DB22-T 243-2000 气相色谱-质谱检测霍乱弧菌的方法

DB22T2432000气相色谱质谱检测霍乱弧菌的方法1范围本标准规定了气相色谱质谱法检测霍乱弧菌的原理、试剂与材料、仪器设备、样品制备、分析步骤、结果判定及质量控制等技术要求。本标准适用于食品、饮用水、环境样品以及临床标本中霍乱弧菌的快速检测和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.4食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求3原理霍乱弧菌（Vibriocholerae）是引起霍乱病的病原菌，其细胞壁含有特定的脂肪酸成分。本方法基于霍乱弧菌细胞脂肪酸的特异性组成，通过样品前处理提取脂肪酸，经甲酯化衍生处理后，利用气相色谱质谱联用技术（GCMS）对脂肪酸甲酯进行分离和检测，通过与标准谱库比对，实现对霍乱弧菌的快速鉴定。气相色谱质谱联用技术结合了气相色谱的高分离效能和质谱的高灵敏度、高选择性，能够准确分析复杂样品中的微量组分。该方法通过分析霍乱弧菌特征脂肪酸的组成和相对含量，建立霍乱弧菌的特征谱图，为霍乱弧菌的检测提供可靠的技术手段。4试剂与材料4.1试剂4.1.1甲醇：色谱纯，用于样品提取和衍生化反应。4.1.2正己烷：色谱纯，用于脂肪酸甲酯的提取和溶解。4.1.3氢氧化钠：分析纯，配制成1mol/L溶液，用于皂化反应。4.1.4盐酸：分析纯，配制成6mol/L溶液，用于酸化处理。4.1.5三氟化硼甲醇溶液：质量分数为14%，用于脂肪酸甲酯化反应。4.1.6无水硫酸钠：分析纯，用于样品脱水处理。4.1.7氯化钠：分析纯，用于配制生理盐水。4.1.8蛋白胨：生化试剂，用于培养基配制。4.1.9酵母浸粉：生化试剂，用于培养基配制。4.1.10氯化钠：分析纯，用于培养基配制。4.1.11琼脂：生化试剂，用于固体培养基配制。4.2材料4.2.1霍乱弧菌标准菌株：O1群和O139群标准菌株，用于方法验证和质量控制。4.2.2脂肪酸甲酯标准品：包括C12:0、C14:0、C16:0、C16:1、C18:0、C18:1、C18:2等，用于定性和定量分析。4.2.3微孔滤膜：孔径0.22μm，用于样品过滤。4.2.4无菌注射器：1mL、5mL和10mL，用于样品转移。4.2.5无菌离心管：1.5mL、15mL和50mL，用于样品处理。4.2.6无菌移液管：100μL、200μL、1000μL，用于精确移液。4.2.7培养皿：直径90mm，用于菌株培养。4.2.8试管：18mm×180mm，用于液体培养基培养。4.2.9滤纸：中速定性滤纸，用于过滤处理。5仪器设备5.1主要仪器5.1.1气相色谱质谱联用仪：配备电子轰击离子源（EI源）和四极杆质量分析器，质量范围m/z50650。5.1.2气相色谱柱：DB5MS石英毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm）或等效色谱柱。5.1.3自动进样器：进样量1μL，进样口温度250℃。5.1.4恒温培养箱：温度范围2060℃，精度±0.5℃，用于菌株培养。5.1.5高速冷冻离心机：最高转速15000r/min，温度范围2040℃，用于样品分离。5.1.6旋涡混合器：转速03000r/min，用于样品混匀。5.1.7恒温水浴锅：温度范围室温100℃，精度±0.5℃，用于衍生化反应。5.1.8分析天平：感量0.1mg，用于试剂称量。5.1.9pH计：精度±0.01，用于溶液pH值测定。5.1.10超净工作台：用于无菌操作。5.2辅助设备5.2.1微量移液器：10100μL、1001000μL，用于精确移液。5.2.2涡旋振荡器：用于样品混匀。5.2.3氮吹仪：用于样品浓缩。5.2.4真空干燥箱：用于样品干燥