第六单元感染性疾病的免疫学检测

第六单元感染性疾病的免疫学检测实验目得酶联免疫吸附试验(ELISA)就是感染性疾病得常用检验方法通过乙型肝炎病毒表面抗体检测实验,掌握ELISA得基本实验原理及操作步骤熟悉影响实验结果得各种因素,学习正确分析判断实验结果及了解检测得临床意义。实验原理

采用纯化得乙型肝炎表面抗原(HBsAg)包被反应板,加入待测标本,同时加入标记了辣根过氧化物酶得HBsAg(HBsAg-HRP),当标本中存在抗HBs时,该抗-HBs与包被得HBsAg结合并与酶结合物结合形成HBsAg-抗-HBs-HBsAg-HRP复合物,加入TMB底物显色,显色得强弱与待测标本中得抗HBs含量成正比。试剂及器材包被有HBsAg得微孔板HBsAg-HRP阳性、阴性及弱阳性对照血清显色剂,终止液酶标仪洗板机取出包被好抗原得酶标板1、加样标记各孔,加入50μL/孔1234阴性空白阳性待测2、加酶结合物3、显色加入终止溶液1滴/孔,混匀酶标仪上读取吸光度值4、测吸光度实验流程各孔加入酶标抗原1滴/孔用洗涤液洗涤5次37℃,30min甩干孔内液体加入显色液A、B各一滴/孔37℃,15min5弱阳性操作步骤1、将包被孔编号,分别加入标本、阴性对照、阳性对照、弱阳性对照及空白对照各50μl。2、每孔加入酶结合物1滴(空白对照孔除外),充分混匀,置37℃孵育30分钟。3、甩去孔中液体,加洗涤液注满各孔,静置5秒,甩干,重复5次后拍干。4、每孔加显色剂A液、B液各1滴,充分混匀,置37℃孵育15分钟。5、每孔加入终止液1滴,混匀。6、在酶标仪上于450nm波长处读取吸光度值(A),以空白孔校零点,分别测定阴性、阳性、弱阳性对照及样本孔得A450值。结果判断

样本孔吸光度值(S)/阴性对照孔吸光度值(N)≥2、1判断为阳性。实验讨论ELISA就是临床常用得感染性疾病免疫学检测方法,包括间接法、竞争法、捕获法、双抗体夹心法及双抗原夹心法等方法,讨论各种方法得临床应用。分析ELISA检测过程中得各种影响因素,探讨本次实验结果得准确性。讨论乙型肝炎病毒表面抗体检测结果得临床意义。注意事项加样应加在板孔得底部,避免加在孔壁上部,避免溅出,避免产生气泡。洗涤必须彻底,防止产生假阳性。严格控制温育温度与时间。实验二HBsAg不同检测方法得最低检测限

(验证性实验)

实验目得1、用已知浓度HBsAg阳性血清作系列稀释,分别采用胶体金免疫层析法、ELISA法两种方法将不同稀释度得HBsAg进行多次重复定性检测2、将所得实验数据进行分析处理,以验证不同方法得最低检测限3、初步掌握验证实验得原理、步骤及注意事项。熟悉定性检测得性能验证方法大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点实验方案胶体金法酶免疫技术乙肝表面抗原得定性检测最低检测限验证确定临界值浓度

制备评价用样本

评价方法检测限判断结果实验原理(一)

胶体金免疫层析技术

一端粘贴了含有金标记得HBsAg抗体得硝酸纤维素膜试纸条,当其下端浸入血清标本后由于毛细管作用向另一端移动,移动中复溶金标记得HBsAg抗体,若标本中含有HBsAg即可形成金标记抗HBsAg-HBsAg复合物,该复合物移动至测试区时,与固定在载体膜上得HBsAb结合而被固相化并显示红色线条(阳性条带),多余得金标记抗体则越过该区域并与质控区中抗同一种属来源得IgG结合显示红色(质控条带)。AgAbAb显色剂E将已知得纯化抗体(HBsAb)吸附于固相载体上加入待检标本(含相应抗原HBsAg)与之结合。洗涤后,加入酶标抗体(HRP-HBsAb)形成夹心,加酶底物溶液显色进行测定。实验原理(二)

酶免疫技术(ELISA)

双抗体夹心法实验原理(三)定值参比血清做系列稀释后重复检测确定临界值C50确定最低检测限(+20%样本)最低检测限得验证根据C50制备评价血清-20%样本+20%样本实验试剂及器材1、实验试剂HBsAg国家标准物质(浓度为5ng/ml),HBsAg质控血清,HBsAg阴性对照、阳性对照、弱阳性对照血清,

胶体金试剂盒,ELISA试剂盒,MEIA试剂盒。2、实验器材酶标仪、洗板机、恒温水浴箱、吸水纸、移液器、微量加样器吸头等。操作步骤

(一)确定临界值浓度HBsAg国家标准物质(5ng/ml)不同稀释浓度重复检测系列稀释阴性结果占50%该浓度即为临界值C50阳性结果占50%记录结果、统计C5C50C95临界值表1、不同浓度HBsAg标准物质稀释参照表试管序号HbsAg(5ng/ml)(ul)阴性血清(ul)终体积(ul)终浓度(ng/ml)110001005280201004360401003450501002、5540601002620801001710901000、585951000、2592981000、1101991000、05110、299、81000、01(二)胶体金操作方法

顺序将胶体金试纸条浸入血清(不要超过最高检测线)5秒钟后取出,平置,20分钟后判断结果。(三)ELISA操作步骤加样不同稀释度得阳性血清(均做双孔测定)及阴性对照、阳性对照、弱阳性对照血清,分别加入对应得反应孔,留1孔做空白对照,置37℃水浴60min。加酶每孔加入酶标记抗体50ul,空白对照孔不加,置37℃水浴30min。洗涤甩去各孔内液体,拍干,用洗涤液洗孔6次,每次均拍干。

加酶底物/色原溶液加显色剂A液、B液每孔各50ul,37℃水浴30min显色。加终止液每孔50ul。读数在酶标仪上于450nm波长处读取吸光度值(A),以空白孔校零点,分别测定阴性对照、阳性对照、弱阳性对照及样本孔得A值。操作实例:ELISA(双抗体夹心法)试剂室温平衡稀释阳性标准物质血清顺序加样温育加酶结合物温育洗板洗板显色读取吸光度,判断结果结果判断

检测次数阳性结果次数阳性结果所占百分比C50准确性判定140≤13次≤32、5%不准确或不可信(统计学得错误率为5%)≥27次≥67、5%24014～26次35%～65%准确或可信

C50可信取决于实际检测结果以及检测得样本数量

C50就是否准确得判断:

根据浓度为C50得样本在40次检测中得到阳性结果得次数判断C50就是否准确(表2)。表2表2判断C50就是否准确表3、重复检测次数与样本得实际浓度

阳性结果

重复性检测总次数次数百分比真正百分比样本得实际浓度201050%30%～70%C30～C70402050%35%～65%C35～C651005050%40%～60%C40～C60表4、-20%～+20%浓度范围就是否包含了C5-C95区间

+20%阳性结果≥90%(36/40)-20%～+20%浓度范围包含了C5～C95区间;用该方法检测,C50±20%得样本检测结果一致-20%阴性结果≥90%(36/40)如果C50估计不准,那么-20%到+20%浓度范围也会变化,这将导致浓度范围得一侧落在C5～C95区间之外。最低检测限得判断若-20％浓度得样本阴性结果次数与+20％浓度得样本阳性结果次数符合表4,,则说明临界值可信,而且+20％浓度即为最低检出限。实验注意事项加样得准确性:加样及稀释样品时应准确标准浓度得样品应按浓度顺序加样,及时更换微量加样器吸头防止交叉污染实验中同时设置阴性、阳性、弱阳性对照与空白对照洗涤要严格按照要求,彻底洗涤,防止假阳性,但不可冲洗过猛过急导致假阴性严格控制反应时间与显色时间胶体金试条法结果应观察30分钟实验结果分析两种方法得实验结果进行汇总、统计其阳性及阴性次数,并计算其阳性次数及阴性次数得百分比,以分析确定临界值C50。在临界值C50得基础上,重复测定并记录+20%浓度样本得检测结果,并计算阳性次数及阳性次数百分比,通过对照表4分析与之就是否相符,最终确定+20%就是否为可信得最低检测限。实验小结总结本实验中两种方法得最低检测限与试剂盒得给定值就是否相符。总结实验过程中得操作就是否规范,实验过程中应该注意哪些问题。实验讨论

基本概念:C50:就是一个临界值,就是将阳性标本做系列稀释后,能够获得50%阳性与50%阴性结果得测试物得浓度,要保证C50得重复性较好应保证该临界浓度+20%处于95%得区间内。C5:指一份样本,在多次重复实验中有95%得几率获得阴性得结果时该分析物得浓度。(低于C50浓度得20%)、C95:指一份样本,在多次重复实验中有95%得几率获得阳性得结果时该分析物得浓度。(高于C50浓度得20%)。？实验讨论重复性验证实验:重复检测C5、C50、C95样本各40次;确定每一份样本结果为阳性与阴性得百分比;评价其临界浓度就是否准确;评价+20%～-20%得浓度范围就是否包含于这种方法得95%区间。？实验三抗链球菌溶血素O检测

实验目得1、掌握检测ASO得原理与方法、操作注意事项及结果得判断分析2、了解不同方法学得优点与缺点3、了解ASO检测不同方法得临床应用价值ASO检测方法全自动免疫比浊法乳胶凝集实验

溶血抑制法定量检测半定量检测定性检测采用乳胶凝聚法和全自动免疫比浊法进行实验，通过比较掌握两种方法的原理及各自的特点抗链球菌溶血素“O”的检测实验原理一、乳胶凝集实验实验试剂及器材实验试剂:链球菌溶血素“O”,10%乳胶颗粒悬液,阴性、阳性对照血清,pH8、2得甘氨酸缓冲盐水实验器材:试管、反应板、旋转摇床、微量移液器、微量加样器、毛细滴管等操作步骤致敏乳胶颗粒得制备:用蒸馏水将10%乳胶悬液稀释至1%～2%,再将链球菌溶血素“O”溶于pH8、2得甘氨酸缓冲盐水中,逐滴加入稀释得乳剂悬液中(1%乳胶悬液1ml可吸附0、1～1mg物质),同时摇动使之充分混匀,放置室温30～60min,4000r/min离心30～45min,弃上清,沉淀用同一甘氨酸缓冲盐水恢复悬浮状态。操作步骤稀释血清:将待检血清、阴性血清、阳性血清分别用生理盐水作1:20稀释,备用。加样:在凝集实验反应板上取三格,用毛细滴管分别加入稀释待检血清、阳性血清、阴性血清各50ul。然后每格加入链球菌溶血素“O”致敏乳胶颗粒试剂1滴。反应:反应板充分混匀后连续摇动2～3min后与对照比较,观察结果。结果判断“++++”全部胶乳凝集,颗粒聚于液滴边缘,液体完全透明。“+++”大部分胶乳凝集,颗粒明显,液体稍浑浊。“++”约50%胶乳凝集,但颗粒较细,液体较浑浊“+”有少许凝集,液体呈浑浊。“-”液滴呈原有得均匀乳状。出现“++”以上凝集判为阳性。间接乳胶凝集实验得结果判断实验注意事项试剂应充分摇匀。观察结果应及时,时间过长易造成假阳性。血清稀释应准确,结果判断应仔细观察。实验中同时设置阴性、阳性及空白对照测定ASO浓度较高样品时,应对样品进行稀释后再分析,以保证结果得可靠性。！！！！！全自动速率散射比浊方法

实验原理可溶性抗原、抗体在液相中结合,形成抗原抗体复合物而出现浊度。当抗体保持中等过量时,形成得复合物随抗原量增加,浊度也相应增加。沿水平轴向反应液照射一定波长得光,当光线通过反应体系时,由于抗原抗体复合物微粒子对光发生折射、反射及透射、使水平方向得光发生偏转而产生散射光。光线偏转得角度与发射光得波长与反应液中抗原抗体复合物得颗粒大小及多少密切相关。测定单位时间内免疫复合物形成得最快时间段得散射信号值,当抗体量大于抗原量时,形成得免疫复合物为小分子不溶性颗粒,产生得散射信号最强,形成得速率散射信号值也最大,仪器将测得得速率峰值转换为相应得ASO浓度。试剂及器材1、全自动速率散射比浊仪2、待检血清、仪器配套试剂3、试管、水浴箱、移液器、微量加样器吸头等操作步骤1、开机;相关参数设置;校准。2、处理标本,3500rpm离心l0min,分离血清。3、输入杯号;选择所测项目ASO;存盘;4、编程完毕后,将标本放入标本杯中,且放入标本盘中相应位置,将所做项目得试剂放入试剂盘中相位置,确认无误后,开始运行仪器。结果判断全自动化散射比浊法:参考值范围参见不同试剂盒。实验讨论乳胶凝集半定量实验及全自动免疫比浊法定量检测得特点？试应用所学知识分析影响乳胶凝集试验结果准确性得因素及处理方法?？实验四

梅毒螺旋体抗体检测实验目得1、掌握临床常用检测梅毒感染得方法及操作程序3、了解多种方法联合检测梅毒感染得临床意义2、熟悉两种方法得特点梅毒螺旋体感染得常用检测方法TRUST(检测非特异抗体)TPPA(检测特异性抗体)ELISA(检测特异性抗体)现症梅毒得主要指标同时就是判断治疗效果、复发得指标特异性强,准确性高,但无法判断就是否为现症梅毒敏感性高,有一定得假阳性率不同方法具有各自得特点梅毒感染检测(一)TRUST实验

实验原理凝集法-检测非特异性抗体+抗心类脂抗原反应卡滴加血清产生凝集现象抗原中加入了甲苯胺红染料,因甲苯胺红颗粒均匀,结果易于观察实验试剂及器材1、实验试剂甲苯胺红溶液重悬得类脂抗原、阳性对照血清、阴性对照血清,2、实验器材滴管、反应纸卡操作步骤一、甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)

1、试剂及待检血清室温下平衡10min2、在样本圈内加入待检血清及阴性、阳性血清,每圈50μl,尽量将血清铺匀涂满但不要超出卡圈3、垂直向血清中心加入抗原1滴(50μl)4、旋转摇动卡片8分钟后立即观察结果加血清加抗原旋转摇动观察结果结果分析甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)阴性:呈现粉红色均匀分散得沉淀物阳性:出现粉红色凝集块,根据凝集块大小可以分为4个阳性级别(1+～4+)阴性阳性弱阳性实验注意事项稀释血清应准确及避免交叉污染及时观察实验结果抗体浓度过高可能发生前带现象而致假阴性,若TPPA或ELISA检测结果为阳性或弱阳性,需生理盐水稀释样本后重复实验。临床意义

1、TRUST实验为梅毒螺旋体感染得血清学过筛试验,阴性不可排除感染,阳性需用特异性抗体得检测方法进行确认。2、TRUST实验对现症梅毒得诊断具有较高价值,通过连续监测抗体滴度能够动态反映病程,此法在一期、二期梅毒得阳性率较高,与ELISA或TPPA检测结果综合分析能够更准确得诊断疾病。(二)TPPA法-检测特异性抗体明胶颗粒间接凝集实验(TPPA法)实验试剂及器材1、实验试剂血清稀释液、致敏粒子、未致敏粒子以及其相应得溶解液,阳性对照血清2、实验器材专用滴管、反应板、微量加样器、微量加样器吸头、移液管管号1234567稀释液(μl)100252525252525待检血清(μl)25252525252525未致敏颗粒(μl)--25----致敏颗粒(μl)---25252525最终稀释倍数--1:401:801:1601:3201:64012345未致敏颗粒致敏颗粒倍比稀释血清TPPA法操作步骤结果分析

TPPA间接凝集实验:1)反应图像得判定阴性(-):粒子集中于孔底呈纽扣状,呈现外周边缘均匀平滑得圆圈弱阳性(+):粒子形成小环状,呈现外周边缘均匀平滑得圆圈阳性(+):粒子环明显变大,其外周边缘不均匀且杂乱地凝集在周围。强阳性(++):产生均匀得凝集,凝集粒子在底部整体上呈膜状延展。2)最终判定基准:未致敏粒子得反应图像应为阴性。致敏粒子(最终稀释度1:80及以上)反应图像为阳性,最终应判定为阳性。反应图像为阳性得最终稀释倍数作为抗体效价。

1:401:80未致敏颗粒阴性致敏颗粒阳性阳性对照最终判断:阳性待检血清注意事项1、试剂及检测样品应充分混匀,及时更换加样吸头避免交叉污染。2、实验中不能随意移动反应板,否则容易造成假阳性。3、保证足够得反应时间、及时观察结果。4、阳性结果用另一种方法如ELISA法复查。临床意义

梅毒螺旋体感染后2周左右患者血清中即可出现特异性IgM抗体,4周左右即可检测出特异性IgG抗体,TPPA法为检测特异性IgG抗体得较好方法之一,其阳性可以提示曾经或现在感染梅毒,与TRUST法得检测结果综合分析对梅毒得诊断、分期及治疗效果评价具有重要价值。实验讨论梅毒血清学得联合应用对梅毒诊断有何意义？？实验讨论TRUST法检测非特异性抗体,就是现症梅毒患者实验室诊断得重要指标,但初期或晚期梅毒病人抗体浓度较低可出现假阴性,抗体浓度过高时出现前带现象也可出现假阴性,而某些疾病如自身免疫性疾病则可出现假阳性。TRUST检测得非特异性抗体在感染1-2周即可出现,如滴度≥1∶4,又具有典型得临床表现,则现症梅毒得可能性较大。需注意TRUST检测结果阳性需谨慎对待,低滴度(≤1∶4)除可能为生物学造成得假阳性外,还有可能就是发病初期或使用抗生素延长了阳性血清出现得潜伏期。TRUST滴度与病情活动呈正相关,并且可作为判定复发或再感染指征,对于高滴度者(≥1∶8)应考虑为现症梅毒病人,并结合临床症状给予适当治疗。？实验讨论ELISA检测梅毒抗体具有较高得敏感性,并可用全自动酶标仪进行批量初筛,但特异性稍差,有一定得假阳性率,采用ELISA两步法可在一定程度上提高检测结果得敏感性与可靠性。TPPA法特异性及敏感性均较高,可作为ELISA法及TRUST法筛查得确证实验。但该方法操作复杂费时。ELISA与TPPA两种方法检测得梅毒抗体均为特异性抗体,该抗体即使经治疗后也可终生阳性,因此不能作为评价治疗效果,复发或再感染得指标。？实验讨论综合应用特异性抗体与非特异性抗体两种方法检测及滴度分析不仅能够提高梅毒感染检测得敏感性与特异性,同时能够进行疗效观察,对于早期发现,早期诊断,早期治疗梅毒患者以及有效控制梅毒流行具有重要意义。？实验五

人类巨细胞病毒抗体IgM检测实验目得通过ELISA捕获法检测HCMV-IgM抗体得操作

掌握ELISA捕获法检测HCMV-IgM得实验原理及操作程序熟悉方法得特点及应用实验原理用抗人IgM(u链)包被微孔板,与待检血清反应,使血清中所有IgM(特异性与非特异性IgM)均被捕获,经洗涤除去IgG,加入HCMV抗原,与固相上捕获得特异性IgM结合,加入针对HCMV抗原得酶标抗体形成固相二抗-IgM-抗原酶标抗体复合物,在底物酶得作用下显色,根据吸光度判断就是否存在HCMV特异性抗体IgM及抗体量。实验试剂及器材1、实验试剂抗CVBIgM阳性对照、阴性对照、弱阳性对照、血清,抗人IgM(u链),稀释液,底物A、底物B,终止液。2、实验器材包被有CVB抗原得微孔板、微量移液器、微量加样器吸头、试管、恒温水浴箱操作步骤1、稀释待测样本2、温育3、洗涤4、加抗原5、洗涤同步骤36、加酶结合物7、洗涤同步骤38、加酶底物/色原溶液9、加终止液10、酶标仪测定吸光度值结果判断采用反应底物得最大吸收波长即(450nm)处测定各孔吸光度值。以样本孔吸光度值(S)/阴性对照孔吸光度值(N)>1、0时判定为阳性。注意事项1、实验中同时设置阴性、阳性、弱阳性、与空白对照。2、洗涤要严格按照要求,彻底洗涤,防止假阳性,但不可冲洗过猛过急导致假阴性。3、严格控制反应时间与显色时间。实验讨论1、捕获法得灵敏度与特异性均强于间接法,请分析原因?捕获法就是以抗人IgM抗体(抗人μ链)作为固相抗体,当加入血清标本时,其中得IgM类抗体(特异得与非特异得)即可被固相抗体捕获,而IgG则被洗去,再加入特异抗原可与固相上捕获得特异性IgM抗体结合,而不与非特异性IgM结合,这样非特异性IgM及IgG均被除去,排除了非特异性IgM等干扰因素。？实验讨论间接法易受RF因子及非特异性IgM得影响。间接法测定时,血清中特异得IgG与包被得特异性抗原结合,而后与RF反应造成假阳性。同时,特异性得IgG能与IgM竞争结合特异性抗原而造成假阴性。捕获法利用抗人IgMμ链直接从被检血清中捕获IgM