第二章-现代分离科学

第二章现代分离科学

在分析化学的研究和应用中，虽然建立了大量有效的方法，但是这些方法能否解决所

有的分析问题这一直是在考验分析化学研究人员的一个重大命题。在自然世界，物质的存在

有其必然的规律，我们面临的往往是复杂的研究对象，所谓复杂是指这些研究对象一般都是

有多个组分共存的，而且，就物质世界本身的规律而言，越是容易共存的物质，其性质上就

越接近，越难于区分。另一类复杂物质就是人们为生产生活需要而人为故意制造的，也就是

通常所谓的配方，出于达到某种效果的需要，可能添加的成分的范围非常广泛。再则，象化

工生产等过程也难于避免副反应的发生，产品中一般都含有一定量的杂质。象这样的复杂样

品对分析化学方法提出了特定的要求，这就是我们在讨论分析化学方法时必须提出的技术指

标之一，即方法是否具有选择性。如果方法具有很高的选择性，那就可以在复杂组分中检测

出待测组分，整个分析过程就简单而快捷，因此在分析化学发展的历程中，人们开展了大量

的研究工作以追求分析方法的选择性。但是，任何事物都不以人的意志为转移，迄今为止，

真正意义上具有高的选择性的方法并不多，一般的方法在测定中或多或少受到共存物质的干

扰，甚至只能测定多种物质的总量而无法分别测定，这显然成为阻碍分析科学发展的一个重

大瓶颈。为解决这一问题，在分析化学发展的过程中，形成了形形色色的各种分离方法，所

谓分离即指将各种共存物质彼此分开，从而达到不相互干扰测定的目的。经典的分离方法包

括沉淀、溶剂萃取、离子交换等，这些方法一般需要比较大量的样品和试剂，且以手工操作

为主，程序比较复杂，对操作要求高，效率和精度均较差。其后更为有效的分离方法如色谱

（层析）占据了分离方法的主流，包括气相色谱、液相色谱等，作为自动化的分离手段，获

得了较高的分离效率并方便了应用，而且这些技术还可以与检测技术联用，包括各种类型的

检测装置如热学、电子、光学、电化学检测器及质谱检测器等，这样色谱分离技术就和检测

技术结合为一体同时完成了分离和分析两大任务，因此色谱技术迅速发展成为分析科学领域

一个重要的学科分支。随着研究的不断深入和对分离工作的要求的提高，更多的分离技术也

在不断涌现，如近些年很快发展起来的固相萃取、固相微萃取、液相微萃取等，也为分离技

术提供了更多的技术途径。现代科学技术的发展日新月异，分析科学技术迅速渗透到生命科

学、环境科学等领域，各种极其复杂的研究对象和特殊的样品对分离技术提出了更高的要求,

在这样的背景下，一系列新型的分离技术迅速地发展成熟起来，本章将重点介绍其中部分重

要的技术。

§2.1现代色谱分析技术

色谱分析已经成为非常经典和实用的分离分析技术，其基本的分离模式包括气相色谱分

离和液相色谱分离，其中气相色谱分离又包括基于吸附和分配的不同分离模式，液相色谱分

离的分离模式则更多，除吸附和分配外，还包括离子交换、空间排阻等。在这些经典的色谱

分离基础上，还发展形成了多种各具特色的现代色谱分离方法。

§2.1.1高效薄层色谱法

薄层色谱(thinlayerchromatography,TLC)是将固定相均匀涂抹在玻璃板(或塑料板/

铝制薄板)上成膜，用毛细管或适当的点样装置将试样点加在薄层的起始线上，等溶剂挥发

后置于展开槽内用一定的溶剂展开，当展开到适当距离时取出，晾干、显色后进行定性、定

量分析。薄层色谱具有操作简单、快速、不怕污染，流动相选择范围宽，有利于不同性质的

化合物的分离与分析等特点。

薄层色谱是20世纪50年代由Kirchner等由经典柱色谱和纸色谱发展而来。20世纪

60年代，Stahl等对薄层色谱进行了标准化、规格化及扩大应用等方面的工作，但由于自动

化、分辨率及重现性等方面的不足较长时间停留在定性和半定量水平上。20世纪70年代开

始，薄层色谱向仪器化、高效化发展，逐步形成了高效薄层色谱，即在高效薄层板上进行组

分分离，并用仪器代替手工操作，得到分辨率极高的色谱图，再配以高质量的薄层色谱扫描

仪，大大提高了薄层色谱定量结果的重现性和准确度。目前，高效薄层色谱已成为色谱领域

不可或缺的一个分支。样品在薄层板上被分离的原理和柱色谱类似，按分离原理可分为吸附

薄层色谱、分配薄层色谱、离子交换薄层色谱和空间排阻薄层色谱等，其中应用最广泛的是

吸附薄层色谱。

1.薄层色谱的技术参数

薄层色谱的分离操作过程与柱色谱不同，其技术参数也不完全相同。

(1).定性参数

比移值Rf

♦(2-1)

L为原点中心到样品斑点中心的距离；匕为原点中心到溶剂前沿的距离，如图2・1所

不。

前沿

c・

图2-1薄层色谱图及比移值

&值和样品、固定相、展开剂的性质均有关，可作为组分定性的参数。由图1可知Rr

只能在0~1之间，实际操作中一般要求Rf在0.2~0.8之间。由于Rf值受到诸多因素的影

响，不同色谱条件下很难比较，控制色谱条件也比较有限，因此往往用相对比移值Rr来定

性。

(2-2)

R*i)和Rf⑸分别表示组分i和参考物质s在同一条件下测得的Rf值。R,可大于也可小于

1,可消除系统误差，所以重现性和可比性比Rf好。参考物质可以是加入的纯物质，也可以

是样品中的某一已知组分。

1966年Gaspanri等提出了保留常数值RM：

q=1虱：1)

公式2-3表明保留常数和化合物R「之间或与被测化合物结构之间存在的关系，用其可

以推测同系物的RM值或鉴定同系物。

环形展开比移值Rfc为被分离物质原点迁移的半径与溶剂由原点至前沿半径的比值。由

于直线展开时的移动距离与环形展开时的半径的平方相当，所以：

(Rfc)2=Rf

(2-4)

环形展开适用于Rf值比较小的化合物，因为在环形展开时，在高比移值范围斑点扁平

较分散，而在低比移值范围斑点集中，分离度好。

(2).相平衡参数

薄层色谱的相平衡参数和柱色谱相同，用分配系数K和分配比k表示。比移值Rf与分

配系数、分配比之间的关系为：

由2-5可知，Rf为1的组分，K或k为0,表示该组分不被固定相所保留；Rf为0的组

分，K或k趋于8,表示该组分不溶于流动相，不被流动相所洗脱而停留在原点。

(3).分离参数

分离度(resolution,R)是薄层色谱的重要分离参数：

Rc=---d---

(吗+叼)

式中d为两个斑点的中心距，/，叼分别为两个斑点的宽度，如图2-2所示•显然,

薄层色谱中相邻两斑点之间的距离d越大，斑点面积越小，分离度越大，分离效能越好。

I-dT

W1W2

图2-2薄层色谱的分辨率

分离数(separationnumber,SN)是衡量薄层色谱分离容量的主要参数。SN指相邻斑

点的分离度为1.177时，在R尸0和Rt=l两组分斑点之间能容纳的色谱斑点数。

SN=—-—1

%+仇(2-7)

式中Lo指原点至前沿的距离，加和比分别为薄层扫描所得的Rf=0和R尸1的组分的

半峰宽。实际上b°和用不能由薄层扫描图上直接得到，而是通过测量其他组分的Rf值和半

峰宽，线性回归外推得到。经典薄层板的SN在7~10,高效薄层板的SN在10~20范围内。

(4).板效参数

薄层色谱也是用理论塔板数(numberoftheoreticalplate,n)来表示分离效率的。n主

要决定于色谱系统的物理特性，如固定相的粒度、均匀度、活度以及展开剂的流速及展开方

式等。

n=16(—)2

W(2-8)

式中L为原点到斑点中心的距离，W为组分斑点的宽度。n越大表明该薄层板的效能

越高，斑点集中。普通TLC的n通常为600,高效TLC的n可达5000或更大。

和液相色谱一样，理论塔板高度(heightofplate,H)也能表征分离效能。

«(2-9)

2.高效薄层色谱实验技术

实现薄层色谱分析主要有两种途径，-是利用简易的实验室制备薄层板或商品薄层板采

用手工或半自动方式点样、展开、显色并进行定性和半定量分析。在实验中主要考虑的问题

包括固定相和黏合剂的选择、薄层板制备与活化、点样方式的选择、展开剂的选择以及定性

和半定量的方法等，而现代高效薄层色谱则主要采用性能优良的商品薄层板，采用自动点样

装置并利用高精度的薄层扫描仪完成分析测试工作，达到较高的分离分析水平。

(1).薄层色谱实验技术要素

薄层色谱所用固定相和一般柱色谱相同，但粒径较小，分离亲脂性化合物常选用氧化

铝、硅胶及聚酰胺；分离亲水性化合物，常选用纤维素、离子交换纤维素、硅藻土及聚酰胺

等。在固定相中经常需要加入黏合剂如馔石膏(CaSCV2H2O)、竣甲基纤维素钠和淀粉等以

保证固定相的稳定。有时为了分离某些物质的特殊需要，还可加入少量荧光剂、pH调节剂、

络合剂等物质，制备成荧光薄层板、络合薄层板、酸碱薄层板等。

在薄层色谱技术中，点样是造成定量误差的主要来源。点样的一般要求是点样量合适,

剂量准确，点样区带窄，重现性好。点样可采用手动点样、半自动点样和自动点样。高效薄

层色谱展开方式有水平、上行、下行、径向和双向展开，上行展开是薄层色谱分离最常用的

方式。对组成复杂或组分间性质较接近的试样，一次展开难以完全分离，可在正方形薄层板

上采用双向展开方式，两次所用的展开剂可以相同也可以不同。展开剂的选择是一个关键的

环节，展开剂（流动相）、被分离组分的极性和吸附剂的活性三者是相互关联相互制约的，

为了获得良好的分离，必须正确处理这三者的关系。图2-3原则性地说明了这三者之间的关

系，在实际应用中需仔细确定。

图2-3样品、吸附剂和展开剂性质的关系

在一圆盘上标有三种刻度，分别为分离物质的极性、吸附剂的活度（I级最强，V级

最弱）和展开剂的极性。圆盘中心有一个可转动的正三角形指针说明三者的关系，如图中所

示，分离中等极性的被分离物质，用活度n~HI级的吸附剂，展开剂则用中等极性。在展

开剂选择中，首选单一展开剂，只有无法用单一展开剂或使用单一展开剂影响分离或无定性

方法时，才选择混合溶剂作展开剂。

展开完毕后的薄层从展开剂中取出时需先标出展开剂前缘的位置。有多种方法确定分

离斑点的位置，有色组分本身呈现明显的斑点；有些化合物有紫外吸收，在紫外灯下显现不

同颜色的暗点；有些化合物可用荧光或荧光猝灭斑点定位。光学方法检测不仅方便而且不会

改变化合物的性质，但对光敏化合物要注意避光，并尽量缩短紫外照射时间。除此之外，利

用一些物质的蒸气与样品作用生成不同颜色或产生荧光，或根据分离化合物的性质选择适当

的显色剂显色均可实现斑点的定位。定位后斑点的位置和性质可用于对化合物的定性，常用

斑点的L值和显色特性来确定。因影响Rf的因素很多，根据一种展开剂展开得到的心值

作为定性依据是不够的，通常需要经过两种以上不同组成的展开剂得到的Rf值与标准品一

致，才可认定该斑点和标准品是同一化合物。

（2）薄层色谱（半）定量方法

薄层色谱（半）定量通常有目视比较、斑点面积、洗脱定量测定等方法。目视比较半

定量法通过比较展开后各斑点颜色的深浅估计组分的大概含量。展开后薄层上斑点的面积A

和含量W之间存在多种可能的线性关系，如IgW与A呈线性关系；IgW与4呈线性关系

或IgW与IgA呈线性关系，因此可在实验确定具体的线性相关性后通过测量斑点的面积进

行定量测定。利用本方法进行定量对薄层色谱操作要求较严格，薄层的厚度、活度等要均匀

一致；点样量与样品斑点的大小要求一致；展开时展开剂的液面与原点间的距离以及展开剂

上升的速度和展开的距离也要求相同等。洗脱定量测定是目前较常用方法，其关键是洗脱的

效率，通常用合适方法将斑点部分的吸附剂取下并收集于4~5号砂芯漏斗中，在减压抽滤

下用适当的溶剂将被测组分洗脱。洗脱剂的选择十分重要，应选用既能完全洗脱被测组分，

又不干扰以后测定的溶剂，常用的有水、乙醇、甲醇、丙酮、氯仿、乙醛等，如果用单一的

溶剂洗脱效果不好也可用混合溶剂，洗脱完成后多采用可见-紫外分光光度法、荧光分光光

度法等进行定量测定。

3.薄层扫描法

薄层扫描法(thinlayerchromatographyscanning,TLCS)是薄层色谱技术与光学检测技

术联用的一种仪器分析方法，用一定波长和强度的光照射薄层分离后的斑点，并进行整个斑

点的扫描，用光电转换元件检测透过、反射以及荧光强度等以达到定量测定的目的。由于薄

层是由许多细小颗粒涂布成的半透明物体，但光照射到薄层表面时，除透射光、反射光，还

有相当多的散射光，因此，薄层扫描和比色法不同，样品和测定值之间并非简单的线性关系，

特别在高浓度区这种情况更为明显，因而在定量方式上有其特殊性，通常主要从测量信号类

型、测量波长的变化及光束扫描轨迹的变化等角度考虑改善测定性能。

(1).测量方法

薄层扫描测定法可分为两类，一是紫外-可见吸收测定法，另一是荧光测定法。

1).紫外-可见吸收

根据对光的测定方式的不同可分为透射法、反射法、透射-反射法

透射法中入射光和光电倍增管安装在薄层板的两侧，入射光通过薄层板上的斑点时，

由于部分被组分吸收而使光强减弱，透过薄板的光被光电检测器转化为电信号，经放大后记

录。因薄层板多用普通玻璃板，玻璃板对紫外光有吸收，所以只能用可见光对有色斑点进行

透射扫描。

反射法中入射光与光电检测器安装在薄层同侧。单色光垂直照射到薄层斑点上，光电

检测器置于45。角处检测反射光强度。玻璃板对反射法测定无影响，紫外、可见光均能用，

是薄层扫描定量中经常采用的方法。

透射-反射法是同时测定透射光及反射光，测得的两种光信号相加。由于薄层较厚处，

透射光减弱而反射光相应增强；薄层较薄处，透射光增强而反射光减弱，故二者之和可以补

偿由于薄层厚度不均所造成的基线不稳，灵敏度和精密度得到改善。

2).荧光测定法

在激发光的照射下，斑点中物质本身有荧光或经过荧光衍生的化合物，可测定其发射

的荧光强度而进行定量。荧光法的光源通常是汞灯或俶灯，若用反射法测量斑点被激发发射

的荧光，在光电倍增管前需放置二级滤光片以滤除散射的激发光；若以透射法测量，激发光

为紫外光，薄层板所用的玻璃可起到二级滤光片的作用。荧光测定法灵敏度高，因而点样量

少，相应地改善了分离效果。由于物质浓度与荧光强度存在良好的线性关系，斑点形状不同

对测量值影响不大。

荧光猝灭使用含有荧光指示剂的薄层板，在紫外光的照射下，斑点中组分使荧光指示

剂产生的荧光强度减弱，借助测量荧光强度减弱的程度测出斑点中组分的含量。荧光猝灭的

测量中，组分浓度与荧光强度没有很好的线性关系，其定量关系需由具体实验确定。

(2).单波长和双波长扫描

1).单波长扫描

使用单一波长对薄层进行扫描，又可分为单光束和双光束。单光束的扫描仪无法消除

薄层厚度不均、显色不均的影响，对薄层制作要求很高。双光束扫描仪中光源发出的光经过

分束器被分成两条均等的光束，一束照在斑点部位，另一束照在斑点邻近空白薄层上，记录

两条光束扫描所得的吸光度。但双光束扫描仪测得的空白值并非斑点所在的部位，故只能在

一定程度上消除薄层背景不均匀的影响。

2).双波长扫描

双波长扫描是采用两个不同波长的光束先后扫描所要测定的斑点，并记录两波长吸光

度之差。两种波长的选择，通常是选择斑点中组分的吸收峰波长作为样品测定波长，组分无

吸收的波长作为参比波长。在双波长扫描中，由于对样品扫描进行了背景扣除，使薄层背景

的不均匀性得到补偿，扫描曲线的基线较为平直，测定精度得到改善。

(3).扫描轨迹

根据扫描时光束轨迹的不同，扫描方式有直线扫描、锯齿状扫描和圆形扫描。直线扫

描是用一定面积的光束以直线轨迹扫描通过斑点，光束应将整个斑点包括且对准斑点中心，

扫描测得的是光束在斑点各部分的吸光度之和。由于薄层扫描中吸光度和样品含量之间不一

定呈线性关系，故对外形不规则即不呈圆形的斑点，光束从斑点的不同方向扫描得到的吸光

度积分值不同，因此直线扫描对外形规则的斑点比较适用。

锯齿状扫描以一定大小的正方形小光点呈锯齿状轨迹扫描前进，如图2-4所示。光点

的大小可随斑点面积大小进行调节，这种扫描方式特别适合外形不规则的斑点，从不同的方

向扫描可得到基本一致的吸光度积分值。

Y।光束截面

1]_______________J_______________________

光束轨迹

图24薄层扫描方式

圆形扫描用于圆心式或向心式展开后所得的圆形色谱的扫描测定，可以用光束由圆心

向圆周方向扫描，也可以将光束沿一定半径的圆周方向移动，光束长轴可与圆周一致，也可

与圆周垂直进行扫描。

4.薄层色谱应用

薄层色谱是应用比较广泛的分离方法之一，主要应用于以下领域：

（1）.中草药和中成药的成分分析

中草药和中成药成分极为复杂，自从薄层色谱被采用以来，几乎成了分析中草药和中

成药成分的首先方法。长期以来薄层色谱在中药材中成药的质量分析方面起了积极作用。

中药材品种主要靠斑点比移值、斑点颜色及薄层指纹图谱来鉴别。由于中药材质量受

产地、栽培条件、生长周期、采收季节、加工方法等因素的影响，而中成药的药效也会受原

料质量、工艺方法等因素的影响，只靠显微鉴别、理化鉴别、含量测定等方法不足以鉴别成

分复杂的中草药和中成药。目前国际上通用的办法是采用指纹图谱的方法，指纹图谱可以通

过对体系化学成分的物理指标的表征，将物质体系的内涵表达出来，从而达到对体系整体性

的描述，这正好符合中医药整体综合的特点。我国药典中收录了101个中药品种的多幅彩色

薄层谱图，供分析工作者参考。薄层分离指纹图谱的建立，为鉴别药材的真伪、产地、生长

年代提供了技术手段，也为药材种植的条件选择提供了便利。

薄层色谱在合成药物中的应用也很广泛，如磺胺、巴比妥、抗生素、生物碱等。

(2).化工原料及化学反应进程的控制

用薄层色谱分析有机化工原料，操作简单易行。如各种官能团的有机物、石油产品、

塑料单体、橡胶裂解产物、油漆原料、合成洗涤剂原料等均可采用薄层色谱监测原料质量。

在化学反应过程中，反应终点可以通过定期检验反应产物中原料和目标产物的量来判断。如

果到达反应终点，目标产物的浓度达到最大值，原料浓度降到最小，都可以通过薄层色谱来

确定。

(3).在食品分析、毒物分析、法医化学和环境污染物分析等方面的应用

食品中的营养成分是蛋白质、氨基酸、糖类、油和脂肪、维生素和食用色素等，以及

可能存在的有害物质如残留农药、致癌的黄曲霉等，都可用薄层色谱法定性和定量。

毒物分析和法医化学也很多采用薄层色谱等手段，对麻醉药、巴比妥、印度大麻、鸦

片生物碱等均可分析。另外，很多环境污染物如多环芳烧、酚类物质等均可用薄层色谱进行

分析。

§2.1.2凝胶色谱法

凝胶色谱法(gelchromatogr叩hy)又称分子排阻色谱法，是20世纪60年代初发展起

来的一种快速而又简单的分离分析技术，主要用于测定高聚物分子量及其分布。根据分离对

象的水溶性不同，又可分为凝胶过滤色谱(GFC)和凝胶渗透色谱(GPC)。凝胶过滤色谱

主要以水为洗脱溶剂分离水溶性的大分子如多糖类化合物，常用的凝胶是葡聚糖系列。凝胶

渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为

交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢吠喃等有机溶剂。凝胶色谱不但可以用于分离测定高聚

物的相对分子质量和分布，而且已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以

及医学等有关领域广泛采用以研究生物大分子。

高分子化合物的性能与其分子量有密切的关系，尤其是其机械性能、加工性能和溶液

性能都是随分子量而显著改变的，同时分子量的分布也对这些性能产生显著的影响，因此,

研究高分子化合物的分子量及其分布是非常重要的。测定高分子化合物分子量的传统方法包

括端基分析、沸点上升、冰点下降、渗透压、粘度、散射、离心等方法，凝胶色谱是高分子

化合物分子量分析领域最先进的方法之一。

1.凝胶色谱法基本原理

(1).分子筛效应

高分子链上的碳碳单键是能转动的，随着分子链的增长，高分子的长链会扭曲成一个

线团形状，分子量大的线团体积大，分子量小的线团体积小。含有不同大小分子的样品溶液

缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着随流动相往前的移动和无定向的扩散运

动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗

脱时向前移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗

粒的微孔中，即进入凝胶相内，并不断从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒,

如此不断地进入和扩散，所以向前移动的速度落后于大分子物质，从而样品中分子大的先流

出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。具有多孔的

凝胶就是分子筛，各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，分子直径比凝胶最大孔隙直径大

的，全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻。两种全排阻的分子即使大小不同，也

不会有分离效果。直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙，如果两种分子都

能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果，因此，一定的分子

筛有它一定的使用范围。

对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内的各种分子，在凝胶柱中的分布情况也

是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子较小的可进入较多

的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶柱内移动距离较短，分子较小的移动距离较长。同时，

凝胶本身具有三维网状结构，大的分子在进入这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子进

入时则阻力较小，于是分子较大的先通过凝胶柱而分子较小的后通过凝胶柱，这样就利用分

子筛可将分子量不同的物质分离，分子量大小不同的多种成份在通过凝胶柱时，按照分子量

大小排队，表现出分子筛效应。当然凝胶色谱分离作用实际上比上述过程要复杂些，还牵涉

到样品与凝胶表面及淋洗液间的分子间作用力等因素。

对凝胶色谱分离机理的理解还需要考虑以下因素：

1).平衡排除：其一是所谓构象降低，高分子化合物被理解为无规线团，当其进入凝

胶孔洞内时，只有部分构象能够存在，而且分子量越大，构象越少。二是立体排斥，高分子

线团在孔内的活动范围与其分子量相关，其减小的厚度为高分子线团的有效半径。

2).限制扩散：溶质分子在凝胶柱中的分配未必会达到平衡。因为大小不同的分子的

扩散速度是不同的，分子的扩散系数随R/a的增大而迅速减小(R为分子半径，a为孔的截

面半径)。同样条件下，小的分子不仅能进入孔洞内，而且可以进入孔洞的深处，从而滞留

的时间长，而大的分子，由于扩散慢，只能孔洞的表面，存在所谓“有限扩散”现象，尤其

是当流动相速率较大时，不能达到平衡。

3).流动分离：按照流体动力学理论，流动相在孔洞中的移动存在一个抛物线型的流

速场，即中间流速大，周围流速小，而分子越大，越容易被集中在流速场的中间，从而随流

动相的移动加快，而较小的分子则分布于流速场的周围，移动速率小。

(2).凝胶色谱柱的重要参数

1).柱体积：柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。常用Vt表

ZjSo

2).外水体积：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，常

用Vo表示。

3).内水体积：因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部,

这就分间隙的总和为内水体积，又称定相体积，常用Vi表示。不包括固体支持物的体积(Vg)。

4).峰洗脱体积：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积，常用Ve表示。当样

品的体积很小时(与洗脱体积比较可以忽略不计)，在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗

脱液体积为Ve。

(3).高聚物的分子量及其分布

高聚物的分子量是个分散性体系，有的分子分子量大，有的分子分子量小，这就产生

了一个分子量分布和分子量统计方法的问题，从理论上讲，一个高分子样品中，分子量很大

的分子数不会多，同样分子量很小的分子数也不会多，而分子量适中的分子数是主要的，因

此分子量的分布应趋向于正态分布。

设高分子样品中某一小部分I的分子量是相同的，为Mi,其分子数目为Ni,质量为

Wi,则这个样品的：

重均分子量为(2-10)

数均分子量为(2-11)

M

D=—匚

分子量分布宽度为M.(2-12)

Mw是以不同分子量的分子质量分数统计的样品的平均分子量；Mn是以不同分子量

的分子数目分数统计的样品的平均分子量；高分子的D值越小表明分子量的分散性越小。

一般分子量测定标样的D小于1.1。凝胶色谱仪可测定Mw、Mn和D值并计算出黏均分子

量M，，等，在这些数据中最重要的是重均分子量Mw。

2.常用凝胶的种类及性质

(1).聚丙烯酰胺凝胶

是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单体，由甲叉双丙烯酰胺交联，经干燥粉碎或

加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂越多，孔隙越小。

(2).交联葡聚糖凝胶(Sephadex)

交联葡聚糖的商品名为Sephadex,不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面

的阿拉伯数为凝胶吸水值的10倍，如SephadexG-25即为每克凝胶膨胀时吸水2.5克的葡聚

糖。SephadexLH-20是SephadexG-25的竣丙基衍生物，能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不

溶于水的物质。

(3).琼脂糖凝胶

琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼

脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用。琼脂糖凝胶在40℃

以上开始融化，也不能高压消毒。

(4).聚苯乙烯凝胶(Styrogel)

具有大网孔结构，可用于分离分子量1600到40,000,000的生物大分子，适用于有

机多聚物分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚碉。

3.凝胶色谱仪及实验技术

凝胶色谱仪的基本结构与液相色谱类似，见图2-5o流动相经高压计量泵输入凝胶色

谱柱，样品经进样器注入，被流动相带入凝胶色谱柱进行分离，分子量大的部分先被淋洗出

色谱柱，分子量小后被淋洗出色谱柱，被分离后的样品流入示差折光检测器，因样品的折射

率的变化而产生折射差值信号，经光电转换后的信号被放大记录。

进样器

总压期//

图2-5凝胶色谱系统结构

（1）.高压流量泵

在凝胶色谱应用中，高分子的分子量是以出峰时间为依据进行计算的，因此流量的稳

定非常重要。目前大多使用2个柱塞泵并联组成计量泵，这2个并联柱塞泵往复互补以减少

流量的脉动，要求较高的泵其流量波动的相对标准偏差在0.1%以下。

（2）.样品溶液的处理

样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过SephadexG-15短

柱除去。样品的粘度不可大，粘度高影响分离效果，含蛋白不超过4%。

（3）.凝胶色谱柱

色谱柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，但直径加大，洗脱

液体体积增大，样品稀释度大。分离度与柱高的平方根相关，但软凝胶柱过高会挤压变形阻

塞。凝胶的粒度也影响分离效果，粒度细分离效果好，但阻力大，流速慢。商品凝胶是干燥

的颗粒，根据柱体积估计所需干胶的量，使用前在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，

可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大加速膨胀，通常在1-2小

时内即可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内

的空气。经常使用的凝胶如交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，需防止微生物的生长。常

用的抑菌剂有叠氮钠（NaN）、可乐酮［CbC-C（OH）（CH3）2］、乙基汞代疏基水杨酸钠和苯基

汞代盐等。

（4）.检测器

示差折光检测器是凝胶色谱通用的检测器。检测器由参比池和样品池组成，被分离的

样品流经样品池时，样品池的折射率与参比池的折射率之间产生差值，发出折射率改变的信

号。折射率和温度有关，温度细微变化会引起折射率的波动，因此检测器的温度控制要有很

高的精度。

（5）.分子量的测定

凝胶色谱法分析高分子化合物的分子量，要先用已知分子量的高聚物如聚苯乙烯标样

做工作曲线，依据工作曲线对未知样品进行测定。实验过程中根据不同样品的分子量选择合

适的凝胶色谱柱，还要考虑选择合适的流动相。典型的保留时间和分子量之间的相关性如图

2-6所示。

应用中需要注意以下问题：

1).凝胶色谱分析前，必须完全除去样品中的粉质。

2).进样前要尽量除去溶剂。常见溶剂有各自的折射率，如果比流动相折射率低的溶

剂混进样品，会在色谱图上形成负峰；如果比流动相折射率高的溶剂混进样品又不能很好分

离的话，会使数均分子量明显偏低，使分子量分布宽度D值明显增大。

3).要获得准确的分子量和分子量分布，必须注意色谱柱分子量范围、标样分子量范

围和被测分子分子量范围三者之间的关系。正确的覆盖关系为：柱分子量范围2标样分子量

范围2被测分子分子量。柱的分子量范围一定要明显高出测试样品的分子量范围，如分析相

对分子量为6万的样品，柱的分离极限应在30万以上。

§2.1.3亲和色谱

亲和色谱(affinitychromatrgraphy,AC),是利用生物分子，特别是生物大分子与亲和色

谱固定相表面配体之间存在的生物学和生物化学过程的特效性亲和吸附作用，来进行选择性

分离生物分子的方法。

生物大分子如肽、蛋白质、核酸等有一个共同特性，即具有以特有的高效方式去识别

或键合到其他分子上的能力，正因为如此所有生物大分子可借助亲和作用过程进行分离和纯

化。自20世纪50年代至今，亲和色谱已在生物化学、分子生物学、基因组学、蛋白组学、

生物工程、临床医学、新型高效药物研究中成为常规的分离、分析和制备的有效工具，并且

在生物大分子的结构、功能研究中，成为一种普遍采用的方法。

I.亲和色谱基本原理和类型

亲和色谱固定相上键合的配位体与被分离的生物活性目标分子之间的相互作用，可用

锁钥结构络合物(lock-and-keystructuralcomplex)的形成来表示，如图2-7所示。生物活性

分子和配体之间的相互作用受范德华力、疏水作用力、静电引力、络合作用力和空间位阻效

应等多种因素影响，正是这种相互作用力的差异，才使得不同种类的生物分子获得分离。

亲和色谱法的突出特点是可对天然生物活性物质进行高特效性的分离和纯化，具有高

的浓缩效应，可从大量样品基体中分离、纯化出所希望获取的少量生物活性物质。和高效液

相色谱中广泛使用的仅利用疏水性差异的单一模式的反相色谱柱不同，在亲和色谱分析中广

泛使用依据不同分离模式的特效性识别柱，这些不同类型亲和柱的使用可依据被分离目标分

子的需求来决定。研究锁钥络合物解吸过程的化学动力学是发展亲和色谱的分析应用和制备

分离的关键问题。

亲和色谱已获得了巨大的进展，依据生成锁钥结构、可逆离解配位机理的不同，已发

展了多种方法，依据亲和色谱固定相键合配位体的不同，可将亲和色谱方法进行分类，见表

2-1

表2-1亲和色谱法的分类

方法名称分离机理应用对象

生物特效亲和色谱法利用可形定锁钥结构的不同生生物活性物质如肽、蛋白质、

物分子间的生物特效识别功能核甘酸、抗原、抗体、病毒、

细胞碎片等

染料配位亲和色谱法利用生物分子与三嗪或三苯甲烷核甘、核碱、核昔酸、核酸

染料间的特殊性相互亲和作用与核酸键合的蛋白质、生物酶

定位金属离子亲和色谱法利用生物分子与金属离子一有肽、蛋白质、核酸、生物酶

机试剂螯合物之间的特效性相

互亲和作用

包合配合物亲和色谱利用生物分子与环糊精（或冠手性氨基酸、多肽、生物酶、

酸、杯芳烧）及其衍生物之间的纤维素细胞生长因子、凝固因

特效包合作用子、脂蛋白及多种手性药物

电荷转移亲和色谱法利用生物分子与口卜咻衍生物之氨基酸、肽、蛋白质、核碱、

间的电子给予和电子接受基团核甘酸

间的特殊静电吸引亲和作用

共价亲和色谱法利用含磕基的生物分子与含二含硫多肽和蛋白质、含汞多

硫桥键配位体（2-毗咤二硫化聚核甘酸

物）间存在的特效亲和作用

印迹分子亲和色谱法利用生物分子与分子印迹聚合氨基酸、肽、蛋白质、核甘

物之间的专一性分子识别作用，酸、辅酶

以实现高选择性、高效率的手性

分离

疏水作用亲和色谱法利用在水溶液中非极性基团之不同的蛋白质和核酸

间的接触结合的亲和作用

2.亲和色谱分离技术要素

在亲和色谱分析中，分离、纯化对象大多为极性生物活性分子，但从固定相上把它们

洗脱下来时，需要用pH值接近于中性的稀缓冲液，以保持其生物活性。生物分子和各种亲

和配位体生成的配合物一般稳定常数不大，而且可逆，因此在大多数情况下使用非选择性洗

脱剂可实现不同组分的分离。但当亲和作用特别强时，必须采用特效性洗脱剂或特殊洗脱方

法，即使用含有特定组分、具有超强洗脱能力的流动相进行洗脱。

（1）.影响洗脱的几种因素

1）.锁钥络合物的离解常数

锁钥络合物越稳定，离解常数KD越小，一般KD大于10‘mol/L时，亲和力太弱，无

法用于分离；当KD在10"~l（y3mol/L之间，锁钥络合物呈现可逆吸附，亲和作用力强度适

用于分离；当小于IO-5mol/L,生物分子被牢固吸附，必须改变外界条件才能分离；当

KD小于lO^mol/L时;亲和性很高，洗脱可能极端困难，仅当在变性条件下才能实现洗脱。

2).配体浓度

键合配体浓度明显影响亲和固定相的有效性。通常亲和固定相制备时，其载体不需要

健合高浓度的配体，因为随配体密度的增加，键合强度和非特效相互作用也随之增大，与此

同时，由于立体阻碍，基体的有效性也会降低。在大多数情况下，配体浓度达20pmol/mL

即可，仅在低亲和体系时，才使用最高可能达到的浓度。对于具有高亲和性的配体，如需降

低配体的浓度或亲和性，降低洗脱的难度，可简单地将一定量载体与亲和固定相混合后再装

柱就能实现。

3).空间阻碍作用

当生物活性分子与配体作用生成锁钥络合物时，会遇到一系列的空间阻碍作用：a.生

物活性分子在亲和固定相上的扩散受到载体孔径和孔容的限制，因此亲和固定相的载体必须

具有大孔(30nm)。如能将亲和色谱与凝胶渗透色谱组合，最适合于分离既能与配体亲和又

具有不同分子量的化合物。b.如将小分子配体直接键合在载体上，生物大分子与配体键合

形成锁钥络合物会受到较大的空间阻碍作用，为减少立体干扰，增加小分子配体的柔韧性和

可移动性，小分子配体最好通过间隔臂再与载体偶联。间隔臂在亲和固定相中十分重要，亲

和色谱的效率可借助在载体和配体之间插入不同长度的间隔臂碳链(大多数情况下为C6链)

而获得显著的增强。c.配体通过共价定位后，其活性作用位被其他基团阻碍，而无法与生

物活性分子相互作用，使亲和作用大大降低。

4).平衡时间

在某些情况下，特效配体与生物大分子之间的吸附平衡以很慢的速度完成，一方面由

于与特效配体接触的生物大分子数目相当少，另一方面蛋白质等的活性位必须紧紧对准亲和

配体才能实现特效吸附。为满足达到吸附平衡的条件，进样后洗脱速度应尽可能低。对弱亲

和作用，洗脱前将样品与亲和固定相平衡一段时间，不仅可增强亲和作用，还可提高色谱柱

分离能力。

5).温度效应

亲和吸附作用会随温度的升高而减小。在色谱过程中，随着温度的升高，分子迁移速

度加快，有利于洗脱过程，0~25。＜3范围比较适合于亲和色谱。

(2).亲和色谱流动相的组成

亲和色谱使用的流动相皆为具有不同pH的缓冲溶液，由无机和有机弱酸或弱碱与其

共轨酸碱构成。为保持生物大分子的活性，一般在温和条件下洗脱，pH6~8的缓冲体系较

为适合。表2-2,2-3列出了常用的缓冲物质和Good's缓冲物的适用pH范围。

表2-2常用的酸、碱缓冲物质

化合物pKa(pKb)化合物pKa(pKb)

草酸1.23(pKai)琥珀酸4.19(pKai)

4.19(pKa2)5.57(pKa2)

磷酸2.12(pKa,)柠檬酸3.06(pKaj)

7.21(pKa2)4.74(pKa2)

12.32(pKa3)5.40(pKa3)

亚氨基二乙酸2.33谷氨酸4.32

天冬氨酸2.90(pKaj)碳酸镀6.35(pKa)

5.70(pKa2)10.33(pKb)

丙二酸2.90(pKai)咪喋7.00

5.70(pKa2)

乙酸4.74麦黄酮8.05

甲酸3.74甘氨酰胺8.20

2-羟基异丁酸3.97甘氨酰甘氨酸8.25

吗咻8.49三（羟甲基）氨基甲烷（tris）8.30

硼酸9.24氨水9.26

表2-3Good,s缓冲物的适用pH范围

缓冲物缩写pH值范围

2-（N-吗咻）乙基磺酸/NaOHMES/NaOH5.5〜6.7

N-（2-乙酰胺基）亚氨基二乙酸/NaOHADA/NaOH6.0~7.2

哌嗪-N,N，-双（2-乙基磺酸）/NaOHPIPES/NaOH6.1~7.5

N-乙酸氨基-2-氨乙基磺酸/NaOHACES/NaOH6.2~7.5

3-（N-吗咻）丙基磺酸/NaOHMOPS/NaOH6.5~7.9

N2羟乙基哌嗪-N，2乙基磺酸/NaOHHEPES/NaOH6.8〜8.2

N-三（羟甲基）甲基甘氨酸/HC1Tricine/HCl7.4~8.8

N,N-双（2-羟乙基）甘氨酸/HC1Bicine/HCl7.6〜9.0

3-[N-H（羟甲基）甲氨酸]丙基磺酸/NaOHTAPS/NaOH7.7〜9.1

2-（环己氨基）乙基磺酸/NaOHCHES/NaOH8.6~10.6

3-（环己氨基）丙基磺酸/NaOHCAPS/NaOH9.7~11.1

(3).洗脱方法

1).非选择性洗脱法

当被分离的生物分子与配体形成稳定常数较小的络合物时，在恒组成洗脱条件下，使

用洗脱能力较弱的、具有不同pH值的缓冲溶液，就可使络合物解离，而将生物分子洗脱下

来。当被分离的生物分子除与配位体存在配位作用，还存在由于静电引力、氢键力或疏水相

互作用引起的非特异性吸附时，必须通过以下几种方法来消除非特异性吸附，而又不损害生

物分子的生物活性和固定相的稳定性：a.改变流动相的pH值。许多类型的亲和作用会在

极端的pH条件被破坏，但利用改变pH变更洗脱条件时要注意样品分子是否会失去生物活

性。b.改变流动相的离子强度，任何具有离子基团的亲和色谱固定相都会由于产生非特异

性吸附而影响洗脱，一般可向流动相加入高浓度NaCl(0.1~1.0mol/L)增加流动相的离子

强度，以减轻非特异性吸附，实现样品分子的顺利洗脱，也可采用梯度洗脱方式进行。c.改

变流动相的极性，向具有一定pH值的流动相中加入极少量的有机改性剂，如甲醇、乙盾、

四氢吠喃、乙二醇、二甲基甲酰胺等，因改变了亲和作用周围的介质条件，会随着疏水作用

的增强，而破坏样品分子与配体之间的亲和作用呈现出极有效的洗脱效应。d.加入离子顺

序试剂，如将硫氧化钾、胭、盐酸胭、三氯乙酸等加入流动相，会使蛋白质等生物分子的结

构发生变化，而破坏原已存在的亲和作用。离子顺序试剂实际上就是蛋白质变性剂，使用

10mmol/L左右低浓度离液顺序试剂是实现快速洗脱，并尽可能保持生物活性的最佳方法。

非选择性洗脱最大优点是使用了廉价的pH缓冲溶液作为流动相，此外还可克服非特

异性吸附。其缺点是，当使用有机改性剂或离子顺序试剂来强化洗脱条件时，常会使被分离

生物分子的结构发生不可逆变化，尤其是对高活性蛋白质时因慎重使用。

2).特效性洗脱

当生物分子与固定相的配体存在强亲和作用时，宜采用选择性强的特效性洗脱法，即

在流动相中添加另一种游离配体和被分离的生物活性分子相结合，而从柱上洗脱下来。洗脱

后可利用改变pH值或加入变性剂的方法，重新获得生物分子的纯品。为增加特效洗脱的纯

化效果，可采用多次脉冲式加入流动相的方法进行，或采用停流洗脱方式，以增加流动相与

样品分子的相互作用时间，保证洗脱完全。

3）.特殊洗脱方法

当生物分子与配体间存在特别强的亲和作用时，就需要使用特殊洗脱方法。在某些情

况下使用硼酸盐缓冲溶液作为流动相会产生特殊有效的洗脱效果。另一种特殊洗脱方法是通

过选择性地断裂固定相基体和配体之间的化学键如偶氮键、二硫键等，而完整地将配体-蛋

白络合物释放出来。然后再用适当的方法，如改变pH、加入疏水性有机溶剂、改性剂等，

将洗脱下来的络合物中的蛋白质离解出来，并用配体重新再生固定相。这种方法特别适用于

对配体亲和力特别强，且又需纯化的生物大分子样品。

（4）.亲和色谱固定相

亲和色谱固定相是亲和色谱法对生物大分子实现高效分离的关键，其制备方法比一般

色谱固定相复杂，由载体（support,又称基体matrix）、间隔臂（spacer或spacerarms）和

配体（ligand,又称底物substrate）三部分组成。

载体应适用于色谱分析，一般用无机氧化物如SiO2,AI2O3、Zr02等，生物聚合物如

琼脂糖、葡聚糖等或高分子聚合物如苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸

酯等。间隔臂大多数为线性的脂肪族有机物，具有双官能团，一端与载体连接，另一端与配

体连接。间隔臂的长度直接影响固定相的立体效应，可具有疏水性或亲水性，也可由多肽或

蛋白大分子构成，不仅可为直线形，还可构成星形辐射树枝状。配体应呈现对一系列生物分

子的特效性，自身须具有能和间隔臂共价键连接的官能团。

亲和色谱固定相的制备，实际上就是在固相载体上进行特定化学官能团的固定化反

应，一般有顺序键合法和分步键合法两种方式。不论采用哪种方式进行固化反应，其偶联反

应条件必须十分温和，并对反应物不会产生有害的影响，特别对易变性的生物特效配体。

亲和色谱固定相的制备中，不仅涉及有机合成，还涉及到表面化学领域。常用于对固

定相制备过程进行表征和检验的分析技术有三类：a.测定经化学键合偶联在载体上的间隔臂

或配体的特征官能团或化学组成。如紫外吸收光谱（UV）、红外吸收光谱（IR）、拉曼光谱、

核磁共振波谱（NMR）以及使用软电离技术的质谱（MS）；b.测定固相表面结构特性及试剂

在固相表面分散情况的表面分析技术，如X射线光电子能谱（XPS）、俄歇电子能谱（AES）、

X射线衍射（XRD）、扫描电子显微镜（SEM）：c.其他分析方法，如测定固相含水量、热

稳定性、分解或相变温度的热分析方法（DTA、DSC等）以及用化学分析法分析固相的表

面积、酸碱活性作用位点、配体键合容量等。

3.亲和色谱分析实验技术

亲和色谱分析操作技术可分为小型柱重力洗脱、低中压液相色谱分析和高效液相色谱

分析三种操作方式。

（1）.小型柱重力洗脱

由琼脂糖、葡聚糖等软质凝胶制备的亲和色谱固定相，常用于小型柱重力洗脱。对具

有高特异性亲和吸附的固定相，不一定使用色谱柱操作，可采用“分批吸附法”，即将亲和

性极高的特异性亲和固定相匀浆加入到生物样品粗制品中，可从含有大量惰性蛋白质的混合

物中，将少量特异性蛋白质提取出来。也可采用小型色谱柱装填具有特异性亲和固定相，将

生物样品粗制品加入色谱柱，用适当流动相冲洗掉未被吸附的惰性蛋白质，而将特异性蛋白

质保留在小型色谱柱中。

小型色谱柱（见图2-8）通常可容纳5mL体积的软质凝胶固定相。小型柱除可用于色

谱分离外，还可在小柱中进行偶联、键合反应。即先把载体装柱，加入偶联或键合剂，将小

柱密封，摇荡柱子使凝胶处于悬浮状态，就可对载体进行活化，偶联或键合反应，只要反应

液不损坏小柱的结构，可反复多次利用。

图2-8小型柱结构

（2）.低、中压液相色谱分析

多糖类软质凝胶亲和色谱固定相也可装填在内径1~2cm、嵌25~50cm的色谱柱中,

凝胶固定相用水溶胀后再进行装填，流动相置于柱顶溶剂贮罐中利用重力洗脱，也可采用柱

顶通入0.1~0.25MpaN,或对柱末端进行抽真空的方法来加速洗脱。

对商品提供的多糖凝胶柱，可在专用的低、中压液相色谱仪上使用，可用于分析测定,

也可用于制备。其仪器流路如图2-9所示。

图2-9低、中压亲和色谱结构

中压液相色谱系统可快速实现多肽、蛋白质、多核甘酸的分离、制备任务，是专门为

生物化学家需要而研制的。

（3）.高压液相色谱分析

随全多孔单分散大孔硅胶的广泛应用，高效亲和色谱固定相的种类也越来越多，高压

液相技术也更多地应用于亲和色谱。在进行高压液相亲和色谱分析时，生物样品非常复杂，

为提高分离的选择性，常使用具有不同pH值的缓冲体系。为加速洗脱，也会在流动相中加

入高浓度的NaCl,或添加硫眼、尿素、KSCN等离子试剂或表面活性剂，这些改性剂、变

性剂、表面活性剂的加入，会对以不锈钢为主体材料的高压液相色谱系统产生腐蚀，而溶出

的金属离子可能会引起生物分子的失活，因此要求应用于高压液相亲和色谱分析生物样品的

仪器应为“全惰性”的HPLC系统。

（4）.生物样品的制备和保存

在亲和色谱分析中使用大量生物样品，在制备亲和色谱固定相时也要使用多种生物分

子作配体，因此正确保存生物样品或生物制剂，或从生物活体制备所需的蛋白质、多肽、酶、

核糖核酸、抗体、多糖、脂类等是亲和色谱分析中的一种重要环节。

生物样品或制剂的质量会受到保存环境外界条件的影响，如空气氧化、温度变化、日

光辐射、空气湿