大肠杆菌电转和文库扩增

科隆生物医学有限公司•大肠杆菌基因电转化（1）（制剂范围可以放大或缩小）保密感应态菌制备培养液和制剂：-无任何抗生素及含有氨苄青霉素/carbnicillin或其他适当抗生素的LB平板-2XLB或YT培养基500毫升-SOC培养基-冰冷的高压灭菌去离子水：1000毫升-冰冷的高压灭菌10%甘油（500毫升）-预冷却的50ml离心管，离心管和电转移杯。方法：1。 从一个新鲜的琼脂平板上接种单个大肠杆菌单菌落到含有5ml的2XYT培养基的烧瓶中。孵育培养5小时或过夜，于37^和250rpm旋转振荡器培养。2。 用5ml过夜的细菌培养物接种到在2升烧瓶中500毫升预热的2XYT培养基中。于37°C搅拌下（250转的旋转振荡器）。一个小时以后，每20分钟测定OD600值。3。 当培养物的OD600达到0.2.5-0.3，迅速将烧瓶转移到冰水浴中15-30分钟。偶尔转动培养瓶以确保冷均匀。4。 转移培养物至50ml冰冷的离心瓶。在4500rpm和在2C下离心10分钟，收获细胞倒出上清液和重悬细胞沉淀在50毫升冰冷的纯水并在2C下孵育3分钟。5。 通过在2C下离心10分钟收获细胞（4500rpm）,倒出上清液和重悬细胞沉淀在50毫升冰冷的纯水中并孵育3分钟。6。 通过在2C下离心15分钟收获细胞（4500rpm），倒出上清液和重悬细胞沉淀在25毫升冰冷的10%甘油中。7。 通过在2C下离心15分钟收获细胞（4500rpm），倒出上清液和重悬沉淀在10毫升冰冷的10%甘油。8。 通过在2C下离心15分钟收获细胞（4500rpm），小心地倒出上清液，并使用巴斯德吸管残余水滴。合并和重悬沉淀于1毫升冰冷的10%甘油。9。 测量1:100稀释的细胞悬浮液的OD600值：用冰冷的10%甘油稀释细胞悬液，然后测定。浓度应是210”到3x1010个细胞/ml OD=800-120（1.0OD600=约2.5x108细胞/ml）。10。 转移40微升的悬浮于冰冷的电穿孔杯中（0.1厘米间隙）并放电施加是否发生电弧（请参阅下文第12到18步）。如果是这样，用冰冷的10%甘油洗涤的细胞悬浮液的剩余部分再次，以确保细菌悬浮液的导电率足够低（＜5毫当量）。11。 如无电弧发生，就进行存储，分配所述40微升细胞悬浮液等份放入无菌的，冰冷的0.5-ml离心管，并立即转移到-80C的冰箱中。12。 加入10毫微克，容积不超1-3微升DNA到每个离心管，并在冰上孵育管60秒或以上。包括所有适当的阳性和阴性对照。质粒量为细胞体积不能达到十分之一。13。 设置电转仪提供的电容25mF，2.5千伏和200欧姆电阻的电脉冲。14。 转移DNA/细胞混合物倒入冷电比色皿，并确保细菌和DNA的悬浮坐在试管的底部。干燥凝结和湿气的反应杯的外侧。将试管中的电穿孔设备。15。 在上面设置中，释放一个4-5毫秒脉冲电力。12.5千伏/厘米的探测或磁场强度的时间常数应该在屏幕上显示。16。 尽可能快的脉冲后，取出电穿孔杯，在室温下，加入0.5mlSOC培养基。17。 将细胞转移到一个含有0.5毫升SOC的17X150毫米的聚丙烯管中，于37C下慢转动（250转）培养1小时.18。 涂0.5hml培养液、于抗菌素LB板上,370C下隔夜培养，检测转化效率.cDNA质粒文库扩增培养液和制剂：-质粒文库培养基：混合200毫升2xLB（pH值7.0）+0.4%超低胶凝温度的琼脂糖（SeaPrep品牌或其他）并分发50毫升于各200毫升烧杯中。高压灭菌后，允许LB+琼脂糖冷却至50^，并添加氨苄青霉素（或其他抗菌素），50微克/毫升，放置在37°C,并直至加入细胞。-质粒文库培养板（选择性）：4x150mm含有抗菌素的LB’平板方法：加3微升的DNA到冰冷40微升电感受态管中（菌落应10倍高浓度高于所需DNA）的管中。转移混合物到已在冰中0.1厘米电反应杯（己冷却了5分钟）.混合后，并在使用前并且擦干反应杯面上的冰和水。调节电转仪到25pF，200欧姆，2.5千伏.在上面设置中，释放一个4-5毫秒脉冲电力。12.5千伏/厘米的磁场强度（应该在屏幕上显示）；电穿孔后，然后立即加1毫升SOC培养基，并转移到含有1毫升的15毫升培养管和在37C培养1小时。（5.（选择性），混合10pL培养液和90微升SOC，并涂板（LB+入1^?），在37C孵化过夜。第二天，计数菌落每个平板，并确定其中的DNA稀释给出菌落的期望数目。）总库扩增：加入约480-500微升细胞到各个含有LB-抗菌素-琼脂糖的50毫升培养基，（或加入约480-500微升细胞到各个含有抗菌素的150mmLB’平板）将每个已经加了培养液的烧杯放在在冰水桶中一小时左右，让琼脂糖凝固。仔细转移到37C培养箱，没有任何晃动。培养两个晚上（44-48小时），应该看到的小菌落悬浮在LB+琼脂糖。确定菌落会下沉到试管底部（均相性）。使用中量质粒试剂盒纯化质粒&）倒入