论文研究-盐酸氨溴索对百草枯中毒大鼠肺SPD表达及肺损伤的保护作用

盐酸氨溴索对百草枯中毒大鼠肺SPD表达及肺损伤的保护作用【摘要】目的观察盐酸氨溴索对百草枯中毒致急性肺损伤大鼠肺表面活性物质蛋白-D（alveolarsurfaceactivesubstance-D，SP-D）及各相关指标的影响，并评价盐酸氨溴索对百草枯中毒治疗作用。方法将120只雄性大鼠，随机（随机数字法）分为3组：生理盐水组（NS组），百草枯中毒组（PQ组），盐酸氨溴索治疗组（AT组）；再分别将每组按时间点（第1、3、5、7天）随机（随机数字法）分为4组。各组以Westernblot法检测肺组织SP-D蛋白含量，以HE染色观察大鼠肺组织形态学变化，并同时检测各组大鼠的白细胞计数（whitebloodcount，WBC）和中性粒细胞（polymorphonuclear，PMN）百分比及动脉血氧分压（arterialoxygenpressure，PaO2）。结果AT组第3、5、7天WBC计数均低于PQ组，高于NS组各相应时间点，差异有统计学意义（P<0.01）；AT组与PQ组相比PMN百分比，第3、5、7天下降，但高于NS组各相应时间点，差异有统计学意义（P<0.01）；AT组PaO2各相应时间点均低于NS组（P<0.01），第3、5、7天AT组PaO2高于PQ组，差异有统计学意义（P<0.01）；HE染色结果显示三组大鼠肺组织形态学变化具有明显不同；AT组肺组织SP-D含量第5、7天高于PQ组，而低于NS组各相应时间点，差异具·有统计学意义（P<0.01）。结论盐酸氨溴索具有抗炎作用及促进肺泡Ⅱ型细胞表面相关活性物质SP-D蛋白合成与分泌，对百草枯中毒所致急性肺损伤有一定治疗效果。【关键词】百草枯；急性肺损伤；肺泡表面活性物质相关蛋白-D；盐酸氨溴索

百草枯（paraquat，PQ）为中等毒性速效季胺盐类除草剂，在我国农村广泛使用，但其对人体毒性极大，且无特效解毒药，病死率高达60.0%～81.6%[1-2]。百草枯可经皮肤、呼吸道、消化道吸收，口服后吸收快，吸收后通过血液循环几乎分布于所有的组织器官，但主要蓄积在肺，导致急性肺损伤，晚期可发生肺泡内和肺间质纤维化，会导致难以治疗的呼吸衰竭，继而发生多器官功能障碍综合征及多器官衰竭而致患者死亡。因此，在百草枯中毒的早期是否能有效的治疗和逆转急性肺损伤（Acutelunginjury，ALI），是抢救的关键。盐酸氨溴索（ambroxolhydrochloride）是溴乙新的代谢产物，因具有祛痰并抑制支气管炎症作用3而成为一种新型治疗呼吸系统疾病的新型药物。本课题组研究发现给予百草枯中毒所致急性肺损伤大鼠大剂量盐酸氨溴索后，大鼠肺损伤减轻，这可能与盐酸氨溴索促进SP-A分泌有关4。研究发现肺表面活性物质相关蛋白-D（alveolarsurfaceactivesubstance-D，SP-D）在急性肺损伤中起着极为重要作用。因此，笔者拟通过腹腔注射百草枯，建立急性肺损伤大鼠模型，进而观察盐酸氨溴索对百草枯中毒致急性肺损伤SP-D的影响，并评价盐酸氨溴索对百草枯中毒治疗作用，为今后临床应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1主要试剂与药品

20%百草枯，先正达生物科技（中国）有限公司；盐酸氨溴索注射液，德国勃林格殷格翰公司；Ghrelin一抗（山羊来源多抗）SantaCruz，美国；二抗（兔抗山羊），北京中山金桥生物技术有限公司，中国。

1.2实验动物分组与处理

清洁级健康成年雄性SD大鼠120只，体质量200～250g，购自河北医科大学实验动物中心，实验动物合格证明书编号为：1203095。将SD大鼠饲养于SPF级实验室，一周后将120只SD大鼠随机（随机数字法）分为三个实验组：（1）生理盐水组（NS组，n=24），每日腹腔注射6ml/kg0.9%生理盐水；（2）百草枯中毒组（PQ组，n=48），以30mg/kg腹腔注射0.5%百草枯稀释液（抽取20%百草枯1ml，用0.9%生理盐水稀释为40ml，即为0.5%百草枯稀释液，每毫升稀释液含百草枯5mg），建立大鼠百草枯中毒模型；（3）盐酸氨溴索治疗组（AT组，n=48），百草枯注射后每日腹腔注射含盐酸氨溴索（35mg/kg）等容量生理盐水。三组再分别按时间点（第1、3、5、7天）随机（随机数字法）分为4个小组，PQ组、AT组每小组均为12只，NS组每小组为6只。

1.3血液标本的采集

以3%戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功后，将其置于手术台上（仰卧位），并固定。用碘伏消毒腹部皮肤，沿腹部正中线剪开腹壁，暴露腹腔，分离股动、静脉。无菌注射器抽取股静脉血2ml，注入抗凝血采血管1ml并充分摇匀，同时以毛细采血管采血20μl，以检测白细胞计数（whitebloodcount，WBC）和中性粒细胞（polymorphonuclear，PMN）百分比。无菌血气针抽取股动脉血1ml，并迅速将针尖插入橡皮塞内达密封状态，充分摇匀后测定动脉血氧分压（arterialoxygenpressure，PaO2）。

1.4肺组织标本采集

血液标本采集的同时，取出左、右肺组织，并用4℃生理盐水冲洗，左肺置于4%多聚甲醛固定液中固定24h后，制备石蜡切片，行HE染色观察肺组织形态学变化。右肺置于-80℃冰箱冰冻保存，通过Westernblot方法检测肺组织中SP-D蛋白含量。

1.5统计学方法

用SPSS13.0统计软件进行分析，数据以均数±标准差（x±s）表示，各组均数行正态性检验后采用单因素方差分析法（ANOVA）以LSD法做均数间两两比较，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1静脉血液中WBC的变化

NS组静脉血液白细胞计数各时间点差异无统计学意义（P>0.05）。第1天PQ组、AT组WBC计数均于中毒后升高，第5天时PQ组达最高值，各相应时间点均显著高于NS组（P<0.01）；AT组于第3天达最高值，第7天开始明显下降，但各相应时间点仍显著高于NS组，差异具有统计学意义（P<0.01），第1天AT组与PQ组异无统计学意义（P>0.05），第3、5、7天WBC计数均低于PQ组，差异具有统计学意义（P<0.01）（表1）。

2.2静脉血液中PMN百分比的变化

NS组PMN百分比各个时间点异无统计学意义。PQ组PMN百分比于第1天快速升高，第3天即达高峰，与NS组相比各个相应时间点均明显增高（P<0.01）。AT组第1天PMN百分比增高，于PQ组无明显差异（P>0.05），第3天达到最高值，第3、5、7天PMN百分比较PQ组明显下降（P<0.01），但仍明显高于NS组各时间点，差异具有统计学意义（P<0.01）（表1）。

2.3动脉血液中PaO2的变化

NS组动脉血液中PaO2各个时间点差异无统计学意义（P>0.05）。PQ组动脉血液中PaO2于第1天开始逐渐下降，于第7天下降至最低值，各相应时间点均明显低于NS组，差异具有统计学意义（P<0.01）。AT组PaO2各相应时间点均低于NS组，差异具有统计学意义（P<0.01）。AT组与PQ组相比：第1天两者异无统计学意义（P>0.05），第3、5、7天AT组PaO2开始增高，两者差异具有统计学意义（P<0.01）（表1）。

2.4大鼠肺组织HE染色光镜观察

NS组可见肺泡结构完整，排列整齐，分布均匀，肺泡腔内无炎性细胞侵润。PQ组第1、3天可见肺泡和肺间质轻度充血水肿，肺泡间隔增厚并有中性粒细胞侵润。第5、7天可见肺泡和肺间质充血水肿明显，部分肺泡萎陷，纤维母细胞增生。AT组与PQ相比，肺泡和肺间质充血水肿等表现均有所减轻。见图1。

2.5Westernblot法检测SP-D在肺组织中的表达

NS组大鼠肺组织SP-D含量在各时间点均无明显变化。PQ组肺组织SP-D含量持续下降，与NS组相比，各时间点SP-D含量均明显下降，差异具有统计学意义（P<0.01）。AT组大鼠肺组织SP-D含量第1、3天下降，较PQ组相比差异无统计学意义（P>0.05），经盐酸氨溴索治疗后，第5、7天肺组织SP-D含量增高，两者差异具有统计学意义（P<0.01）。AT组较NS组差异具有统计学意义（P<0.01）（表2）。

3讨论

百草枯中毒后可以引起肺组织缺氧、肺泡和肺间质水肿及肺间质纤维化，使PaO2的降低，并导致严重低氧血症5，这一系列的病理生理过程称为ALI6。盐酸氨溴索是临床上较为广泛使用治疗呼吸道疾病的药物，主要适用于痰液分泌不正常及排痰功能不良的急、慢性肺部疾病患者，能抑制机体炎症因子和炎症介质合成及释放，控制中性粒细胞的反应，使肺泡Ⅱ型细胞表面相关活性物质合成、分泌增加，强化肺的主动防御功能7。肺表面活性物质指由肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌的一种复杂的脂蛋白，其主要成分为二棕榈酰卵磷脂和表面活性物质结合蛋白（SP），分布于肺泡液体分子层表面，具有降低肺泡表面张力、维持大小肺泡容量的相对稳定、阻止肺泡水肿等作用。SP包括亲水性SP-A、SP-D和疏水性SP-B、SP-C，SP-D有先天主动防御、抗菌、抗氧化功能8。经盐酸氨溴索处理的急性肺损伤大鼠SP-D在肺组织表达明显增强9。在ALI患者中肺组织及肺泡灌洗液的SP-D含量减少，血浆SP-D水平升高，肺组织及肺泡灌洗液的SP-D含量越低；而血浆SP-D水平越高，肺损伤越重，患者预后愈欠佳。SP-D在ALI的发生发展中有着重要作用，并可能是氨溴索保护肺组织的重要机制。

在本研究中，笔者发现盐酸氨溴索可抑制百草枯中毒所致的WBC及PMN的升高，也明显减轻了大鼠肺间质中中性粒细胞浸润，AT组与PQ组相比肺泡水肿、渗出明显减轻，PaO2显著升高，这证实氨溴索对百草枯中毒引起的炎症反应具有一定的抗炎作用，并减轻了ALI，保护了肺功能；此外，经Western-blot方法检测，AT组的SP-D含量较PQ组显著升高，进一步提示盐酸氨溴索可通过促进SP-D的合成与分泌来减轻百草枯所致的ALI。

此次研究表明氨溴索对百草枯中毒大鼠有着良好的治疗作用，可以减轻全身及肺组织内的炎症反应，并通过促进肺泡表面活性物质的合成与分泌进一步减轻ALI，保护肺功能，这与之前的张月莉等10的相关报道相一致。氨溴索在抢救百草枯中毒中的作用值得在临床治疗中进一步研究和探讨。Pfeifer等11研究表明盐酸氨溴索在机体内达到一定浓度后，就具有很强抗感染能力，但作用机制还不清楚，有待于进一步研究。

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