与非特异扩增区无同源性3′端必须互补5′端可游离2023/12/28200三、模板的制备DNA从细胞中提取DNA：血细胞、绒毛、尿样、毛发、精斑、口腔上皮细胞固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化RNA新鲜组织或细胞所用器皿和试剂必需经高温灭菌或DEPC处理2023/12/28201四、PCR的基本反应

（一）、以DNA为模板的反应：10×缓冲液10l

4种dNTP混合物各200

mol/L

引物各10～100pmol

模板DNA0.1～2

g

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加双或三蒸水至100l

2023/12/28202PCR反应五要素：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+TaqDNA聚合酶来自水生栖热菌Thermusaquaticus良好的耐热性Mg2+依赖性无校正功能2023/12/28203（二）、以mRNA为模板的反应mRNA5l5×Buffer4ldNTP2l(10mmol/L)RNasin1l(20u)AMVRTase1l(10u)Oligo(dT)12—18(或下游引物)1lddH2O6l/20l42℃水浴1小时，95℃水浴10分钟灭活逆转录酶。向上述反应体系中添加如下试剂：2023/12/2820410×Buffer5l25mmol/LMg2+

3lTaq酶0.5l（2.5u）上游引物1lddH2O20.5l/50l按PCR循环参数进行RT--PCR2023/12/28205（三）PCR产物的积累规律DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。反应初期，目的DNA片段呈指数形式（2n），随着目的DNA的积累，在引物—模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和—平台期。（25个循环）（四）PCR反应的自动化2023/12/28206五、PCR反应条件的控制（一）PCR反应的缓冲溶液提供合适的酸碱度和某些离子10～50mmol/LTris-HCl缓冲液50mmol/LKClBSA或明胶（二）镁离子浓度Taq酶活性需要Mg2+，Mg2+浓度过高导致非特异扩增。一般常用1.5mmol/L2023/12/28207（三）底物浓度dNTP浓度在20～200mol/L四种dNTP必须浓度相等（四）Taq

DNA聚合酶Taq

DNA聚合酶在70～80℃具有最高聚合活性2023/12/28208（五）引物引物浓度一般为0.1～0.5mol/L（六）反应温度和循环次数变性温度和时间95℃/30～60s退火温度和时间45～55℃/30～60s延伸温度和时间72℃循环次数25～30不超过352023/12/28209六、PCR中应注意的事项PCR反应中可能出现的问题：假阴性，不出现扩增条带假阳性出现非特异扩增带2023/12/28210（一）防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对照：阳性对照：阳性模板阴性对照：阴性模板试剂对照：除模板外的所有组分注意的事项：2023/12/28211七、PCR技术的主要类型㈠筑巢PCR㈥彩色PCR㈡多重PCR㈦原位PCR㈢不对称PCR㈧定量PCR㈣共享引物PCR㈨差异显示PCR㈤锚定PCR㈩重组PCR2023/12/28212PCR反应的特点特异性强：灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(

g=-6)水平简便、快速：PCR反应一般在2～4小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。2023/12/282134.对标本的纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。2023/12/28214第二节连接酶链反应LigasechainreactionLCR2023/12/28215一、LCR的基本原理LCR是以DNA连接酶将某一DNA链的5′磷酸与另一相邻链的3′羟基连接为基础的循环反应。2023/12/282162023/12/28217二、LCR产物的检测标记引物：放射性标记荧光素标记地高辛标记2023/12/28218三、影响LCR的重要因素㈠引物基因的突变位点长度足够㈡LCR的反应条件2023/12/28219第三节RNA的体外扩增

RNA—PCR2023/12/28220转录依赖的扩增系统(transcript-basedamplificationsystem,TAS)自主维持序列扩增或再生式序列复制（self-sustainedsequencereplication,3SR)核酸序列的扩增（nucleicacidsequence-basedamplification,NASBA）2023/12/28221

一、基本原理以RNA为模板在体外大量扩增RNA非循环相逆转录转录循环相聚合酶链式反应反应体系温度均一RNA产物以10的指数方式增加2023/12/282222023/12/28223酶：逆转录酶，RNaseH,T7RNA聚合酶引物：引物A—与RNA3′端互补，5′端含启动子引物B—与cDNA第一条链3′端互补底物：dNTP,NTP模板：缓冲液：RNA—PCR反应体系的组成2023/12/28224二、产物的检测三、RNA—PCR技术的特点及应用特点：扩增效率极高特异性强应用：检测RNA，RNA测序，临床诊断真核表达体系转染方法磷酸钙沉淀DEAE葡聚糖介导转染电穿孔脂质体转染；人造膜显微注射筛选标志

tk-NeorG418瞬时转染目的基因不整合进宿主基因组稳定转染目的基因整合进宿主基因组tk-

细胞突变株筛选转染细胞胸苷激酶（tk）TTP：从头合成（氨甲喋呤阻断），补救合成HAT选择（H：次黄嘌呤；A：氨甲喋呤；T：胸苷）tk+：生长tk-+带tk基因的质粒：生长药物筛选转染细胞neor新霉素：细菌抗生素，干扰原核生物蛋白质合成G418：干扰原核、真核生物neo：磷酸转移酶，使G418失活neo与目的基因连锁,转染目的基因的定点诱变及其应用基因定点诱变技术基因定点诱变技术的应用长效胰岛素、快速吸收胰岛素基因克隆的改建碱性成纤维细胞生长因子（bFGH）：牛源性→人源性，2个核苷酸的差异第九章DNA序列测定末端终止法--待测单链DNA模板引物四种dNTP(其中一种用32P/35S标记)终止剂(ddNTP)DNA聚合酶

Sanger发明：两次获得诺贝尔奖

分别得到ddAddTddGddC结尾的片段测序过程:1.模板与引物杂交2.引物的延长和合成阻断四个试管分别加入DNA聚合酶dNTP标记底物终止剂不同ddAddGddCddT四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链3.电泳ACGT次序高压电泳4.放射自显影得到直读图象第十章核酸分子杂交技术概念：具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程。探针待测核酸杂交分子核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本方法探针的标记核酸分子杂交的基本原理DNA变性方法热变性：90~100℃酸碱变性：常采用碱变性化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等特点：粘度增加、密度增加、增色效应、溶解温度(meltingtemperature,Tm)DNA复性或杂交(hybridization)DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等影响杂交的因素核酸分子的浓度和长度浓度大，复性快；分子量大，复性慢温度离子强度杂交液中的甲酰胺核酸分子的复杂性非特异性杂交反应预杂交：封闭非特异性杂交位点，用鲑鱼精子DNA分子杂交的基本方法Southern印迹法Northern印迹法斑点印迹杂交原位杂交Western印迹法液相杂交

bp—1534—994—

695—515—377—237

ABCM

Southern印迹杂交1975年，英国Southern创建DNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。Southern杂交(Southernbloting)的主要步骤待测DNA样品的制备、酶切待测DNA样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳凝胶中DNA的变性：碱变性Southern转膜：硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法探针的制备

Southern杂交杂交结果的检测Northern印迹杂交(Northernbloting)检测RNA（主要是mRNA）的方法与Southern杂交的不同靶核酸：RNARNA电泳转膜：不需变性斑点印迹杂交(dotbloting)将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上优点：简单、快速、可同时检测多个样品原位杂交(insituhybridization)将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。特点能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态核酸原位杂交的基本步骤细胞或组织的固定：载玻片组织细胞杂交前的预处理用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质探针的选择和标记杂交杂交结果检测Western

杂交印迹法(Westernbloting)检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法主要步骤：蛋白质样品的制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳蛋白质的电转移：NC膜靶蛋白的免疫学检测靶蛋白于第一抗体（一抗）反应与标记的第二抗体（酶标二抗）反应显色反应：酶促反应液相杂交核酸分子与核酸探针存在于杂交液中RNA酶保护分析法核酸酶S1保护分析法探针的标记探针的种类cDNA探针、基因组DNA探针、寡核苷酸探针、RNA探针标记物核素标记物（同位素标记）：32P、35S、3H等非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地高辛、荧光素等探针标记方法缺口平移法(nicktranslation)随机引物法(randomprimer)：六核苷酸残基的引物PCR标记法末端标记法探针的纯化Chapter2Structures&functionsofnucleicacid&protein

Nucleicacids

DNAStructures&functionsRNAStructures&functions

ProteinsInteractionbetweenbiopolymer

protein-proteininteractionDNA-proteininteraction第一节核酸生物大分子（biopolymer）

:

nucleicacid、protein、polysaccharose（多糖）。分子量：10~103kD一级结构：基本结构单位的排列顺序。

nucleicacid：

DNA（deoxyribonucleicacid）

RNA（ribonucleicacid）DNAStructures&functions

Primarystructure：DNA分子中核苷酸的排列顺序。Secondarystructure：双螺旋（doublehelix）三股螺旋（triplehelix）Tertiarystructure：超螺旋（supercoil）DNAprimarystructure

&function一级结构的基本特点：

两类核酸分子的组成比较嘌呤嘧啶核糖磷酸DNAA，GC，T脱氧核糖磷酸RNAA，GC，U核糖磷酸5’末端的磷酸基团3‘，5’-磷酸二酯键3‘末端羟基DNA携带的遗传信息

※有功能活性的DNA序列所携带的遗传信息。

※调控信息：能被各种蛋白质分子特异性识别和结合。DNA的甲基化（MythylationofDNA）原核生物：多为对一些酶切位点的修饰，作用是对自身DNA产生保护作用。真核生物：在基因表达调控中起主要作用。DNASecondaryStructures&functions

1、双螺旋结构（doublehelix）三股螺旋DNA（triplehelix）三链DNA（triplestrandsDNA，tsDNA）1957年由Felesnfeld及Davis首先发现。三条链均为同型嘌呤（homopurine，Hpu）或同型嘧啶（homopyrimidine，Hpy）。两种基本类型：

Pu-Pu-Py型：在碱性介质中稳定。

Py-Pu-Py型：在偏酸性介质中稳定。三链DNA既可以是B-DNA与另一条DNA链结合成的链间的三链DNA，又可以是B-DNA与其自身的一条链结合形成的链内的三链DNA。分子内三链DNA于1987年由Mirkin在超螺旋中发现。其形成要求双螺旋中存在连续的嘌呤或嘧啶序列，而且必须是镜像重复序列。

镜像重复序列：由反方向完全相同的两个序列组成。5′GGAATCGATCTTTTCTAGCTAAGG3′3′CCTTAGCTAGAAAAGATCGATTCC3′反转重复（invertedrepeated)：由反方向互补的两个DNA片段组成，两个反转重复序列又叫回文序列(palindromesequence)。镜像重复(mirrorrepeat)：由反方向完全相同的两个序列组成。直接重复(directrepeat)：由同一方向完全相同的两个序列组成。正向重复序列、顺向重复序列。DNA的三级结构——超螺旋（supercoil）

生物体闭环DNA都以超螺旋形式存在，如细菌质粒、病毒、线粒体DNA。线性DNA分子或环状DNA分子中有一条链有缺口时不能形成超螺旋。超螺旋的意义：紧密，体积更小；能影响双螺旋的解链程序，因而影响DNA分子与其它分子之间的相互作用。真核生物染色体三级结构：RNAStructures&functions

一、mRNA：messengerRNA二、tRNA：transferRNA三、rRNA：ribosomalRNA四、核酶（ribozyme）五、核内不均一RNA（heterogeneousnuclearRNA，hnRNA）六、小分子核内RNA（smallnuclearRNA，snRNA）七、反义RNA（antisenseRNA）mRNA

原核生物mRNA结构特点：1、多顺反子（polycistron）:一分子mRNA带有几种蛋白质的遗传信息，可以作为几种蛋白质的模板，能翻译出几种蛋白质。2、mRNA5′端无帽子结构,3′端一般无多聚A的尾巴。3、一般没有修饰碱基。每种顺反子是一个特异的翻译区；每个翻译区与核蛋白体之间有一个独立的结合部位；各个翻译区之间借一段无编码功能的核苷酸序列相连，5′端、3′端也有非编码区。真核生物mRNA结构的特点1、5′末端有帽子结构。2、3′端多数带有多聚A的尾巴(polyadenylatetail),其长度为20~200个A.3、分子中可能有修饰碱基,主要是甲基化.4、分子中有编码区与非编码区。非编码区（untranslatedregionUTR）位于编码区的两端；5′非编码区有翻译起始信号。tRNA：转运氨基酸1、单链小分子，含73~93个核苷酸。2、含有很多稀有碱基或修饰碱基。多为甲基化。3、5′端总是磷酸化，且常是pG。4、3′端为CCAOH。5、二级结构为三叶草形。6、三级结构为倒L型。rRNA原核生物真核生物核糖体70S80S小亚基30S40SrRNA16S(1542个核苷酸)18S（1874个核苷酸）蛋白质21种(占总重量的40%)33种（占总重量的50%）大亚基50S60SrRNA23S(2940个核苷酸)28S（4718个核苷酸）5S(120个核苷酸)5.85S(160个核苷酸)5S(120个核苷酸)蛋白质31种(占总重量的30%)49种(占总重量的35%)核糖体的组成原核生物16SrRNA3′端有一保守序列ACCUCCU，是mRNA的识别结合位点。原核生物5SrRNA43~47位核苷酸为CGAAC序列，可与tRNA上GTΨCG互补。真核生物5.8SrRNA上也有相同的CGAAC序列,是tRNA与rRNA相互识别、相互作用的部位。rRNA上有许多rRNA之间识别结合部位及蛋白质的相互作用部位。核酶：有催化活性的RNA1982年，美国ThomasCech在研究四膜虫rRNA自我剪接时发现，同时加拿大的SidneyAltman发现RNaseP分子中的RNA组分有催化活性；1989年分享了Noble化学奖。不仅拓宽了生物催化剂的领域，而且对RNA的生物学功能开创了一种历史性的新认识：RNA不仅具有储存和传递遗传信息的功能，而且还具有生物催化剂的功能，在一定程度上可以说，RNA一身兼有DNA和蛋白质两大类生物大分子的功能。核酶的二级结构对于催化活性很重要。Symons提出“锤头”（hammerhead）状二级结构。三个螺旋区；13（或11）个保守核苷酸序列。核内不均一RNA（hnRNA）真核细胞转录生成mRNA的前体。加工过程包括：5′加帽；3′端加尾；内含子的切除和外显子的拼接；分子内部的甲基化修饰作用；核苷酸序列的编辑作用。小分子核内RNA(snRNA)真核细胞核内一组小分子RNA,含70~300碱基,序列中尿嘧啶含量较高,因此又用U命名.既非任何RNA的前体,也非某种RNA代谢的中间产物,而是具有独特功能且独立存在的实体,参与mRNA的加工。常与多种特异的蛋白质结合在一起，形成小分子核内核蛋白颗粒（smallnuclearribonucleoproteinparticle，snRNP）反义RNA碱基序列正好与有意义mRNA互补的RNA，又称为调节RNA。可与mRNA配对结合形成双链，最终抑制mRNA作为模板进行翻译。还可作为DNA复制的抑制因子，与引物RNA互补结合抑制DNA复制，及在转录水平上与mRNA5′端互补，阻止RNA合成转录。可以人工合成反义RNA来调节基因的表达,用于疾病治疗。原核生物中也有一种mRNA干扰互补RNA（MrnainterferingcomplementaryRNA，micRNA），也可与特异mRNA结合并阻止翻译。核酸的酚抽提原理：交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性剂，更有效去除蛋白质。氯仿还可加速有机相与水相的分层。异戊醇：抑制界面泡沫的形成。标准程序：酚——酚-氯仿——氯仿。核酸的沉淀原理：核酸与钠、钾、镁形成的盐在许多有机溶剂中不溶，也不会变性。醋酸钠为沉淀DNA、RNA的最常用盐类。有机溶剂：乙醇、异丙醇、聚乙二醇。温度：冰水真核细胞RNA的提取纯化一个典型的哺乳动物细胞约含10-5μgRNA，其中80~85%为rRNA，mRNA为细胞总RNA的1~5%。制备高质量真核细胞RNA的关键是在抽提的最初步骤就需要抑制核糖核酸酶的活性，并避免所