ikaros6在急性白血病中的表达和临床意义

第一部分

IKAR0S6在急性淋巴细胞白血病中的表达和临床意义目的：

本研究旨在探讨初发成人急性淋巴细胞白血病(acutelymphoblasticleukemia■ALL)患

者中Ikaros6的发生率，重点研究Ikaros6与其它分子标志之间的关系以及对预后的影

响。

方法：收集从2006年9月到2013年6月，179例(B-ALL为105例，T-ALL为74例)

初治成人ALL骨髓•分离骨髓单个核细胞并提取RNA•采用逆转录聚合酶链反应

(RT-PCR)获得cDNA，进行聚合酶链反应(PCR)，反应产物连接载体进行测序分析，

确定Ikaros6序列的正确性。用Genescanning和实时定量PCR(Real-timePCR)动态监

测初诊、部分缓解'完全缓解、复发四个时间点的BCR-皿和Ikaros6表达水平。此

外，分析Ikaros6阳性患者临床特征，与其它分子标志之间的相关性以及对预后的影响。

结果：在179例成人ALL患者中，检测到53例(29.61%)表达Ikaros6•其中105

例B-ALL患者中检测到37例Ikaros6阳性(35.24%)­74例T-ALL患者中检测到16

例阳性(21.62%)。在B-ALL中•Ikaros6阳性患者主要分布在commonB-ALL亚型

(24of37,64.86%)。染色体核型分析发现阳性患者主要集中在高危核型(23of37,

62.16%)­尤其是Ph染色体(17of37,45.95%)•并且Ikaros6与BCR-ABL1(P=

0.011)'髓系相关抗原(尸=0.032)的表达密切相关°利用Genescanning和Real-time

PCR动态监测患者诊治过程中BCR-ABL1和Ikaros6的表达水平，发现两者具有相同

变化趋势。生存分析发现Ikaros6独立于8CR-48ZJ和髓系相关抗原，提示不良预后

和高复发风险。COX风险比例模型表明Ikaros6可作为一个独立的因素评估B-ALL

患者的预后(OSP=0.043,HR=1.905；EFSP=0.044,HR=1.822；RFSP=0.002,

HR=4.992)。

在T-ALL中•Ikaros6主要表达于medullaryT-ALL亚型(8of16,50.00%)•而

与pro-T-ALL亚型存在显著的负相关性(P=0.036)。另外，在16例Ikaros6阳性患

者中，有10例(62.50%)发生髓外浸润,明显高于阴性患者(34.48%)•差异存在统

计学意义（P=0.043》Ikaros6对T-ALL患者的生存也有明显不良影响，总生存期（P

=0.032）和无事件生存期（尸=0.014）显著缩短，缓解后更容易复发（RFS,尸=0.011）。

结论：Ikaros6在成人急性淋巴细胞白血病中表达率较高•无论在B-ALL中，还是在

T-ALL中，Ikaros6阳性患者均具有一定的临床特征。Ikaros6、BCR-ABL1'髓系相关

抗原三者之间存在显著相关性,但Ikaros6独立于和髓系相关抗原，提示

高复发风险。因此，Ikaros6可作为成人急性淋巴细胞白血病分层治疗和评估复发风险

的理想指标。

关键词：Ikaros6；急性淋巴细胞白血病；临床意义

ExpressionandClinicalSignificanceofIKAROS6isoformin

acutelymphoblasticleukemiapatients

Objective:ThepurposeofthestudywastoinvestigatetheexpressionofIkaros6inadult

acutelymphoblasticleukemia(ALL)•Moreover,thisstudyfocusedontherelationship

betweenIkaros6andothermolecularmarkers,aswellasprognosticvalueofIkaros6.

Methods:WeexaminedtheexpressionofIkaros6inbonemarrowfrom179denovo

patientswithALL(B-ALL,n=105andT-ALL,n=74)fromSep2006toJul2013.RNAwas

extractedfrommononuclearcellsofbonemarrow,andthentheexpressionofIkaros6was

detectedbyreversetranscription-PCR,andconfirmedtheresultsbygenescanningand

sequencing.TheexpressionofBCR-ABL1andIkaros6weredynamicallymonitoredby

genescanningandreal-timePCRfrominitialdiagnosistorelapse.Furthermore,we

analysedtheclinicalfeatureofpatientspositiveforIkaros6,therelationshipbetween

Ikaros6andothermolecularmarkersandprognosticsignificanceofIkaros6inALL.

Results:Inthetotalof179adultpatientswithALL(B-ALL,n=105andT-ALL,n=74),

Ikaros6wasobservedin53patients(29.61%),Amongthem,37of105caseswithB-ALL

(35.24%)and16of74caseswithT-ALL(21.62%)weredetectedIkaros6.InB-ALL,

Ikaros6waspredominantlyfoundinthecommonB-ALLsubtype(24of37,64.86%).

Ikaros6wasprincipallyfoundinhigh-riskgroup(23of37,62.16%),especiallyincasesof

Ph+ALL(17of37,45.95%).Ikaros6wasfoundtobeassociatedwithBCR-ABL1(P=

0.011)significantly.Moreover,theexpressionpatternsofBCR-ABL1andIkaros6were

similarfrominitialdiagnosistorelapse.PatientspositivefbrIkaros6,26of37(70.27%)

expressedmyeloid-associatedantigensandtherewasasignificantassociationbetween

Ikaros6andmyeloid-associatedantigens(P=0.032).Thus,therewasclosecorrelation

betweenBCR-ABL1,myeloid-associatedantigensandIkaros6.However,Ikaros6was

associatedwithincreasedriskofrelapse,whichwasindependentofBCR-ABL1and

myeloid-associatedantigens.InmultivariableCoxanalysis,Ikaros6wasanindependent

prognosticmarkerfbroverallsurvival(P=0.043,hazardratio=1.905),event-freesurvival

(P=0.044,hazardratio=1.822)andrelapse-freesurvival(P=0.002,hazardratio=

4.992).

In74T-cellpatients,Ikaros6wasprincipallyfoundinmedullaryT-ALLsubtype(8of16,

50.0%),moreover,itwasfoundnegativelycorrelatedwithpro-T-ALL(P=0.036).

Extramedullaryinfiltrationoccurredin10of16(62.50%)patientspositivefbrIkaros6,

whichwasmorefrequentlythancasesnegativefbrIkaros6(34.48%),andthedifference

hadstatisticalsignificance(P=0.043).Meanwhilethesehadinferiorsurvival(OS,P=

0.032;EFS,P=0.014)andincreasedriskofrelapse(RFS,P=0.011)ascomparedwiththe

Ikaros6-negativepatients.

Conclusion:TheincidenceofIkaros6washighinadultALLpatients.Patientspositivefor

Ikaros6weremorelikelytohavesomeclinicalfeatures.Ikaros6wascloselyrelatedto

BCR-ABL1andmyeloid-associatedantigens,butIkaros6predictedworseRFSwas

independentonotherprognosticfactors.ThusIkaros6mayserveasavaluablefactorfor

riskstratificationandprognosisevaluationinadultALL.

Keywords:Ikaros6,acutelymphoblasticleukaemia,clinicalsignificance

、，—1—

月US

急性淋巴细胞白血病(Acutelymphoblasticleukaemia■ALL)是一种异质性明显

的血液系统恶性疾病。通过有效的个体化治疗和日趋完善的支持治疗，ALL治愈率可

达80%⑴，但是仍有超过20%患者在初次治疗后出现复发⑵。既往评估ALL风险分

级主要是根据包括亚二倍体、超二倍体't(9;22)等在内的染色体异常和MLL基因

重排等，治疗失败多见于BCR-ABL1阳性和MLL基因重排阳性的患者，而疾病复发

却没有标志性的细胞遗传学异常。人类全基因组分析发现在ALL患者中存在大量重

现性基因改变【36］，其中超过40%的基因突变对B淋巴细胞的发育有重要的转录调控

作用⑶"KZ"就是这样一类基因，其编码转录因子Ikaros在淋巴细胞的发育过程中

发挥重要作用。

Ikaros作为Kruppel家族成员之一，是具有DNA结合能力的"锌指"样蛋白。

Ikaros6作为一种显著负性剪接变异体不能结合DNA­却能够与其它剪接变异体相互

作用进而干扰结构完整的Ikaros与DNA结合•降低Ikaros蛋白活性阳°】。早期研究

关注IKZF1基因的缺失，尤其是Ik6等显著负性剪接变异体在儿童ALL患者中的发

生率及其对预后的影响口“⑶。Sun等研究发现94%的T-ALL和100%的B-ALL都表

达无DNA结合能力的Ikaros剪接变异体网。Mullighan等报道在83.7%ALL患者中

存在IKZF1基因异常，并且认为显著负性剪接变异体对白血病的发展有重要的影响

⑸。动物实验发现：在小鼠模型中-Ikaros缺失会促进T细胞淋巴瘤/白血病的发生

发展,提示Ikaros发挥重要的抑癌作用口°，山。随着研究深入，显著负性Ikaros剪接

变异体同样能够阻碍人类淋巴细胞正常发育，促进白血病发生和发展区凹。

在B-ALL中•Ikaros6和BCR-ABL1之间存在显著的相关性0°，川，与此同时，

一些研究表明IKZF1缺失与8CR45ZJ阴性患者发病密切相关，并且同样提示不良预

后〔小以⑸。最新研究认为IKZFI异常可以作为一项可靠指标用来监测微小残留病变

(minimalresidualdisease,MRD)〔的，并且与高复发风险显著相关口，5,⑸。此外,研

究发现约30%-87%的ALL患者表达髓系相关抗原"2"，并且髓系相关抗原与

BCR-ABL1存在相关性口7,电22］。虽然髓系相关抗原对ALL预后的影响仍存在争议

[|8-21]，但大多数研究表明其提示不良预后口%2。〕。在ikaros6'8CRZ8A/和髓系相关

抗原这三个因素中­Ikaros6与BCR-ABL1密切相关­而BCR-ABL1与髓系相关抗原存

在相关性，所以Ikaros6与髓系相关抗原之间可能也存在关联。

本研究检测成人ALL患者Ikaros6的表达并分析临床特征•探索性分析Ikaros6'

BCA-ZEJ和髓系相关抗原之间的相关性­进一步明确Ikaros6对预后的影响。

材料和方法

-'病例选择及临床资料收集

武汉同济医院血液科2006年9月至2013年6月初诊的成人ALL患者其中B-ALL

为105例­T-ALL为74例•年龄＞16岁，诊断根据MICM诊断体系,即骨髓细胞形

态学（Morphology,FAB）'流式免疫分型（Immunology）、细胞遗传学（Cytogenetics）

和分子生物学（MolecularBiology），同时收集整理初诊时血常规等临床资料以及跟踪

整理随访资料。

二'主要试剂

红细胞裂解液（北京Solarbio公司）；淋巴细胞分离液（天津市潮洋公司）；PBS

缓冲液（自配）；1640培养基（美国Thermo公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；

Trizol试剂（加拿大Fermentas公司）；氯仿；异丙醇；无水乙醇；DEPC水（自配）；

DNA提取试剂盒（美国QIAGEN公司）；LATaq（日本TaKaRa公司）；2'EasyTaqPCR

Supermix（美国Thermo公司）；KOD酶（日本TaKaRa公司）；GeneScan1M-500LIZ

（美国ABI公司）；Hi-Di1MFormamide（美国ABI公司）。三'主要仪

器

台式低速离心机及低温高速离心机（德国Sigma公司）；PCR仪（德国Biometra

公司和美国ABI公司）；电泳仪（东洋纺公司）；电子天平（MettlerToledo公司）；

凝胶成像系统（Syngene公司）；-80℃低温冰箱（德国Harrs公司）；曝光系统

（美国Bio-red公司）；基因分析仪3500（美国ABI公司）；恒温振荡培养摇床

（中国电子器件工业总公司）；NANOdrop2000C（美国Thermo公司）。

四、方法

1.分离骨髓标本中的单个核细胞

(1)准备人淋巴细胞分离液(4℃避光保存，复温至37℃使用)，红细胞裂解液(4℃

保存•复温至37℃使用)­IxPBS溶液•无菌超净工作台•银子•15ml离心

管，滴管，无菌手套等。

(2)向15ml离心管内加入复温至37℃的淋巴细胞分离液。

(3)按1:1体积比例，将标本缓慢加入淋巴细胞分离液­室温下，2500rpm离心

20min。此时液体由上至下可分为4层，其中第二层乳白色环状物为分离获得

的单个核细胞。

(4)用滴管吸取单个核细胞层，并转移至另一个15ml离心管内。若分离效果佳•

可直接进行步骤(6)，若分离效果不佳，进行步骤(5)。

(5)向离心管内加入ImllxPBS溶液，轻柔吹打混匀，按1:3体积比例加入复温至

37℃的红细胞裂解液•吹打混匀静置5min■室温下，1200rpm离心5min0

(6)弃上清•加入5mlIxPBS溶液清洗一次,显微镜下计数­室温下，1200rpm离

心5min。

(7)弃上清，加入适量IxPBS溶液将细胞密度调整为"1()6个/ml，分装至1.5mlEP

管，室温下，1200rpm离心5min•弃上清后储存于-80℃冰箱。

2.RNA提取及逆转录PCR

(1)向装有患者骨髓标本的1.5mlEP管加入ImlTrizol试剂，充分吹打混匀•室温

静置5-10min°

(2)向上述L5mlEP管中加入0.2ml氯仿，充分颠倒震荡­室温静置lOmin，4℃低

温112000rpm离心15min°

(3)离心后可见液体分为上层水相和下层有机相，中间可见白色絮蛋白。小心吸取

上层水相0.4ml转移到另一个新的1.5mlEP管内。

(4)按照1:1体积比例加入异丙醇，充分震荡混匀并静置lOmin后，4℃低温，

12000rpm离心lOmin°

(5)小心吸弃上清,加入1ml75%乙醇洗涤一次■4℃低温■12000rpm离心5min°

(6)小心吸弃乙醇，将沉淀置于室温下风干。

(7)按沉淀大小加入适量的DEPC水，取1g使用NANOdrop2000C测定RNA浓

度。

(8)向0.2mlPCR管中加入

RNA2gg

OligodTIgl

用DEPC水补足至12gl•混匀后•65℃变性5min­立即置于冰浴中5min。

(9)立即向PCR管中加入

5xBuflfer4|il

dNTP2gl

RiblockRI1pl

RevertAidRT1pil

震荡混匀•25℃反应5min-42℃反应Ih•70°C反应5min■反应结束后置于

-80℃冰箱保存。

3.Ikaros6检测

(1)引物：

上游：5'-ATGGArGCTGATGAGGGTCAAGAC-3'下游：5'-

GATGGCTTGGTCCATCACGTGG-3'

(2)分别将上下游引物配成100pmol/gl的储存液•再配成lOpmol/可的工作液。

(3)PCR反应体系：

ddH2O19.2川

lOxLAPCRBuffer2.5gl

lOmMdNTPIgl

Primers1pl

TaKaRaLATaq0.3ul

cDNAl|il

(4)PCR反应条件：

95℃3min

95℃30s

62℃30s35个循环

72℃50s,

72℃lOmin

4℃保存

(5)取4glPCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳­进行凝胶成像系统采图分析。

4.Ikaros6目的片段纯化后与pGM-T载体连接、转化及蓝白斑筛选

(pEASY-T1SimpleCloningKit步骤)

4.1RT-PCR产物切胶回收纯化

(1)取100WPCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后在紫外线照射下切取目的条带•

计算胶条的质量并放入L5mlEP管中-按照每100mg胶条加100口1BindingBuffer的

比例加入适量BindingBuffer°

(2)将EP管置于50-60℃水浴锅中孵育10min•每隔几分钟振荡混匀一次­直至

胶条完全溶解，转移至GeneJETpurificationcolumn°

(3)因目的片段＜500bp•向上述混合液中按1:2体积比例加入100%异丙醇­震

荡混匀。

(4)将上述溶液转移至GeneJETpurificationcolumn中•室温下，12000rpm离心1

min1弃去废液。

(5)向GeneJETpurificationcolumn中力□人700plWashBuffer,室温下,12000rpm

离心1min■弃去废液。

(6)将上述GeneJETpurificationcolumn再次室温12000rpm离心1min,以便去除

残余的WashBuffer。打开盖子■室温下放置2-3min。

(7)将GeneJETpurificationcolumn转移到—新的干净的1.5mlEP管中，悬空加

入50(1LElutionBuffer•室温下孵育2-3min后112000rpm离心1min■收集到的液体

即为切胶纯化后的PCR产物。

4.2连接反应体系：

切胶纯化后的PCR产物0.5-4gl

pEASY-T1SimpleCloningVector1gl

轻轻混合，37°C反应5min-后将其置于冰上。

4.3连接产物的转化

(1)将连接产物加入50WTransl-Tl感受态细胞中，轻弹混匀•冰浴20-30min。

(2)42℃热激30s•立即置于冰上2min。

(3)加入250ulSOC/LB溶液(室温)-200转•37℃孵育lh。

(4)取即1500mMIPTG和40^120mg/mlX-gal混合后均匀涂抹于琼脂糖培养板上•

37℃放置30min°

(5)待IPTG和X-gal被吸收后，取200^1菌液铺板，培养过夜。

4.4蓝白斑筛选

挑选培养板上的白色菌落­在含氨节青霉素的液体LB培养基中，37℃培养过夜。

挑取5个克隆测序。

4.5测序

用M13F和R引物测序，进行正反向测序分析(深圳华大基因公司武汉分公司)，

DNAbaser3.0软件分析核甘酸序列。

5.Genescanning检测

Genescanning检测IKZF1基因A4-7

(1)引物：参考Caye等研究中的引物网»A4：

5'-TGTGAAGGTCACACCTCTG-3'A7:5'-

AAAGAACCCTCAGGCATTCA-3'GL：5'-

CACCTTGTGGTCCAGGCTA-3'

(2)分别将上下游引物配成100pmol/gl的储存液•再配成10pmol/gl的工作液。

(3)PCR反应体系：

ddH2O19.2gl

lOxLAPCRBuffer2.5|il

lOmMdNTPIgl

Primersmixture1pl

TaKaRaLATaq0.3ul

DNA

(4)PCR反应条件：

95℃4min

95℃30s1

60℃30s35个循环

72℃Imin

72℃4min

4℃保存

(5)PCR产物置于4°C冰箱储存•待上机检测。

Genescanning检测Ikaros6

(1)引物：

上游：5'-ATGGATGCTGATGAGGGTCAAGAC-3'

下游：5'-GATGGCTTGGTCCATCACGTGG-3'

(2)分别将上下游引物配成100pmol/pil的储存液，再配成lOpmol/似的工作液。

(3)PCR反应体系：

ddH2O19.2川

10xLAPCRBuffer2.5M1

lOmMdNTPIjil

PrimersmixtureIpl

TaKaRaLATaq0.3ul

cDNAIjil

(4)PCR反应条件：

95℃3min

95℃30s

62℃30s35个循环

72℃50s

72℃lOmin

4℃保存

(5)PCR产物行纯化(步骤同前所述)。

Genescanning上机检测

(1)反应体系：

切胶纯化后的PCR产物1位

Hi-Di™Formamide10四1

GeneScan™-5OOLIZ0.5gl

(2)变性：

95℃5min

4℃5min

(3)ABI3500上进行毛细管电泳。

6.BCR-ABL1的检测

(1)引物：

上游1：5'-GCTTCTCCCTGACATCCGTG-3'下

游1：5'-CGAGCGGCTTCACTCAGACC-3'上游

2:5'-CGCATGTTCCGGGACAAAAGC-3'下游2：

5'-CGAGCGGCTTCACTCAGACC-3'

(2)分别将上下游引物配成100pmol/gl的储存液,再配成lOpmol/诅的工作液。

(3)PCR反应体系：

lOxPCRBuffer2.5位

ddH2O18.2川

Primersmixture皿

MgCL皿

dNTP1口1

cDNA山1

Taq酶0.3g1

(4)PCR反应条件：

95℃15min

95℃30s

60℃45s35个循环

72℃Imin

72℃7min

4℃保存

(5)取4glPCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳­进行凝胶成像系统采图分析。

7.E27-P5XZ的检测

(1)引物：

上游：5'-CACCAGCCTCATGCACAAC-3'下游：5'-

TCGCAGGAGATTCATCAGG-3'

(2)分别将上下游引物配成100pmol/pl的储存液•再配成10pmol/|il的工作液。

(3)PCR反应体系：

2xEasyTaqPCRSupermix10(11

ddH2O8pl

Primersmixture1gl

cDNAl|il

(4)PCR反应条件：

94℃5min

94℃30s1

65℃imin35个循环

72℃Imin，

72℃lOmin

4℃保存

(5)取4MPCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳­进行凝胶成像系统采图分析。

8.MLL-/E/的检测

(1)引物：

上游：5'-CCGCCTCAGCCACCTAC-3'

下游：5'-TGTCACTGAGCTGAAGGTCG-3'

(2)分别将上下游引物配成lOOpmol/山的储存液，再配成lOpmol/pil的工作液。

(3)PCR反应体系：

2xEasyTaqPCRSupermixlOjil

ddH2O8m

Primersmixture1|xl

cDNAIgl

(4)PCR反应条件：

94℃5min

94℃30s、

65℃Imin35个循环

72℃Imin，

72℃lOmin

4℃保存

(5）取4R1PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，进行凝胶成像系统采图分析。

TEL-AML1的检测

(1)第一轮引物：

上游：5'-TGCACCCTCTGATCCTGAAC-3'

下游：5'-AACGCCTCGCTCATCTTGC-3'

第二轮引物：

上游：5'-AAGCCCATCAACCTCTCTCATC-3'

下游：5'-TGGAAGGCGGCGTGAAGC-3'

(2)分别将上下游引物配成100pmol/gl的储存液•再配成10pmol/Ml的工作液。

(3)第一轮PCR

反应体系：

2xEasyTaqPCRSupermix10g!

ddH2O8gl

PrimersmixtureIgl

cDNA1M1

PCR反应条件：

94℃5min

94℃30s

65℃Imin35个循环

72℃Imin

72℃lOmin

4℃保存

(4)第二轮PCR

反应体系：

2xEasyTaqPCRSupermixlOgl

ddH2O7M

Primersmixture2gl

第一轮PCR产物Igl

PCR反应条件：

94℃5min

94℃30s

65℃Imin35个循环

72℃Imin

72℃7min

4℃保存

(5)取4MPCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳­进行凝胶成像系统采图分析。

10.SIL-TAL1的检测

(1)引物：

上游：5'-TCCCGCTCCTACCCTGCAA-3'

下游：5'-CGCGCCCAGTTCGATGAC-3'

(2)分别将上下游引物配成100pmol/gl的储存液•再配成lOpmol/gl的工作液。

(3)PCR反应体系：

2xEasyTaqPCRSupermix10pl

ddH2O8gl

Primersmixture1|il

cDNA1M1

(4)PCR反应条件：

94℃5min

94℃30s1

65℃Imin35个循环

72℃Imin

72℃lOmin

4℃保存

(5)取4川PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳­进行凝胶成像系统采图分析。

11•流式细胞仪检测髓系相关抗原

(1)向190诅10%冰乙酸中加入10gl骨髓细胞计数将白细胞计数调整为(1.0-2.0)

X105/L»

(2)转移至流式管中，按抗体说明书向骨髓样品中加入髓系相关表面抗原标记

(CD13/CD33/CD15/MPO)12孤­置于室温避光孵育15-30min。

(3)加入0.5mlBeckmanCoulter,充分混匀,室温下,避光孵育10~15min°

(4)室温下11200rpm离心5min•弃上清后加入1ml1xPBS溶液洗涤一次，振

荡混匀。

(5)重复上述步骤，洗涤一次。

(6)弃上清•加入1ml1xPBS溶液制备成单细胞悬液。

(7)FCM检测髓系相关抗原的表达。

12.染色体分析

(1)准备1640培养基，小牛血清，秋水仙胺(20pg/ml)-0.075mol/L氯化钾低渗液，

甲醇,胰蛋白酶溶液•PHA(0.5mg/ml)，冰醋酸-Hank's液■无菌超净工作台■酒

精灯，银子,高压灭菌15ml离心管，20ml培养瓶，吸管等。

(2)将患者骨髓标本1200rpm离心5min后■按照1-3xio'的密度接种至含10%

小牛血清的1640培养基中­置于37°C，5%CO2培养箱中培养。

(3)培养23小时后加入lOOgl5ug/ml秋水仙胺，轻轻混匀后，继续培养1小时。

(4)取出培养瓶•用吸管轻轻吹打混匀后转移至15ml离心管­室温下，1200rpm

离心5min。

(5)弃上清后，加入已预热至37℃的8ml0.075M氯化钾低渗液，吹打混匀后置

于37℃水浴箱中低渗处理30min-此期间每间隔lOmin轻柔吹打混匀一次。

(6)甲醇：冰醋酸按3：1体积比例配置固定液，在终止低渗后向离心管中加入1ml

固定液,用吸管吹打混匀后,室温下，1200rpm离心5min0

(7)弃上清后1加入8ml固定液•吹打混匀固定lOmin1室温下■1200rpm离心

5min■重复一次。

(8)弃上清后加入适量固定液，吹打混匀后，滴1〜2滴至干燥洁净的载玻片上晾

干，70℃烤片4〜5小时。

(9)将载波片放入胰蛋白酶溶液中消化8-〜12s后，迅速投入碳酸氢钠缓冲液中终

止消化，然后放入吉姆萨工作液中染色8~lOmin»

(10)自来水冲洗载玻片，晾干后，显微镜观察分析核型。

五、数据分析

采用SPSS19.0统计软件(Chicago,USA)•计量资料采用独立样本t检验•计数

资料采用W检验进行差异检验，双侧p<0.05表示差异有统计学意义。随访时间点定

义：总生存期(overallsurvival,OS)•从开始治疗的第一天至因任何原因引起死亡的

时间；无事件生存期(event-freesurvival,EFS)•从开始治疗的第一天至首次出现治

疗失败'疾病进展、完全缓解后复发或任何原因引起死亡的时间；无复发生存期

(rel叩se-fi*eesurvival,RFS),骨髓细胞形态学显不完全缓解的患者,从缓解后至第

一次复发的时间。

结果

1.急性淋巴细胞白血病患者Ikaros6的发生率

Ikaros6阳性ALL患者PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳结果显示在255bp处可见

一条清晰的条带（图1A），测序发现缺失第4-7号外显子•3号外显子与8号外显子

直接相连，接连处以GGGGG为特征（图1B）。毛细管电泳分析显示阳性患者RT-PCR

产物在250bp左右出现单克隆信号峰（图1C）。若在120bp-180bp之间出现单克隆信

号峰,说明基因组存在/KZHA4-7缺失,若在大于720bp位置出现矮小的GL信号峰,

说明该缺失为杂合缺失；若存在/KZHA4-7缺失，同时没有GL信号峰，说明该缺失

为纯合缺失（图1D）。

图1.Ikaros6的检测。（A）RT-PCR产物电泳结果•阳性对照为BV-173­阴性对照为

无核酸去离子水，在255bp处出现目的条带为Ikaros6阳性；（B）RT-PCR产物测序分

析结果；（C）RT-PCR产物进行毛细管电泳分析结果，不同的信号峰代表Ikaros不同

的剪接变异体，x轴表示PCR产物大小经过仪器内部校正后的模拟信号，y轴表示荧

光信号的峰高。（D）毛细管电泳检测IKZF1M-1基因缺失，GL是质控内参。

在105例B-ALL患者中-37例患者检测到Ikaros6，阳性率为35.24%。根据2013

年NCCN指南分类•表达Ikaros6的患者主要分布在commonB-ALL亚型（24of37,

64.86%）,5例患者分布在earlyprecursorB-ALL（5of37,13.51%）,8例患者分布在

precursorB-ALL（8of37,21.62%）（表1）■统计学分析发现Ikaros6的分布与亚型分

类无统计学差异（尸=0.890）。

在74例T-ALL患者中­16例检测到Ikaros6表达­阳性率为21.62%■明显低于

其在B-ALL中的表达。Ikaros6主要分布在medullaryT-ALL亚型（8of16,50.00%）•

在corticalT-ALL亚型（4of16,25.00%）和precursorT-ALL亚型（4of16,25.00%）

的发生率比较低,而在pro-T-ALL亚型中没有检测到Ikaros6的表达。与58例Ikaros6

阴性患者（medullaryT-ALL的24.14%'corticalT-ALL的13.79%'precursorT-ALL

的34.48%和pro-T-ALL的27.59%的发生率）相比，Ikaros6表达与T-ALL亚型分类

存在显著的统计学相关性（尸=0.036）（表2）。

2.Ikaros6阳性患者临床特征

在37例Ikaros6阳性B-ALL患者中，22例为男性，15例为女性，性别之间无统

计学差异（P=0.353》Ikaros6阳性患者与阴性患者相比，外周血白细胞计数更高（中

位数：13.70X109/L比12.15X1（）9/L-P=0.056）；而乳酸脱氢酶水平相对较低（中位

数：369.00比564.50­P=0.062），但统计学分析均无显著差异。另外，从年龄、血

红蛋白、血小板计数以及骨髓原始细胞比例等临床资料进行比较，发现Ikaros6阳性

组和阴性组之间均无统计学差异（表1）。

表1.在B-ALL中•Ikaros6与临床常规资料之间的关系

Ikaros6PositiveIkaros6Negative

Characteristic(n=37)(n=68)

No.%No.%P

Age,years0.793

Median3036

Range15—681567

Sex0.353

Male2259.463450.00

Female1540.543450.00

WBCcount,X109/L0.056

Median13.7012.15

Range1.17-522.000.87363.00

Hemoglobin,g/dL0.177

Median72.0075.70

Range32.80-122.0027.00140.00

Plateletcount,X109/L0.529

Median33.0037.50

Range3.00-252.002.20-279.00

LDH,U/L0.062

Median369564.50

Range40.001892.0032.00-3768.00

Missing1022

Bonemarrowblasts,%0.584

Median92.8092.50

Range32.49-99.5031.0099.20

Missing5

MajorALLsubtypes0.890

EarlyprecursorB-ALL513.511116.18

CommonB-ALL2464.86(4058.82

Precurso