轮状病毒重组亚单位疫苗的制备及配方初筛

轮状病毒重组亚单位疫苜的制备及配方初筛

H录

摘要,II1WW

关糙诃,111111111

AbstractIV4V4V

Keywords1VIVIV

前言1

I材料

1.1实验动物

1.2主要材料

1.3实验仪器

2方法

2.1重组“I克隆曲株筛选及蛋白表达

2.1.1重组质粒转化及重组单克隆菌株希选

2.1.2重组蛋白诱导表达及形态检直

2.1.3重组蛋白分析鉴定

2.1.3.1SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定版组目的蛋白

2.13-2WB鉴定重组目的蛋白

2.2疫苗配制

2.3动物免疫实验

2.3.1动物分组

2.3.2动物免疫与血清收集分离

2.3.3ELISA检测血清抗体滴度

3结果

3.1重组唯克隆曲体筛选结果

3.2重组菌诱导后菌体形态检查1244U

3.3重组蛋白SDS-PAGE电泳检测及WcslcmBlot鉴定124342

3.4小鼠血清抗体滴度检测13UU

4.讨论I84W

5结.论I844H^

致谀212+20

*

文觎综述

轮状病毒疫苗研究现状及展望

14一4

I概述

14一4

2轮状病毒性状及结构

144

3轮状病毒疫苗现状

22孥2

4人轮状病毒VP4(P)分布的大陆变异类型

缪

5非红制型轮状病毒疫苗研究进展黎

6VP8业基的新型轮状鬲虫疫苗进展

7展望

轮状病毒重组亚单位疫苗的制备及配方初筛

摘要

目的:原核表达轮状病毒结构蛋白VP4的三个亚型蛋白P4、P6、P8,将此重组蛋白作为抗原，用

氢氧化铝作为佐剂配制成疫苗后免疫BALB/c小鼠，考察其安全性和免疫原性，井对铝佐剂的免

疫增强效果、铝佐剂在疫苗成品配制中的必需性以及三个抗原成分的最佳组合方式进行验证；同

时验证相较于各组分的独免疫，三种抗原成分同时免疫实验动物是否会相互I：扰和影响。方法：

通过基因工程技术在大肠杆菌内诱导表达轮状病毒核衣壳上结构蛋白VP4中三个亚型结构蛋白

出p6、p8,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测目的蛋白的表达血蛋白免疫印迹法(WesternBbl,

WB)鉴定里组蛋白。将纯化后里组蛋白作为疫苗中抗原成分，与福佐剂通过多种不同的组合方

式制备总共9种不同组分的疫苗，免度BALB/c小鼠获取抗体血清，海联免疫法(ELISA)检测

血清中IgG抗体含量，最终筛选出免疫效果最佳的重组轮状病毒疫苗配方。结果:重组蛋白

VP4-P4/P6/P8在大肠杆两中均成功表达，动物实验表明重组蛋白均具有免疫原性；铝佐剂在亚单

位疫苗中不仅是必需的而且还能大大增强抗原的免疫原性；同时三个蛋白分别吸附铝佐剂后再混

合的三价疫苗免疫小鼠后产生的抗体滴度更高，且三个蛋白混合后相互之间不产生抑制作用。结

论：通过此试验初步确定疫苗中的主要成分组成，最终筛选出最佳疫苗配方为单个蛋白分别吸附

铝佐剂后再混合的三价疫苗.

关键词

重组蛋白、非亚制型轮状病港亚单位疫苗、免疫原性、血清抗体

III

Preparationandformulationofrotavirusrecombinantsubunit

vaccine

Abstract

Objective:ThethreesubtypesofrotavirusstructuralproteinVP4-P4/P6/P8wereexpressedinE.coli.

Therecombinantproteinwasusedasantigen;aluminumhydroxidewasusedasadjuvanttoimmunize

BALB/cinice.anditssafetyandimmunogenicitywereinvestigated.1(wasused(overilyiheimmune

enhancementeffectofaluminumadjuvant,thenecessityofaluminumadjuvantinthepreparationof

vaccineandthebestcombinationofihreeantigencomponents.Ai(hesamelime,whethertheihreeantigen

componentswouldinterfereandaffecteachotherafterimmunizingtheexperimentalanimals

simultaneouslywasexplored,comparedwithindividualcomponents.Methods:Threesubtypesof

structuralproteinsofrotavirusnucleocapsidVP4-p4/p6/p8wereinducedandexpressedinE.coliby

geneticengineering.TheexpressionofthetargetproteinwasdetectedbySDSpagepolyacrylamidegel

electrophoresis.Thethreerecombinantprotcirswereidentifiedbyimmunoblotting(WesternBlot,WB).

Thepurifiedrecombinantproteinsusedastheantigencomponentofthevaccinewerepreparedtoatotalof

9differentcomponentsofthevaccinebydifferentcombinationswithaluminumadjuvant.Allthevaccines

wereusedtoimmuneBALB/cmiceloobtainiheantibodyscrum.TheantibodytilcrofIgGinserumwas

detectedbyenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA).Finally,thebestrecombinantrotavirusvaccine

formulawithIhebestimmuneeffectwasselected.Results:TherecombinantproteinV?4-P4,'P6/P8was

successfullyinducedandexpressedinE.coli.Animalexperimentsshowedthattherecombinantprotein

hadimmunogenicity.Aluminumadjuvantwasnotonlynecessaryinsubuniivaccine,butalsogreatly

enhancedtheimmunogenicityofantigen.Athesametime,theantibodytiterofmiceimmunizedwith

threeproteinsadsorbedaluminumadjuvantandmixedwithtrivalentvaccinewashigher,andthethree

proteinshadnoinhibitoryeffectoneachother.Conclusion:Throughthisexperiment,themain

componentsofthevaccinewerepreliminarilycetermined.andthebestvaccineformulawasselectedasthe

irivalentvaccineinwhichthealuminumadjuvantwasadsorbedbyasingleprotein.

Keywords

Recombinantprotein.Non-replicatingrotavirussubunitvaccine.Immunogenicity.Scrumantibody

IV

前言

1963年，轮状病毒(RV)第次出现在人们视线中是在疲衿的小鼠中；在［•年之后，澳大利亚学

者发现人轮状病看山，该糊而归属于呼肠弧病而，是双链RNA病毒，形态结构为球形⑶，完整的人

体轮状病毒生理结构为内层、中间层、外层三层衣壳结构。轮状病毒分为双壳颗粒和单壳颗粒两种

形态，其中成熟的双壳颗粒具有感染性，单壳颗粒表现为粗糙的形态不具有感染机体的能力⑶。轮

状病毒基因组由6个编码结构蛋白和5个编码非结构蛋白的基因片段组成，在病毒中结构蛋白为

VPI-4,VP6、VP7和非结构蛋白为NSPI-6。在人体受到感染时，刺激机体产生具有消灭病诉的中

和抗体的是结构蛋白VP4和VP7,因此在感染轮状病毒时，VP4和VP7在生命体的免疫保护方面十

分重要网。VP4分子量约为88KD,在病毒的最外层形成刺突，由基因片段4转录表达而来。VP4属

于蛋白防敏感蛋白，容易被胰蛋白酶消化水解为VP5和VP8两个蛋白，胰蛋白酚消化引起的VP5

结构变化导致病毒感染力的地强⑸，有可能是因为胰蛋白所消化引起了变构作用，通过调N细胞膜

的渗透作用从而增强了轮状病毒的感染力叫，VP7分子量大约为37KD，属于糖蛋白，是由基因片段

9转录表达而来，是外壳主要蛋白，同时和VP4之间存在相互作用，从而影响VP4和细胞特异性受

体的相互作用并最终影响轮状病毒的感染力I

RV是在全球范|制内造成五岁以下儿童严重腹泻的主要发病源。无论是在医疗、经济水平均发达

的西方国家还是在医疗服务系统、经济水平较落后的非洲地区，大部分三岁以下的婴幼儿均会感染

轮状病毒导致严重腹泻甚至脱水死亡，每年造成数百万人感染入院就医，146.000-215.000人死亡，

且大约85%的死亡率发生在亚非发展中国家及贫穷地区时叫此现象可能是经济落后地区的紧急医疗

服务体系未完善以及在婴幼儿时期营养不良、并发症等原因造成。目前，针对这一高发病率和死亡

率的疾病，由罗特威、Rctateq以及Rotarix三种减揖活疫苗已经上市多年，这些疫苗均表现出较好

的预防效果，但是存在肠套叠风险，而旦口服减毒活疫苗在肠道内存在首过效应从而降低抗原的免

疫原性，因此欲提高疫苗的免疫原性和安全性，利用釜因工程技术原核表达目的抗娱，作为亚不位

疫苗抗原成分，同时将注射给药作为给药途径。在全球范围内导致病毒感染的主要抗原为VP4结构

蛋白中P4、P8两个亚单位蛋白，但是对于亚非国家而言，导致患病的抗原却为VPS中P4、P6、P8

三科抗原，因此选用VP4的亚型蛋白P4.P6.P8作为疫苗抗原成分，进行小儿腹沟预防性亚单位

疫而配方的初步筛选研究，有望开发出免疫原性及安全性更高的小儿腹泻预防性疫苗。

SouthAmericaAfrica

Australla/Oceanla

(n-1937)(n-5934)

成都疾学靛学士学位论支

图1-1：人类轮状病毒VP4亚型各州分布

Figure1H:Continentalvariationinthedistribution(1978-2003)ofhumanrotavirusVP4(P)Types

1材料

1.1实验动物

95只6同龄SPF级锥性云南小鼠，购自四川达硕。

1.2主要材料

实验室所购买试剂及材料如表1-1所示,

表1-1实骏主要材料

试剂厂家

TMB显色液BeyotimeBiotechnology

Gl-anti-MsIgG(H+L)SeconlaryAnlibcdy.HRP1NVITROGEN

conjugate

醵联免疫板CORNING

PIPETTIP百赛生物

CentrifugeTube(2.5ml)BIOLEADER

SDS-聚丙烯眈胺凝胶配制试剂盒BeyotimeBiotechnology

LoadingBufferBeyotimeBiotechnology

AP-labledGoalAnti-MouselgG(H+L)BeyotimeBiotechnology

脱脂奶粉伊利公司

硝酸纤维素膜biosharp

铝佐剂迈科康生物科技有限公司

蛋白分子量标准品BeyotimeBiotechnology

考马斯亮蓝超快染色液BeyotimeBioiechnology

牛血清白蛋白国药集团化学试剂TT限公司

SDS-PAGEHepes电泳液BeyotimeBioiechnology

BCIP/NBTAP显色试剂盒BeyotimeBiotechnology

甫组质粒(pet-28a-VP4-p4/阿P8)GenscriptBiotechnology

BL-21(DE3)感受态细胞GcnscriplBioiechnology

革兰式染色试剂盒Solarbio

相关试剂的具体配置方法如下：

LB液体培养基(500ml)

腆蛋白陈500g

酵母提取物5.00g

NaCI2.50g

调PH于7.2,再定容至500ml。

LB固体培养基(200ml)

胰蛋白陈2.00g

醉母提取物2.00g

NaCI1.00g

琼脂3.00g

TB培养基(1000ml)

胰蛋白陈12.00g

酵母提取物24.00g

KH2PO4.3H2O2.31g

K2HPO416.43g

甘油4inl

RO水900ml

待药品完全溶解后定容至1000ml,高压蒸汽灭菌121七、SOmino

PBS缓冲液(1000mL)

KCL020g

KH2PO40.20g

NaCI8.00g

Na2HPO4.7H2O2.16g

RO水9C0mL

调pH于7.4,再定容至1000mL。

0.5MIPTG诱导剂（lOmD

IPTG0.079g

RO水1.00ml

待药品完全溶解后再用0.22umi虎器过滤，分装，-20七保存.

l*PBST(1000ml)

KCL020g

KH2PO40.20g

NaCI8.00g

Na2HPO4.7H2O2.16g

RO水9C0mL

吐温201.00ml

调pHJ-7.4,再定容至1000mJ

50mg/mI硫酸卡那霉素(1ml)

硫酸卡那霉素0.05g

RO水900ul

再定容至l.00ml.0.22um滤器过海分装，-20'C保仇

l*TBS/0.1%BSA（封闭液500ml）

1*TBS500ml

BS/X050g

溶解后4c保存。

l*TBS/0.01%BSA/0.05%吐温-20（稀释液1000ml）

1+TBSlOOOml

BSA0.100g

吐温-200.5ml

溶解后4c保存。

0.1MNa2cO3碳酸钠（包被液1000ml）

Na2c0310.60g

RO水9（X）inl

溶解后调节PH至9.4,再定容至1000ml,常温保存。

1M磷酸（终止液1000ml）

浓磷酸67.5ml

RO水定容至1升，室温保存。

转膜缓冲液（1000ml）

甘氨酸14.30g

Tris-base2.90g

甲醇200ml

再定容至1000ml,4c保存。

pH6.8浓缩胶缓冲液（Imol/LTris-HCI）

Tris6.06g

RO水40mL

HCI（4mol/L）调节至pH6.8

RO水定容至50mL

放置在4C冰箱里保存。

pH8.8分离胶缓冲液(1.5mol/LTris-HCI)

Tris9.08g

RO水40mL

HCI(4mol/L)用节至pH8.8

RO水定容至50mL

放置在4c冰箱里保存。

TBS缓冲液（10X）

Tris24.20g

NaCI180.00g

RO水900mL

浓盐酸调节至7.6再定容至1000ml,用时先稀释为I叮BS,并补加0.1%的吐温-20后配制

成1*TBST。

WB封闭液

IXTBST缓冲液100mL

脱脂奶粉5.00g

溶解,现用现配。

TG缓冲液

三羟甲基氨基甲炕15.12g

甘氨酸72.00g

加水溶解，稀释至500ml,4C冰箱保存。

EBM缓冲液

TG缓冲液20ml

甲醇40ml

加水稀释至200ml,4C冰箱保存。

TTBS缓冲液

三羟甲基氨基甲烷5.05g

氯化钠4.50g.

吸取吐温8055ml，加水适量,用盐酸调pH值为7.5,加水稀择至500mL4℃冰箱保存。

1.3实验仪器

实验所需具体仪器如表UI-2所示。

走1-2实盼仪器

名称型号来源

脱色摇床SLK-03003-SSCILOGEX

二级生物安全柜BSC-I004IIA2安泰空气技术有限公司

电子天平MLI602TMETTLER-TOLEDO

PH计FE-28梅特勒-托利多仪器

纯水仪AWL-1001-H重庆硕阳企业发展有限公司

医用冷藏箱YC-395L美菱低温科技有限公司

医用低温保存箱DW-25W5I8海尔特种有限公司

台式高速离心机TH-42453洪达医疗器械有限公司

通风橱TG-I6蜀科仪器有限公司

洗板机MQ-3CLAB

恒温生化培养箱ME-D-005Thenno

电动移液器LRH-25O一恒科学仪器有限公司

紫外可见分光光度计YE17CAG9124852TOPFCIEN

超声破碎仪752Pro菱光技术有限公司

三角瓶SCIENTZ新芝生物科技股份行限公司

凝胶电冰套装GG-17蜀牛公司

凝胶成像系统165-8001Bio-Rad

SCG蛋白纯化系统1850勤翔科学仪器有限公司

移液涔SCGI00-F2赛谱仪器有限公司

高速冷冻离心机YE17CAG9124899TOPFCIEN

台式小型制冰机TGL-2150蜀科科技有限公司

酶标仪IMS-20雪科电器布•限公司

立式压力蒸汽灭菌锅FCThenno

生物显微镜YXQ-LS-75II网讯实业有限公司

载玻片ML31-B明美科技有限公司

脱色摇床7015信泰医疗器械厂

成都疾学靛学士学位论支

2方法

2.1重组单克隆菌株筛选及蛋白表达

2.1.1重组质粒转化及重组单克隆菌株筛选

取已经构建成功的重组质粒（金丝瑞构建）Pet-28a-VP4-P4,Pet-28a-VP4-P6.Pet-28a-VP4-P8.

各lul加至50ul的感受态细胞（BL2I-DE3）中,同时再取50ul感受态细胞不加入质粒作为阴性对

照，样品均轻轻混匀,使感受态细胞与质粒充分接触.将样品置于冰水中冰溶30min后，在恒温水

浴锅以42c条件热激45s,取出再进行2min冰浴，向反应结束后的样品中加入30CulLB液体培养

基.在恒温摇床中以37C、180rpm的条件震荡培养40min0吸取釐荡培养后的菌液20uL加至含有

Kana的LB固体培养基上，均匀涂布后，放置于37c恒温静育箱中培养15h,获取单克隆菌落。次

日，分别挑取Pct-28a-VP4>Pet-28a-VP6sPct-28a-VP8各10个靠近中央区域的单克隆菌落至含有

Kana（终浓度为50ug/ml）的10mlLB液体培养基无菌试管中，在恒温摇床中以37P、220rpm的条

件过夜培养。次日，每株单克隆菌均进行甘油保种，-8（TC保存。同时分别将各单克族菌株各取lOOul

（1%）加至10ml含有Kana（浓度为50ug/ml）的LB液体培养基，以18匕，200rpn的条件震荡培

养2坤，进行小量诱导表达筛选出高效表达目的蛋白的菌株。

2.1.2重组蛋白诱导表达及形态检测带得式的：3州.摘进：忏行共进：o字符

将高效表达目的蛋白的甘油菌分别进行活化处理，取甘油保存菌种各100ul（l%）加入含有Kana

（浓度为50ug/mD的10mlLB液体培养中,在恒温摇床中以37C、220rpm的条件震荡培养过夜。

次日，进行扩大培养实验，分别取300ul菌液加至30ml含有Kana（终浓度为50ug/ml）的LB液体

培养基，以37C、220rpm的条件震荡培养4h左右，丁生物安全柜中取出2ml菌液，利用紫外可见

分光光度计检测菌液的OD600值，检测结果OD600值均达到0.6-0.8后分别取3ml诱导前菌液作为

对胫样品，随后在菌液中加入IFIG（终浓度为0.5mM）,在18C,200rpm的条件下培养20h,进

行歪组目的蛋白的低温诱导表达。取诱导后荔液样品1003,利用革兰氏染色法进行菌体染色，检测

大肠杆菌是否被杂菌污染。

2.1.3重组蛋白分析鉴定

2.1.3.1SDS-PAGE聚丙烯饿胺凝胶电泳鉴定重组目的蛋白

（I）蛋白定量：紫外分光光度计测定二个菌株诱导前后菌液OD值，通过对应的OD值，调整OD

值为3.2,取相应体积的的液，使其总蛋白量较为合适以便在凝胶上展现清晰的蛋白条带。

（2）菌体洗涤：将步骤（D中所取菌液以IfOOOrpm进行离心处理Imin,弃离心上洁后，加入500ul.

IXPBS重悬离心后的菌斑，在l5000rpm条件离心Imin,重发此步骤2次，彻底洗去培养基等杂质。

（3）菌体超声破碎：3mlPBS重悬菌体，利用细胞超声破碎仪粉碎菌体使其内容物释放。

（4：，样品制备:取100ul菌体破碎混悬液,离心，I5000rpm,20min,分离上清和沉淀，以获取细

胞不溶性蛋白和可溶性蛋白样品。诱导前样品及超声后沉淀样品分别用lOOul,IxPBS缓冲液重悬处

理，取诱导的对照样品、超声破碎后混悬液、超声破碎后上清样品以及超声破碎后沉淀样陆（以便

确定目的蛋白的表达形式）各40皿分别加入10ul的蛋白上样缓冲液，混匀，煮沸5min.

⑸SDS-PAGE聚丙烯凝胶电泳:每孔10ul样品，Maker加样2uD加样结束后先用80V进行电泳

20min,再调节电压为150V电泳30iniru通过老马斯亮蓝超快染色液染色30min后在圆周震荡器上

进行脱色处理直至没有蓝色背竞颜色，再利用凝胶成像系统留图。

2.1.12WR鉴定重组目的蛋臼

（I）总蛋白定量：紫外分光光度计测定三个菌株诱导前后菌液OD值，调整OD值为3.2使其总蛋

白量较为合适以便在凝胶上展现清晰的蛋白条带.

（2）菌体洗涤：500ul,1XPBS重悬离心后的菌体,离心，l5000rpm,Imin,重现2次。

（3）菌体超声破碎：诱导后样品均用3mlPES重悬，利用细胞超声破碎仪粉碎菌体使其内容物释放。

（4）样品处理：取lOOul菌体破碎混悬液，离心，l5000rpm,20min,取超声后菌体混悬液、上清

6

样品、诱导前样品各40ul,分别加入10ul蛋白上样缓冲液,混匀，煮沸5min。

(5)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：每孔103样品，Maker加样2ul,加样结束后先用80V进行电泳

20min,再调节电压为150V电冰30min0

(6)转膜：轻柔剥下分离股后，根据分离胶的大小裁剪PVDF膜1张和6张波纸。将剪好的PVDF

膜在使用前用纯甲醇浸泡约I分钟后，蒸饨水再双泡2分钟以去除多余甲静，防止PVDF膜活化过

度。将胶、膜、纤维垫、/纸6片，浸入预冷的EBM缓冲液中平衡10分钟，从负极:黑板)到正极(透

明板)方向依次为纤维型、滤纸3张、凝胶、PVDF膜1张、滤纸3张、纤维垫。放入装有冰袋的转

膜槽中，打开电源，在300mA条件下，转膜时间约40分钟后取出PVDF膜，用1TBS缓冲液在圆

周振荡器上洗膜1次，5分钟/次。

(7)封闭：将转膜结束的PVDF膜移入盛有适量封闭液的孵育盒中，在4c条件下，封闭过夜；次

日，取出封闭结束后的PVDF膜，TTBS洗膜1次。

(8)一抗孵育：取对应的一抗试剂(VP4d5C9、VP6-15C9.VP8-7H7),用封闭液分别稀释不同的

一抗。室温摇床孵育2h或4'C过夜。

(9洗膜:取出一抗孵育结束后的PVDF膜，用TTBS缓冲液在圆周振荡蹲上震藻洗膜4次，5分＜:葡福画:项H符号和编号

钟/次。

(1。)二抗孵育:用5%脱脂牛奶按1:2000稀释AP-lahledGoatAnti-MouseIgG(H+l.),在室温条件

下报床孵育lh.

(II)洗膜：取出PVDF膜，用TTBS洗膜4次，置摇床上5分钟/次。

(12)BCIP/NBT显色：按产品说明，配制显色液，室温、避光孵育5~15分钟后终止显色反应。拍

照，存图。

2.2疫苗配制带格式的：2级,无项目符号或访

纯化后的重组蛋白样品联合铝佐剂，共制备成9种不同配方的疫苗，具体配制方法见下表:

表2-1疫苗配方

疫苗编号VP4-P4蛋白VP4-P6蛋白VP4-P8蛋白铝佐剂.1一格式表格:

A+---

B-十-一

C--+-

D4---4-

E-+-+

F--++

G+++-

H.十十十

J++++

说明：+表示疫苗中加有对应的试剂成分，-表示疫苗中未加对应的试剂成分。H组疫苗表示三种亚

单位蛋白混合后可吸附铝佐剂：J组疫苗表示三种亚单位蛋白分别吸附铝佐剂后可氾合。

2.3动物免疫实验

2.3.1动物分组

选择5-6周龄(SPF级)BLAB/c小鼠95只，均购买白成都达硕实验动物有限公司。采用随机分组

的方式进行，I®机挑选5只小鼠作为对照组，剩余小鼠随机分为9组，10只/组，5只/笼。实验组小

就具体分组情况,如下表：

表2-2实胎组小鼠分组

小鼠编号小鼠性别疫苗编号

1-5雄A

6-10雄A

11-15雄B

16-20雄B

21-25雄C

26-30雄C

31-35蚯D

36-40雄D

41-45雄E

46-50雄E

51-55雄F

56-60帷F

61-65雄G

66-70雄G

71-75雄H

76-80雄H

80-85雄J

86-90雄J

2.3.2动物免疫与血清收集分离

免疫前至少在物房适应观察一周以匕实验过程中观察并记录小鼠的健康状况。实验组小鼠免疫

途径为背部多点皮下注射，每只动物每次注射剂量为0.2mL疫苗。对照组小鼠每只注射0.2mL生理

盐水。前两次免疫分别于笫I天和第21天进行，，在第二次免疫后14天(D35),采用眼胞取血方

式拉取小鼠血样，约200W只，采集血样完成后在5000rpm条件下离心lOmin,使血清与血细胞分

离，收集血清样品至无菌1.5mL试管中，-80C保存备用。在第40天进行第三次免爱，第56天采用

顼机脱臼方法处死小鼠，收集所有血清＜D56).采集血样完成后以5000叩”离心lOiuiu,分离血清，

收集至无菌试管中，-80C保存。

233ELISA推测血清抗体滴度带格式的:3级，缩迸：首行缩进：0字符

对第二、三次免疫后所有血清中三种抗原特异性抗底福医进行检测，具体臃作步骤如下：带格式的二字体：(中文)照体,小四

带格式的:一字体：(中文)黑体,小四

(1：抗原包被：用包被液稀释P4、P6、P8三个抗原至Ipg/ml浓度，50W孔。密封包被好的ELISA

板并置于¥C冰箱孵育过夜。

⑵洗板:用1xPBST洗3次，150期孔。

(3)封闭：lxTBS/0.1%BSA,100四孔，室温，孵育I小时。

(4)洗板：用IxPBST洗3次，150皿孔。

(5)血清抗体孵育：用IxTBS/O.OI%BSA/U.05%Twecn20按比例进行梯度稀释，第二次免疫后血

消稀释方法如下：10川血清加入1000m血清稀稀液中(1:100),混匀，依次4倍稀择(100回待稀

释样品+300间稀释液)，8个梯度(1:100,1:400.1:1600.I：6400,1:25600,1:102400,1:409600,

1:1638400)。第三次免疫后血清稀理方法如下：1贝血清加入1000m血清稀祥液中(1:1000),混匀，

依次4倍稀释(100可待稀释样品+300”稀释液)，8个梯度(1:1000,1:4000.1:16000,I：64000.

1:255000.1:1024000.1:4096000,1:16354000),倒掉封闭液。加入稀释好的样品50回/孔。室温

孵育2h・

(6)洗板：用IXPBST洗3次，I50W孔。

8

（7）二抗孵育：用IxTBST/O.OI%BSA/0.05%Tween20稀群羊抗鼠-HRP（1:5000）,50川孔。

（8-洗板:IxPBST洗5次，150M孔。

（9：TMB显色：加入TMB显色液，50W，孔，避光孵育10分。

（10）终止：向显色盒中加入1MH3P04终止液，503/孔，以终止颜色反应，防止过度反应造成实

验数据误差。

（II）读板：利用分光光度计读取OD450。

3结果

3.1重组单克隆菌株筛选结果

将构建成功的Pet-28a-VP4-P4/P6/P8三科重组质粒转入感受态细胞中，经过平板划线法得到单克

隆菌落，每个平板中随机挑取10个旅近中央的单克隆菌落，经过平板划线法得到单克隆菌落，每个

平板中随机挑取10个靠近中央的的克隆菌落，经诱导表达发现：所有携带Pct-28a-VP4的E.coli均

高效表达了分子量约为20KD的目的蛋白（图3-1-a、d、g）.其中目的蛋白VP4-P6、VP4-P8在菌体

以可溶性和不溶性蛋白两种方式表达，且表达量大体相近（图34-c、f、h、i）：而目的蛋白VP4-P4

大都分以可溶性形式表达（图3-l-b、c）.通过SDS-PAGE聚丙烯凝胶电泳可判断E.coli-VP*P410

个单克隆菌株中2、3、7号表达量相对较高（3-l-a）；E.coli-VP4-P610个单克降菌株中9号表达量

相对较高（图3-Ld）；E.cokVP4-P810个单克隆菌株中6、7、8号表达量相对较高（图32g）。因

此，E.coli-VP4-P4.E.coli-VP4-P6,E.coli-VP4-P8分别选用7、9、8进行后续大量诱导表达。

nBs—B

I^

-■T

B9V

SIS—a

B—I9

a）E.coli-VP4T4单克隆街悚b）E.coli-VP4-P4单克隆菌株

诱导后公西委白分析谤导后上讣受白分析

泳道I:BSA泳道1:BSA

泳道2:诱导肝泳道2、3、4.5.6、7、8、9.10.II:

泳道3、4,5、6、7、8、9、10,II.12:克住前1,克隆茵1、2、3、4、5,6,7,8、9、10号

2、3、4,5、6.7.8、9、10号诱导晨达后全苗登诱导表达后上清买白样

白样永道12:诱导前

泳道13：Milker泳•道13：Maker

9

1234567891011121312345678910111213

擀

25KD

I5KD

15KD

c)E.COli-VP4-PS单克隆西林d)E.COli-VP4-P6单克得的林

诱导后沉发受白分析诱导生菌爰白分析

泳逍1:诱导表达杭泳道1:BSA

泳道2,3.4、5.6.7,8、9.10,II:克咏道2:Maker

隆茴1、2,3、4.5.6、7、8、9、10号造泳道3、4、5、6、7、8、9、10、II、12:克

导表达后沉淀量自样。隆苗1.2.3,4、5.6.7.8.9、10号语

*苴12：Maker导表达后生的蛋白样

泳逍13:BSA泳道13:诱导未达利

12345678910111213

12345678910111213

U

二

・

二

25KD