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中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品过敏原成分检测第14部分：实时荧光PCR方法检测鱼成分督 出口食品过敏原成分检测第14部分：本部分所规定方法的最低检出限(LOD)为0.01%(质量分数)GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测在PCR反应体系中加入荧光基团利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。2名称序列(5'-3')目的基因内参照5’端引物内参照3’端引物内参照探针AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCFAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC鱼3'端引物鱼探针FAM-TTTACGACCTCGATGTTGGA用10%盐酸调pH至8.0,121℃,高压灭菌20min,备用。5.3TE缓冲液(Tris-Cl、EDTA缓冲液):10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA5.1070%乙醇。6.4冰箱：2℃~8℃,-20℃。37.1DNA提取7.1.2加入500μL酚、三氯甲烷和异戊醇的混合液，体积比为25:24:1;强烈振荡，12000g离心7.1.6加入200μL三氯甲烷：异戊醇(24:1),强烈振荡，12000g离取适量DNA溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测7.3.1实时荧光PCR反应体系各1pL,鱼探针1μL,dNTP1μL,Taq酶0.7.3.2实时荧光PCR反应参数48质量控制以下条件有一条不满足时，实验视为无效：a)空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值>40.0;b)阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值>40.0;c)阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值<30.0;d)内参照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值<30.0。9结果判定及表述9.1结果判定在符合第8章的情况下，被检样品进行检测时：a)如Ct值≤35.0,则判定为被检样品阳性，扩增靶标序列参见附录A;b)如Ct值≥40.0,则判定为被检样品阴性；c)如35.0<Ct值<40.0,则重复一次。如再次扩增后Ct值仍为<40.0,则判定被检样品阳性；如再次扩增后Ct值≥40.0,则判定被检样品阴性。9.2.2结果为阴性者，表述为“未检出过敏原鱼成分”检测过程中防止交叉污染的措施按照GBT27403中的规定执行。5ATAACAG

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