SNT 1943-2007小麦中转基因成分PCR和实时荧光PCR定性检测方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准小麦中转基因成分PCR和实时荧光PCR定性检测方法国家质量监督检验检疫总局ISN/T1943—2007本标准的附录A为规范性附录。本标准由中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、中国检验检疫研究院负责起草。本标准中如涉及国内已申请的专利，专利持有人声明放弃在中国境内的使用。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。1SN/T1943—2007小麦中转基因成分PCR和实时荧光PCR定性检测方法本标准规定了小麦中转基因成分PCR和实时荧光PCR检测方法。本标准适用于小麦中转基因成分PCR和实时荧光PCR的定性检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡注明日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修计版均不适用于本标准，然商，戴励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新肢本适用于本标准。3.1术语和定义下列术语和定义适用于木标准。将物种本身不具有的、来源于其他物种的功能DNA序列，通过分子生物学手段导入，使其在该物种中表达，以便该物种获得新的性状特征。物种本身不具有的、而是来源于其他物种的功能基因序列。在转基因作物基囚组中拷贝数恒定的、不显示等位基因变化的、在其他品种作物中不存在的基因。该基因即可用于评价样品中是否存在该作物品种，也可作为参照基因存列对某一目的基因进行定量检测，同时还可确定DNA提取是否成功、并验证TCR反应体系中外源基因exogenousgene利用生物工程技术转入的其他生物基因，使该生物品种表现新的生物学性状。下列缩略语适用于本标准。3.2.1bar:phosphinothricinacetyltransferasegenefromBacillusamyloliquefacions,来源于杆菌Bacillusamyloliquefacions草丁膦乙酰转移酶基因。3.2.3GAG56D:triticmaestivumpartialGAG56Dgeneforgamma-gliadin,小麦醇溶蛋白基因(Gene-3.2.4NAC:noamplificationcontrol,阴性对照。23.2.5NOS:terminatorofnopalinesnthasegenefromAgrobacteriumtumefaciens,来源于农杆菌的3.2.7Ubiquintin:玉米泛素蛋白基因启动子3.2.8uidA:betaglucuronidase(GUS)reportergenefromE.coli,大肠杆菌转β-葡糖苷酶基4防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照SN/T1193中的规定执行5抽样和制样7.1CTAB裂解液：3%CTAB(质量分数),1.4mmol/L氯化钠，0.2%(体积分数)巯基乙醇，20mmol/L,EDTA,100mmol/LTris-HCl,pH8.0,7.2TE缓冲液(pH8.0);量取10mL1mol/LTris-Cl(pH8.0)和2mL0.5mol/LEDTA(pH8.0),加水定容至1000mL,分装后高压灭菌备用。酸镁(MgSO₄),200mmol/LTris-HCl(pH8.8),1%TritonX-100,1mg/mLBSA。7.1070%乙醇。7.14DNA:分子量标记100bp～2000bp。37.1710×上样缓冲液：含0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF,30%甘油水溶液。8.1基因扩增仪。8.2电泳仪。8.3电泳槽。8.7高压灭菌锅。8.9冷冻离心机。8.11微波炉。8.16超净工作台。8.17超纯水器。9检测方法9.1小麦基因组DNA的提取称取0.2g粉碎后的小麦样品于2mL离心管中，加人1mLCTAB裂解液，混匀，65℃水浴保温30min,不时振荡；12000r/min离心5min;小心取离心上清液，加入等体积的三氯甲烷/异戊醇(体积分比24:1)混匀，静止5min,12000r/min离心5min;取离心上清液，再加入等体积的三氯甲烷/异戊醇(体积比24:1)混匀，静止5min,12000r/min离心5min;取离心上清液加0.65倍体积的异丙醇，混匀，12000r/min4℃离心10min;弃上清液，加500μL70%冰乙醇洗涤一次，12000r/min4℃离心5min;弃上清液，将沉淀晾干，加入50μLTE,溶解沉淀(4℃过夜，或37℃保温1h);4℃保存备用。每个实验室样品应制备两个测试样品和提取空白对照同时提取DNA。9.1.2试剂盒法小麦总DNA的提取也可使用相应市售DNA提取试剂盒。9.2核酸纯度和浓度的定量样品中提取的DNA做适当稀释，放入紫外分光光度计的比色杯中，于260nm处测定其吸收峰，1OD₂m=50μg/mL双链DNA或38μg/mL单链DNA。紫外分光光度法检测核酸浓度的最佳范围是2pg/mL～50PCR级DNA溶液的ODzgmm/OD2mm的比值为1.7～2.0。pg/mL,OD值应该在0.05～1范围内。4阴性对照(NAC):以非转基因小麦DNA为模板。阳性对照：采用含有目的基因序列的转基因小麦DNA为PCR反应的模板，或采用含有目的基因序列的质粒。9.4.1PCR反应体系和反应参数PCR反应体系和参数见附录A中表A.3、表A.4。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当的调整。每个反应体系应设置两个平行反应。9.4.2PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测将适量10×TAE稀释成1×TAE溶液，配制溴化乙锭含量为0.5μg/mL的1%～2%琼脂糖凝测试样品都应该被扩增出102bp(或128bp)的PCR产物。如末见有HQR扩增，则说明在DNA提取9.4.3.2小麦中转基因成分检测样品检测为阳性结果时需要用实时荧光PCR来确证9.5实时荧光PCR定性检测9.5.1实时荧光PCR反应体系及反应参数实时荧光PCR反应体系和参数见时录A中表A.5/反应体系中各武剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当的调整。每个反应体系应设自两个平行反应。9.5.2实时荧光PCR结果判定9.5.2.2实时荧光PCR结果判定测试样品内源基因检测Ct值小于或等于36,外源基因检测Ct值大于或等于40,判断该样品不含所检的外源基因。测试样品内源基因检测Ct值小于或等于36,外源基因检测Ct值小于或等于36,判断该样品含有所检的外源基因。测试样品外源基因检测Ct值在36～40之间，应调整模板浓度，重做实时荧光PCR。再次扩增后5的外源基因Ct值仍小于40,且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常则可判定为该样品检出×××基因。再次扩增后的外源基因Ct值大于或等于40,且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常则可判定为该样品未检出×××基因。9.6结果表述该样品未检出×××基因。该样品检出×××基因。6(规范性附录)小麦中转基因成分PCR定性检测方法参照表被检测基因基因末源引物序列扩增长度/bpNOS外源5'-gaatcctgttgccggtcttg-3'5'-ttatcctagtttgegcgcta-3'外源5'-gtctgcaccategtcaacc-3'5'-gaagtccagetgccagaaac-3'5'-acaagcacggtcaacttcc-3'5'-actcggccgtecagtcgta-3'uidA外源ubiquitin'外源5'-aacactggcaagttagcaat-3'5'-cegtaataaatagacaccc3'GAG56D小麦属内源5'-cccaacaacaaccaccgttca-3'5'-tggccctggacgagagtacct-3'Wx012小麦种内源5'-gtcgcgggaacagaggtgt-3'5'-ggtgttcctccattgcgaaa-3'aubiquitin只可用于不含玉米成分的多组分小麦样品和单一组分小麦样品的筛选基因。表A.2实时荧光定性PCR检测小麦内外源基因的引物和探针序列被检测基因基因来源引物序列探针序列扩增长度/bpGAG56D小麦属内源5'-caacaattttetcagecccaaca-35'-ttcttgcatgggttcacctgtt-3'5'-ttcccgcagecccaacaaccgc-3'Wx012小麦种内源5'-gtcgcgggaacagaggtgt-3'5'-ggtgttcctccattgcgaaa-3'5'-caaggcggccgaaataagttgcc-3'bar外源5'-acaagcacggtcaacttcc-3'5'-acteggcegtecagtegta-3'5'-cegagccgcaggaaccgcaggag-3'ubiquitin*外源5'-gtecagaggcagcgacaga-3'5'-tgccgtgccgtctgcttegcttg-3'NOS外源5'-atcgttcaaacatttggca-3'5'-attgcgggactctaatcata-3'5'-categcaagaccggcaacagg-3'注：探针的5'端标记FAM荧光报告基团，3'端标记TAMRA等荧光淬灭基团。aubiquitin只可用于不含玉米成分的多组分小麦样品和单一组分小麦样品的筛选基因。试剂名称储备液浓度加入体积/μL.氯化镁(MgCl₂)引物(上游、下游)注：反应体系中各试剂的量可根据反应体系的总体积进行适当调整。表A.4小麦内外源基因定性PCR检测的反应参数被检测基因预变性循环数后延仲bar94℃,5min94℃,30s:58℃,40s;72℃,1.5min72℃,10minNOS94℃,3min94℃,20s;54℃,40s;72℃,1min72℃,3minuidA94℃,5min94℃,1min;62℃,1min;72℃,1.5min72℃,10minubiquitin94℃,5min94℃,30s;54℃,30s;72℃,1min72℃,10minWx01295℃,10min95℃,30s;63℃,30s;72℃,30s72℃,7minGAG56D94℃,5min94℃,30s;61℃,1min;72℃,1.5min72℃,10min注：PCR反应循环参数可根据基因扩增仪器型号的不同进行适当调整。试剂名称加入体积(pL)氯化镁(MgCl₂)(25mmol)2.5mmol/LdNTP(含dUTP)(2.5mmol)0.2mmol/LUNG酶(5U/μL)上游引物(10pmol/μL)0.2pmol/μL下游引物(10pmol/μL)0.2pmol/μL探针(5μmol/L)0.2pmol/μLTaq酶(5U/μL)补水至试剂名称加入体积(μL)反应参数二步法(适合ABI仪器)预变性95℃/3min,1个循环；95℃/15s,60℃/60s,40个循环三步法(只适合LightCycler仪器)预变性95℃/10min,1个循环；95℃/5s,50℃/5s,60℃/20s,4