有关硅胶色谱柱的使用 色谱柱常见问题解决方法

第第页有关硅胶色谱柱的使用色谱柱常见问题解决方法色谱柱可分为填充柱和开管柱两大类。多为金属或玻璃制作。有直管形、盘管形、U形管等形状。液相色谱通常均接受填充柱。色谱柱的分别效果取决于所选择的固定相

色谱柱可分为填充柱和开管柱两大类。多为金属或玻璃制作。有直管形、盘管形、U形管等形状。液相色谱通常均接受填充柱。色谱柱的分别效果取决于所选择的固定相，以及色谱柱的制备和操作条件。硅胶色谱柱使用方法称量。200—300目硅胶，称30—70倍于上样量；假如极难分，也可以用100倍量的硅胶H。干硅胶的视密度在0.4左右，所以要称40g硅胶，用烧杯量100ml也可以。2.搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。假如洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌。3.装柱。将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约1/3体积石油醚，装上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内。随着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油醚将其冲入柱中。4.压实。沉降完成后，加入更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直至流速恒定。柱床约被压缩至9/10体积。无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步，可使分别度提高很多，且可以避开过柱时由于柱床萎缩产生开裂。5.上样。干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样后，加入一些洗脱剂，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面。6.过柱和收集。柱层析实际上是在扩散和分别之间的权衡。太低的洗脱强度并不好，推举用梯度洗脱。收集的例子：10mg上样量，1g硅胶H，0.5ml收一馏分；1—2g上样量，50g硅胶（200—300目），20—50ml收一馏分。7.检测。要更多地使用专用喷显剂，假如仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的灵敏度一般比喷显剂低1—2个数量级。8.送谱。收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。假如样品太少或为液体，可过一小凝胶柱，作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢谱1.5ppm左右所谓的“硅胶”峰。

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色谱柱的柱效下降会有什么现象？

柱效（columnefficiency），是指色谱柱保留某一化合物而不使其扩散的本领。柱效能是一支色谱柱得到窄谱带和改善分别的相对本领。

柱效，从名字上理解是色谱柱的分别效果。色谱柱的有效塔板数越大或有效的塔板高度越低，色谱柱的柱效越好，仿佛于每个塔板的分别效率相同，有效塔板数越多，最后得到的物质越纯。

柱效率是指溶质通过色谱柱之后其区域宽度加添了多少，它与溶质在两相中的扩散及传质情况有关，这是所谓色谱的动力学过程。

怎么计算和直观的提现？

从塔板概念评价柱效

依据塔板理论，可以计算一根色谱柱所达到的理论塔板数，或表达为每米理论塔板数n/m。把相当于一个理论塔板的柱子长度称作理论塔板高度H，通常接受有效塔板数N和有效塔板高度L来表达柱效，W为峰宽,W1/2为半峰宽：

N=16（Tr/W）^2

=5.54（Tr/W（1/2））^2

=L/H

明显，N值越大，或H值越小，柱效越高。分散效果紧要取决于所选择的固定相。

从柱的算公式上我们可以看出柱效紧要跟理论塔板数和柱长有关系。我们来解释一下理论塔板数。

理论塔板数（theoreticalplatenumber），N是色谱柱效的参数之一,用于定量表示色谱柱的分别效率（简称柱效）。N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充情形、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。假如峰形对称并符合正态分布，N可貌似表示为：

理论塔板数=5.54（保留时间/半高峰宽）2（2是平方）

柱效率用理论塔板数定量地表示：N=16*（t/w）2、其中，t是溶质从进样到最大洗脱峰显现的时间，w为该溶质的洗脱峰在基线处的宽度。在一色谱柱中用相同的洗脱条件时候，不同化合物的滞留时间与其洗脱峰宽度之比接近常数。因此理论塔板数大的色谱柱效率高。当然，N的大小和柱子长度有紧密关系：理论塔板高度H=柱长/N，用H可以衡量单位长度的色谱柱的效率，H越小，则色谱柱效率越高。N为常量时，W随tR成正比例变化。在一张多组分色谱图上，假如各组份含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要渐渐加宽，峰高则渐渐降低。

用半峰宽计算理论塔板数比用峰宽计算更为便利和常用，由于半峰宽更简单精准测定，尤其是对稍有拖尾的峰。

N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，假如未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。）若用调整保留时间（tR）计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数（N有效或Neff）=16（tR/W）

离子色谱柱的柱效一般由硫酸根的理论塔板数来计，理论塔板数可以由色谱仪工作站直接读出，一般离子色谱柱的柱效大于1000个塔板数.

柱效下降会有什么现象？

1.看峰分别度，分别度直接关系测试结果精准性，可以判定柱效是否下降，柱效下降分别度一般会变差。

2.测定色谱柱的塔板数来判定

3.通过压力变化和出峰时间来判定，一般柱效下降时伴随着柱压的上升和降低，此时出峰的时间也会和之前有很大差异。

4.还可以依据新的柱子的保留时间判定,看重复性,平行性如何.

5.通过谱图峰型的变化，是否有严重前伸和拖尾现象，假如峰型很差了，柱效已经下降了

柱效下降后如何来提高柱效。

离子交换柱长时间在缓冲溶液中使用和进样,将导致色谱柱离子交换本领下降,.用稀酸缓冲溶液冲洗可以使阳离子柱再