基因工程的基本工具和基本操作程序-2026高三生物一轮复习

第55课时基因工程的基本工具和基本操

作程序

课程标准解读

i.概述基因工程是在遗传学、微牛.物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而

来的。2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基

本工具。3.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的

构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。4.活动：DNA的粗提取

与鉴定。5.活动：利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定或运用软件进行

虚拟PCR实验。

考点一重组DNA技术的基本工具

必备知识梳理♦夯基础

1.基因工程的概念

概念

操作

分子水平一

水平-原理一基因重组

创造出更符按照人们的愿

合人们需要段卜望，通过转基因

的新的生物T目的卜

等技术，赋予生

美型和生物物新的遗传特性

产品

操作克服远缘杂交不

生物体外一

环境优点/翻的障碍，鲍

17

改造生物的遗传

与杂交育种相比性状

与诱变有种相比

2.基因工程的基本工具

(1)限制性内切核酸酶(限制酶)

再要来叫原核生物

种类•分离的限制醐有数千种

作用识别双链DNA分子的特定核甘酸序列,

限一~~"使每一•条链中特定部位的磷酸二酶键断开

制

酷「切割位置:识别序列的中心轴线两侧

£coRI

黏性5-GAATTC-3,GAATTC

(在G与

A之间3-CTTAAG-5'CTTAAG

切割)中轴线’

结果

切割位置:识别序列的中心轴线处

SmaI

平一

I(在G与5—CCCGGG-3'CCCGGG

末端

C之间

3-GGGCCC-5'GGGCCC

切割)

中轴线

I提醒

①限制晦的识别序列一般由6个核甘酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核甘酸组

成。

②限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键。

③在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割两次此DNA分子，产生4个末

端。只有这样才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。

(2)DNA连接酶

些也将双链DNA片段“缝伊起来，恢复被限制

一酶切开的磷酸二酯键

DNA

来源大肠杆菌

连E.coliDNA

接连接再功能“缝合”互补的黏性末端

酣和平末端，但''缝合”平木

端的效率低

类型来源T4噬菌体

T4DNA

功能“缝合”互补的黏性末端

连接前

和平末端

4提醒

①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合萌是把单个的脱氧核管酸连接到

已有的DNA片段上。

②DNA聚合酹起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。

(3)载体

种类「质粒(常用载体):坏状双捱DNA分子

唾苞住、动植物病毒等

有一个至多个限制解切割位点

「携带外源DNA片段的质粒进入受体细

我持占

7一卫也一胞后，能在细胞中进行自我复制，或整

IT-------------

合到受体DNA上,随受体DNA同步复制

常有特殊的皿基因，便于重组DNA

分子的筛选

作用携带外源DNA片段进入受体细胞

|辨析与表达.

(1)通过基因工程技术能够定向改造生物的遗传性状，(V)

(2)£co〃DNA连接酶只能连接黏性末端。(X)

(3)DNA连接酶具有特异性，只能连接同一种限制性内切核酸酶切割形成的黏性末端。

(X)

(4)若两种限制酶的识别序列相同，则形成的末端一定能通过DNA连接晦相互连接。

(X)

(5)限制性内切核酸酶识别序列越短，则该序列在DMA中出现的概率就越大。(7)

(6)载体质粒上常有特殊的标记基因，以便于重组D、A分子的筛选。(J)

(7)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因。(X)

(8)(选择性必修3P72正文)天然的DNA分子不能直接用作基因工程载体的原因有哪

些？

提示：天然的DNA分子一般不完全具备作为载体的全部条件，需要进行人工改造后才

能用于基因工程操作。

核心素养达成/♦破考向

考向围绕重组DNA技术的基本工具考查科学，思维))

1.(2025•福建厦门模拟)BamH1、MboI、SmaI三种限制酶的识别序列和切割位

点依次为5"-GIGATCC-3\5，一\GATC-3\S'-CCCIGGG-31如图表示某DNA片

段的部分碱基序列，已知其余序列不含这三种限制酸的识别序列。下列叙述正确的是

(C)

5,-------------------------------------------------------------------3，

GGATCCCCCGGGCCCGGGGGATCC

,：

1,।a

,CCTAGGGiGGCCCGGGCCCCCTAGG

3,-------------------------------------------------------------------5，

卜634bp0|­►896bp---------卜758bp

A.若用SmaI完全力割该DNA,则其产物的长度为634bp、896bp、75Xbp

B.若虚线方框内的碱基对被T—A替换，则用S加H完全切割该DNA可产生3种片

段

C.若用Mb。1和&mHI切割该DNA,可形成相同的黏性末端

D.用SmaI切割该DNA产生的片段，用E.coliDNA连接酶重新将其连接效率较高

解析：SmaI的识别序列为5f-CCCIGGG-3\则用Sma\完全切割该DNA会产生三

个片段，即637bp、890bp.761bp,A错误；若虚线方框内的碱基对被T—A替换，则用

SmaI完全切割该DNA可产生2种片段，B错误；BamHIMboI识别的序列分别为

5，-GIGATCC-3，、5r-IGATC-3r,则二者切割该DNA,可形成相同的黏性末端，C正确：

用S〃心I切割该DNA产生的片段为平末端，用£co〃DNA连接酶连接效率低，D错误。

2.(2024・江西卷)y-级基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱竣酶

(GadB)催化L-谷氨酸脱竣是高效生产上氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将

酿酒酵母S的L-谷氨酸脱竣酶基因导入生产菌株E.c。〃力构建了以L-谷朝酸钠为底物

高效生产丫•氨基丁酸的菌株下列叙述正确的是(D)

NeoI和即“I___

o

质粒

E.cohA

(含多克隆位点)

NcoI和Kp〃I

重组灰粒

PC..双再叫

酿®酒酵母SE.coliB

A.上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到大量目的基因gad8

B.£c。〃〃发酵生产y-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能

C.E.coliA和£.co〃B都能高效降解y-氨基丁酸

D.可以用其他酶替代Na【和以〃I构建重组质粒

解析：从酿酒酵母S中分离得到含有目的基因取油序列的染色体DNA,如题图所示，

若要获取大量目的基因，需要进行PCR和酶切，A错误；题意显示，用L-谷氨酸脱蹂晦(GadB)

催化L-谷氨酸脱废是高效生产r氨基丁酸的重要途径之一，£co〃8中能表达L-谷氨酸脱期

酶(GadB),因此可用发酵生产y-氨基丁酸，该过程中L-谷氨酸钠的作用不是供能，

B错误；E.coliA中没有L-谷氮酸脱较酶(GadB),因而K能使L-谷氨酸钠脱疑，而E.coliB

中含有该酶的基因，因而能使L-谷氨酸钠脱瘦，高效生产y-氨基丁酸，C错误；除了Nc。1

和Kp〃I外，还有其他的限制酶可选，此外，构建重组质粒也未必非要用这两种酶，而是

可以用同足晦替代，D正痈。

/归纳总结

与DNA有关的酶的比较

名称作用部位作用底物作用结果

将DNA切成两个或多个片

限制酶磷酸二酯键DNA

段

将两个DNA片段连接为一

DNA连接酶磷酸二酯键DNA片段

个DNA分子

以DNA单链为模板，将单

DNA聚合酶或热稳定

磷酸二酯键脱氧核昔酸个脱氧核甘酸依次连接到

DNA聚合酶

DNA单链末端

将DNA片段水解为单个脱

DNA(水解)酶磷酸二酯键DNA

第,核甘酸

将双链DNA分子局部解旋

解旋晦碱基对之间的氢键DNA

为单链，形成两条长链

核糖核将单个核糖核昔酸依次连

RNA聚合梅磷酸二酯键

甘酸接到RNA单链末端

考点二基因工程的基本操作程序

必备知识梳理♦夯基础

1.目的基因的筛选与获取

(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产

物等的基因。

(2)筛选合适的目的基因

①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。

②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。

(3)目的基因的获取

①人工合成目的基因，

②常用POt特异性地快速扩增目的基因。

#提醒I

①在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、(1CTP),既可作为合

成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。

②引物是一小段单锥的DNA或RNA,作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3,

端，使DNA聚合酶能够从引物的3,端开始连接脱氧核苗酸。

2.基因表达载体的构建——基因工程的核心

(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代，同时使目的基因能

够表达和发挥作用。

(2)基因表达载体的组成及作用

/目的基因:编码蛋白质的基因或具有调

控作用的因子

竹嬴启动子:RNA聚合施识别和结合的部位

W表达载体以转录的终点,在转录过程中

复制八起调控作用

原点近逞里:鉴别受体细胞中是否含有

目的基因

«提醒

启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比

起始终止

项目启动子终止子

密码子密码子

本质DNADNAmRNAmRNA

位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端

RNA聚合酶识别

翻译的结束信号

和结合的部位，使转录在所需要辨译的起始信号

功能(正常情况下，

驱动基因转录出的地方停下来(编码氨基酸)

不编码氨基酸)

mRNA

(3)构建过程

我体（质粒）

外源DNA

同种限制前切割

I------------L,5ZZ1

DNA连接的少两个切口，获得

、⑤,”的基因

基因表达载体（质组质粒）

3.将目的基因导入受休细胞

受体细胞导入方法内容

①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入壬蜃中：

花粉管

②植物受粉后，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使

通道法

植物细胞目的基因借助花粉管通道进入胚囊

农杆菌农杆菌细胞内的Ti质粒上的T-DNA可携带目的基因整合到受体

转化法细胞的染色体DNA上

显微注射

动物细胞常用受体细胞：受精卵

技术

Ca?一处用C'a2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子

原核细胞

理法的生理状态

4提醒

①农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的

T-DNA±,第二次拼接（非人工操作）是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色

体DNA上；第一次导入是导入农杆菌，第二次导入（非人工操作）是将含目的基因的T-DNA

导入受体细胞。

②导入的目的基因可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体

DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染工

4.目的基因的检测与鉴定

I

分子春检测个体生物学

水平鉴定

|辨析与表达

（1）目的基因就是指编码蛋白质的基因。（X）

（2）DNA片段的PCR犷增实险中反应缓冲液中的Mg2+能够激活时高温的DNA聚合酶。

（J）

（3）一个基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、起始密码子和终止密码子等结构。

（4）培育抗虫棉时，将抗虫基因插入农杆菌Ti质粒的T-DNA片段内。（J）

（5）若受体细胞为大肠杆菌，则需先用Ca?+处理，更利于实现转化。（J）

（6）若能在植物细胞中检测到相应的目的基因，则说明基因工程项目获得成功。（X）

(7)检测转基因抗虫棉是否具有抗虫性状时，选择转基因棉花与普通棉花分别接种等量

棉铃虫进行比较。(J)

(8)用PCR不能直接扩增mRNA的原因是PCR是片:DNA双筵作模板的，不能直接用单

缮RNA做PCR,必须把mRNA逆转录成单链cDNA之后再做PCR。

(9)(选择性必修3P81“资料卡”)农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，

为什么能将目的基因导入受体细胞并整合到染色体DNA上?

提示：农杆菌能将Ti质粒上的T・DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的

染色体DNA上。

关键能力提出♦研趋势

【情境应用】如图是PCR反应过程示意图。

DNAI5-

模板\k〜)

f4种脱氧核£“耐高温的DNA聚合酶

普酸”引物

'DQUUUIUIIUIOUUI3,,…,___________

53

3iuimimiui5.miiiiiiniiiiiimiiHiniDiin

持了增的DNA片段/111

,iiiimmimi[n|；nnniQ5总

3mimmiiiiL洒1111111111111115,

变性3‘复性‘延伸

【问题探究】

(l)PCR技术需要引物的理由是DNA聚合解不能从要开始合成DNA.只能从3'端延伸

DNA链。

(2)利用PCR技术扩增目的基因时需要两种引物，原因是目的基因的两条反向平行的捶

都作为模板,其碱基序列不同'

(3)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序

列)都不合理(如图)，请分别说明理由。

第组引物f弓I物I

11nCAGGCT

1引物niiiiii

AGCCTG

第2组引物［HI*—AACTG—CAGTT

［引物n，.——........——

CGACTGATTA

①第］组：引物I和引物II局部发生碱基互补配对而失效:

②第2组：引物「自身折■后会出现局部碱基互补配对而失效。

(4)为检测胚乳细胞中畋基因是否表达，科研人员提取胚乳中的总RNA,经逆转录过

程获得总cDNA,通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA,原因是

引物是依据法基因的一段已知片列设计合成的(或引物能与仍:基因的cDNA特异性结合)。

(5)若一个DNA分子在PCR中经过〃轮循环，理论上需要消耗多少个引物？第〃轮循

环需要消耗多少个引物？

提示：经过〃轮循环需要消耗引物数为Q的-2)个，第〃轮循环需要消耗的引物数为2〃

个。

归纳总结L

PCR扩增过程中的循环图示与规律

Rimnnnn幅t，

□吧手

3，.¥flnnE手

*3m的nnnu皿哆

一目标序列

一•依具序列

口引物A：；阳理"；：HnnH

口引物B

缰环1:循环2:循环3:

变性+复性+延伸变性+及性-莫・变性♦复性・英仲

循环次数123n

DNA分子数2482“

含引物A（或B）的DNA分子数1,72”-1

0=2=6=

同时含引物A、B的DNA分子数2〃一2

2'-222-223一2

2=6=14=

共消耗的引物数量2〃+1—2

2|+,-222+1-223+-2

核心素养达成/♦破考向

考向1结合目的基因的筛选与获取考查科学思维

1.（2025•江苏南通模拟）引物的设计是影响PCR扩增反应的效率和特异性的关键因素,

相关叙述正确的是（B）

A.引物的碱基数量越少，则复性温度越低、目标DNA获得率越高

B.根据需要可在引物的5,端添加限制酶识别序列、点突变序列等

C.两种引物的复性温度差异较大，可减少引物与模板的非特异性结合

D.引物的G—C含量越高，结合特异性越强，越利于目标DNA的扩增

解析：复性温度与时间取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，引物的碱基数量越少，

则复性温度越低，但能与引物发生配对的片段就越多，目标DNA获得率越低，A错误；根

据需要可在引物的5'端添加限制酶识别序列、点突变序列等，以便更加准确地获得目的基因，

B正确；两种引物的复性温度差异较大，导致不能同时复性，甚至一条链在延伸，一条链在

复性，可增加引物与模板的非特异性结合，C错误；引物的G—C含量越高，结合特异性越

强，但G—C含量过高，不利于复性，从而阻碍目标DNA的扩增，D错误。

2.（2022•辽宁卷）抗虫和耐除草剂玉米双抗12—5是我国自主研发的转基因品种。为

给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因检测，反应程序如图所示。

下列叙述正确的是（B）

预变性「变性：

941minIQJ.八\!

/匕30\延伸；后延伸

\复性.2tC,30s172P,1min

58P,30s

：<--------35次循环-------->;

A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制

B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分

C.延伸过程无须引物参与即可完成半保留复制

D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市

解析：预变性是使模板DNA充分变性，A错误：后延伸过程是为了使目的基因的扩增

更加充分，B正确：延伸过程需引物参与，C错误；转基因品种不仅需要检测是否含有目的

基因，还要检测目的基因是否表达以及转基因产品可能存在的安全性问题后才可上市，D错

误。

考向2围绕基因工程的基本操作程序考查科学思、维、科学探究））

3.（2023・湖北卷）压氨莘青霉素抗性基因（4叩R）、四环素抗性基因（定乔）作为标记基因

构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酸切后的质粒构建基因

表达载体（重组质粒），弃转化到受体菌中。下列叙述错误的是（D）

A.若用〃加dHI酸切，目的基因转录的产物可能不同

B.若用P以I酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因

C.若用即力I酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否

D.若用如〃I酶切，携带"的基因的受体菌在含Amp（氨茉青霉素）和Tet的培养基

中能形成菌落

解析：若用小〃dHI酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能

不同，A正确；若用2%I酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因（在力，因此在含

Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确：重组质粒的大小与质粒不

同，DNA凝胶电冰技术可以分离不同大小的DNA片段.能够鉴定重组质粒构建成功与否，

C正确；SphI的晦切位点位于四环素抗性基因中，若用SphI酪切,重组质粒中含氨节青

霉素抗性基因（力〃?〃R）,但四环素抗性基因（7?力被破坏，因此携带目的基因的受体菌在含Amp

（氨羊青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。

/归纳总结

限制酶的选择技巧

1.根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类

PsiISma1PstI

III

SmaIEcoR1

图1

（1）应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图1可选择RfIo

（2）不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图1不能选择S〃?al。

（3）为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基

因和质粒，如图1也可选择用PstI和EcoRI两种限制携（但要确保质粒上也有这两种晦的

切点或切割后有与之相同的末端）。

2.根据质粒的特点确定限制酹的种类

其以点不

在启动子

与终止子—»XhoI其会破坏启动子,

之同，不HindlW不宜选择

宜选择

抗生启动子NdeI

其位于启动子、终

素抗XbaI

止子之间，宜选择

PstI性基因

终止子风BamHI

其会破坏终止子.

其会破坏EcoRI

不宜选择

标记基因,

不宜选择

复制原点被破坏后，目的基因不能在受体匆胞中复制，不宜选择

4.（2024・重庆卷）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。

我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较

小），然后克隆了该基因i两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相

关研究。

①表达载体

限制酶识别位点

（小〃dlll,SpeI,£coRI,XhaI）

②启动子D+基因S

5'.........TAGAATTCCA.........3'

3'.........ATCTTAAGGT.........5'

③四种限制酶识别序列及切割位点

HindDI：SpeI：EcoRI：XbaI：

1rii

5'AAGCTT3'5'ACTAGT3'5/GAATTC3,5'TCTAGA3'

3,TTCGAA5,3,TGATCA5,3'CTTAAG5'3'AGATCT5'

tttt

注箭头表示薛的切割位置。

（1）基因S启动子的某本组成单位是脱氧核糖核苔酸（脱氧核昔酸）。

（2）通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大

豆品种YZ。根据如图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目

标序列的完整性，不宜使用的限制版是EccR1；此外，不宜同时选用前苏eI和筋〃I。

原因是酶切后形成的片段黏性末端相同,易自我环化：不能保证目标片段与载体定向连接。

（3）为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制的对•重组表达载体酹

切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体

片段、启动子D+基因S片段。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的

技术是因工。

（4）用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆

的“启动子T+基因S”序列成功导入Y乙所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-L

综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是品种DN的基因S上游启动子效应比TL强.

使得基因S表达量更高,种子更大.

解析：(1)启动子是RNA聚合酹识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA

片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苔酸。(2)根据图示信息可知，“启动子D+基因S”

的DNA序列上存在EcoRi的识别序列，若使用限制酶EcoRi,会使目的基因序列被破坏：

根据图中限制酶的识别序列及切割位点可知，限制酶即eI和XbaI切割产生的黏性末端相

同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，

以及无法保证目的基因片段与载体片段定向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。

(3)DNA也泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅

有启动子D+基因S片段，还有酹切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大

小的标准参照物外，还应有隘切后的空载体片段和启动子D+基因S片段；在分子水平上检

测目的基因是否转入成功可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或

目的基因是否转录出mRNAo(4)根据题目信息可知，再生植株YZ-1导入的目的基因为取自

品种DN的“启动子D+基因S”序列，再生植株YZ-2导入的目的基因为取自品种TL的

“启动子T+基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测：品种

DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T,启动子D使基因S表达量更

高，因而种子更大。

/归纳总结

如何筛选出含有目的基因的受体细胞

1.原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目的基因插入某种

抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性

基因内部，则四环素抗性基因失活。

2.被转化的细菌有三种：含目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。

3.筛选方法：将细南先放在含氨节青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的

细菌和含质粒的细菌，如图中1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的

培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4,则在含四环素培养基上不生长的即含有重组质粒

的菌落，如图中1、5菌落。最后，可在含氨节青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。

考点三DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴

定

必备知识梳理♦夯基础

1.DNA的粗提取与鉴定

(I)实验原理

提取利用DNA和其他物质在物理和

思路化学性质方面的差异,提取DNA

实

验溶解度：DNA不溶于酒精.

原

理可与蛋白质等分离

DNA在不同浓度的

商T的|NaQ溶液中溶解度不同.

性质能溶于2mol/L的NaQ溶

液

DNA的鉴定：DNA+二苯

胺试剂沸水浴，蓝色

(2)实验步骤

一提醒

①加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA

分子不能形成丝状物。

②本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无

细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。

2.DNA片段的扩增及电泳鉴定

(1)实验基础

加热,双螺

IPCR'双链旋结构斛体一单链

|原理|一DNA‘缓慢冷却•分离的‘DNA

DNA疑乂重新结合

DNA分子具有可解离的基团•在一定的

pH下，这些基团可以带上正电荷或负电

荷。在电场的作用下.这些带电分子会向

着与它所带电荷柯区的电极移动.这个过

程就是电泳

PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来

画一鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与

凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等

有关

(2)PCR实验操作步骤

用微量移液器按照配方或PCR试剂盒的

移液

说明书且微量离心管中依次加入各级分

盖严离心管的盖子.将微量离心管放入离

心机里，离心约10§.使反应液集中在管

的底部

设置好PCR仪的循环程序，将装有反应

I反应I-

液的微量离心管放入PCR仪中进行反应

(3)DNA的电泳鉴定

琼脂糖凝胶制备：根据待分离DNA片段

的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液

(一般质量分数为0.8%〜1.2%),在沸

水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍

冷却后•加入适量的核酸染料混匀

凝胶板制备：将温热的琼月旨糖溶液迅速倒

入模具，并插入合适大小的梳子形成加样

孔•待凝胶溶液完全凝固后，小心拔出梳

子•将凝胶放入电泳槽内

电

泳

鉴点样：加电泳缓冲液.然后用微量移液器

定将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲

液(内含指示剂)的混合液注入加样孔

内.