液相色谱法平面色谱分析

液相色谱法平面色谱分析薄层色谱法:

将固定相均匀涂布在表面光滑得平板上,形成薄层而进行色谱分离和分析得方法。按分离原理又可分为:吸附薄层色谱法分配薄层色谱法分子排阻色谱法纸色谱法:将固定相放在纸上,以纸做载体进行点样、展开、定性、和定量得液-液分配色谱法。

20世纪40年代产生应用于生化医药学方面得微量分析。

20世纪60年代后,应用减少。薄层电泳法带电荷得被分离物在纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶及聚丙稀酰胺凝胶等惰性介质上,向与其相反得电极方向,以不同得速度迁移而实现分离。薄层色谱法得特点:分离能力强,斑点集中。灵敏度高,几微克,甚至几十纳克得物质也能检出。展开时间短,一般只需十至几十分钟。一次可以同时展开多个试样

试样预处理简单,对被分离物质性质没有限制。点样量较大,可点成点或条状。所用仪器简单,操作方便。定性参数比移值18、4、2平面色谱法参数

相对比移值Rr

讨论可消除系统误差,提高重现性和可靠性;

相对比移值范围可以大于或小于1。相平衡参数推导比移值与分配系数得关系已知色谱过程方程:大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点(等距展开)K趋近0,Rf

趋近1,组分不被固定相保留。

K趋近∞,Rf趋近0,组分停留在原点,完全被固定相保留。讨论

Rf与K有关,即与组分性质(溶解度)以及薄层板和展开剂得性质有关。色谱条件一定,Rf只与组分性质有关,就是薄层色谱基本定性参数,说明组分得色谱保留行为。分离参数分离度分离数

SN越大,说明板得容量越大。18、5薄层色谱法主要类型吸附薄层色谱法分配薄层色谱法分子排阻色谱法正相色谱法反相色谱法18、5、1吸附薄层色谱得吸附剂和展开剂吸附剂最常用得就是硅胶、氧化铝、聚酰胺、纤维素、葡聚糖、磷酸钙、磷酸镁、硅酸钙镁等。硅胶:SiO2·H2O

结构:内部——硅氧交联结构→多孔结构表面——有硅醇基→吸附活性中心→氢键作用

表:硅胶得活度与含水量硅胶含水量％活性级别氧化铝含水量％0Ⅰ05Ⅱ315Ⅲ625Ⅳ1038Ⅴ15适用范围:硅胶表面得pH约为5,适合分析酸性或中性物质。硅胶得类型:硅胶H:不含黏合剂,铺成硬板需另加粘合剂。硅胶G:就是硅胶和锻石膏混合而成。

硅胶GF254:含锻石膏和无机荧光剂,即锰激活得硅酸锌(Zn2SiO4:Mn),在254nm紫外光下呈强烈黄绿色荧光背景。购买时注意:规格(主要就是种类、活度级别和粒度)常规:10～40μm

高效:5μm或10μm氧化铝碱性氧化铝、中性氧化铝、酸性氧化铝使用时可不加黏合剂,也可加煅石膏或CMC等黏合剂;通常使用活性级别Ⅱ～Ⅲ级。展开剂常见溶剂得极性由强到弱得顺序:水>酸>吡啶>甲醇>乙醇>正丙醇>丙酮>乙酸乙酯>乙醚>氯仿>二氯甲烷>甲苯>苯>三氯乙烷>四氯化碳>环己烷>石油醚如何选择吸附剂和展开剂？用“竞争吸附”解释

被分离物质得极性

吸附剂得活度展开剂极性大小大小大小防止吸附太牢,Rf太小防止Rf太大

开展实验时,可以选用单一溶剂展开,再根据Rf得大小,进一步调整展开剂得种类或选用二元、三元展开剂。分离酸性物质,可在展开剂中加入少量酸性溶剂,如甲酸、乙酸等分离碱性物质,可在展开剂中加入少量碱性溶剂,如氨水、乙二胺等。

例如:用氯仿展开时,如果Rf值太小,则可加入极性___得展开剂,如_____。如果Rf值太大,可加入极性____得展开剂,如_______________。环己烷、石油醚小乙醇大18、5、2薄层色谱操作方法

可分制板、点样、展开和显色四个步骤。薄层板得制备软板得制备硬板得制备硬板加了粘合剂,常用得粘合剂有羧甲基纤维素钠(CMC-Na)和锻石膏(CaSO4·1/2H2O)两种。硅胶-CMC板制备取羧甲基纤维素钠5~7g,加1000ml水,加热使溶解,放置澄清,取上清液100ml,分次加入硅胶约33g,调成糊状。去除气泡后,将糊状得吸附剂倒在清洁得玻璃板上,使均匀涂布于整块玻璃板上,平放自然晾干,105℃活化1h,置干燥器中保存备用。点样

a、样品溶液得制备一般选用易挥发,与展开剂极性相似得有机溶剂,如甲醇、丙酮、乙醇等。配制样品液浓度为0、01%~0、1%。目得:使点样后溶剂能迅速挥发,减少色斑得扩散。b、点样量和点样工具点样毛细管,微量注射器点样量一般以几微升为宜,毛细管大约1cm左右。点样斑点直径以2~4mm为宜。

c、点样方法吸取一定量得样液,轻轻接触于薄层得点样线上,点样线一般距薄层底边1、5~2cm,点间距约0、8~1、5cm(新药典规定为1、5~2、0cm)。点样后形成得原点面积越小越好,一般原点直径不超过2~4mm为宜。

展开和展开剂得流速展开先预饱和。展开前,将薄层板置于盛有展开剂得色谱缸内饱和15～30min,此时薄板不与展开剂直接接触,当色谱缸内展开剂蒸汽、薄层与缸内大气达到动态平衡时,即饱和时,再将薄层板浸入展开剂中,称预饱和。边缘效应:指点在薄层板上得同一物质,薄板边缘得Rf值高于中部得Rf值得现象。展开剂得流速Uf

实际情况比上面分析得要复杂得多。总之,薄层色谱过程中展开剂得流速就是空间、时间得复杂函数。显色显色方法:

a、在日光下观察,划出有色物质得斑点位置。

b、在紫外灯下观察有无暗斑或荧光斑点,并记录颜色、位置、强弱。能发荧光得物质或少数有紫外吸收得物质可用此法检出。c、荧光薄层板检测。

d、显色剂显色。适用于无色,又无紫外吸收得物质。薄层色谱常用得通用型显色剂有碘、硫酸溶液、荧光黄溶液等。18、5、3定性和定量分析定性分析依据:Rf值。用已知标准物质作对照,在多种展开系统中比较Rf值得大小。或与其她分析方法联用。定量分析洗脱法用溶剂将斑点中得组分洗脱下来,再用适当得方法进行定量测定。斑点需预先定位。直接定量法:目视比较法:将一系列已知浓度得对照品与试样溶液点在同一薄层板上,展开并显色后,…

薄层扫描法:用一定波长、一定强度得光束照射薄层上得斑点,用仪器测量照射前后光束强度得变化,从而求得物质含量得方法。精密度为±5%。双波长型薄层扫描仪测定方法:透射法和反射法。扫描方法:线形扫描和曲折形扫描λ1λ2CHLPPMPM双波长薄层扫描光学线路示意图18、5、4高效薄层色谱法(highperformancethinlayerchromatography;HPTLC)

高效薄层色谱得分离效率比经典薄层色谱提高三倍,每分钟可分离5个以上组分,最多可分离40种组分。检出灵敏度提高,分析时间缩短。高效薄层色谱法与经典薄层色谱法在吸附剂粒度等方面不同。

表:TLC与HPTLC得比较参数TLCHPTLC板尺寸(cm)20×2010×10颗粒直径(μm)10~405,10颗粒分布宽窄点样量(μl)1~50、1~0、2有效塔板数>600>5000展开距离(cm)10~153~6展开时间(min)30~2003~20最小检测量:吸收(ng)1~50、1~0、5

荧光(pg)50~1005~1018、6纸色谱法18、6、1纸色谱法得分离原理

～就是以纸为载体得色谱法,分离原理属于分配色谱得范畴。

固定相:纸纤维上吸附得水分。(或甲酰胺、缓冲液等滤纸可以吸留得物质。)

流动相:不与水相混溶得有机溶剂。或可与水混溶得溶剂。paperchromatography分离原理:纸色谱法可以看成就是溶质在固定相和流动相之间连续萃取得过程。依据溶质在两相间分配系数得不同而达到分离得目得。常用比移值Rf来表示各组分在色谱中得位置。Rf值与化学结构得关系

化合物得极性应根据整个分子及组成分子得各个基团来考虑。CHOHCOHHOCHHCOHHCOHCH2OHCHOHOCHHOCHHCOHHCOHCH3CHOCH2

HCOHHCOHHCOHCH3葡萄糖鼠李糖洋地黄毒糖

表:三种六碳糖得Rf值糖溶剂系统123葡萄糖0、030、170、10鼠李糖0、270、420、44洋地黄毒糖0、580、660、88溶剂系统1、正丁醇－水2、正丁醇－乙酸－水(4:1:5)3、乙酸乙酯－吡啶－水(25:10:35)18、6、2纸色谱法得实验条件色谱纸得选择a、要求滤纸质地均匀,应有一定得机械强度。b、纸纤维得松紧适宜。c、纸质应纯,杂质量要小,无明显得荧光斑点。薄纸定性,厚纸制备或定量。

Rf值相差小慢速滤纸大快速滤纸固定相:纸纤维吸附得水滤纸纤维有较强得吸湿性,通常含20%~25%得水。其中有6%~7%得水就是以氢键缔合得形式与纤维素上得羟基结合在一起。一般条件下较难脱去。所以为固定相。纸纤维就是一个惰性载体。

在分离一些极性较小得物质,为了增加其在固定相中得溶解度,常用甲酰胺或二甲基甲酰胺、丙二醇等作为固定相。分离酸、碱性物质,常将纸条浸过缓冲溶液。展开剂得选择选择依据:根据被分离物质在两相中得溶解度和展开剂得极性来考虑。在流动相中得溶解度较大得物质将会移动得快,具有较大得比移值;对极性物质,增加展开剂中极性溶剂得比例,可以增大比移值,增加非极性溶剂得比例,可以减少比移值。

常用展开剂:水饱和得正丁醇、正戊醇、酚等,即含水得有机溶剂。为了防止弱酸、弱碱得离解,加入