AaALDH1启动子基因GUS报告载体转化黄花蒿的研究

AaALDH1启动子基因GUS报告载体转化黄花蒿的研究STUDYONTRANSFORMATIONOFARTEMISIAANNUAWITHGUSREPORTVECTOROFAaALDH1PROMOTERGENE目录摘要1关键词11前言21.1青蒿素与疟疾21.2青蒿素的合成途径21.3青蒿素的其它作用41.4研究目的与意义52实验材料52.1材料52.2试剂52.3仪器与设备63实验方法63.1工程农杆菌的活化63.1.1活化农杆菌63.1.2菌落PCR验证其正确性63.1.3扩大培养工程菌73.2黄花蒿遗传转化73.2.1黄花蒿叶盘法的遗传转化73.2.2转基因黄花蒿愈伤及抗性植株的筛选73.3转基因黄花蒿愈伤及抗性植株的分子检测83.3.1提取转基因植株DNA83.3.2PCR检测93.4转基因抗性苗的GUS组织化学染色及观察93.4.1GUS染色液的配制93.4.2转基因黄花蒿叶片GUS组织化学染色及显微观察103.5转基因黄花蒿抗性植株生根培养103.6黄花蒿炼苗移栽104结果与分析114.1工程农杆菌菌落PCR检测114.2叶盘法转化黄花蒿筛选结果114.3黄花蒿抗性植株分子检测124.4抗性苗的GUS组织化学染色观察134.5黄花蒿抗性植株生根培养及移栽135讨论14参考文献15致谢17AaALDH1启动子基因GUS报告载体转化黄花蒿的研究摘要：为研究黄花蒿ALDH1基因在黄花蒿组织部位表达的情况，本研究将AaALDH1基因启动子驱动的GUS基因报告载体pCAMBIA1301-ALDH1Pro::GUS通过农杆菌介导的叶盘法转化黄花蒿，通过对转化植株的抗性筛选及PCR分子验证获得转基因植株，同时通过GUS组织化学染色，对该基因的特异性表达部位进行组织定位分析，其结果可为深入研究AaALDH1在青蒿素生物合成途径中的功能提供有价值的依据。关键词：黄花蒿；AaALDH1启动子；遗传转化；GUS染色StudyontransformationofartemisiaannuawithGUSreportvectorofAaALDH1promotergeneAbstract:InordertostudytheexpressionofArtemisiaannuaALDH1geneinthetissuesofArtemisiaannuaL.,theGUSgenereportervectorpCAMBIA1301-ALDH1Pro::GUSdrivenbytheAaALDH1genepromoterwastransformedintoA.annuabyleafdiscmethodmediatedbyAgrobacteriumandscreened.Thetransgenicpositiveplants,throughGUShistochemicalstainingtolocatetheirspecificexpressionsites,provideaneffectivebasisforin-depthstudyofthefunctionofAaALDH1intheartemisininbiosynthesispathway.Keywords:ArtemisiaannuaL.；AaALDH1promoter；Leafdiscmethod；GUSstaining1前言1.1青蒿素与疟疾黄花蒿(ArtemisiaannuaL.)为双子叶植物纲，属菊科蒿属，是一年生草本植物。黄花蒿是药用草本类植物，可作清火、降暑、抗疟、凉血用，还可作为外用药敷用，亦可用作香料、牲畜饲料等[22]。黄花蒿含有青蒿素、黄酮类化合物等，其中，青蒿素是从黄花蒿叶片中分离提取到的一种具有过氧桥结构的倍半萜内酯类化合物[10]，为抗疟的主要有效成分，是治疗疟疾的天然原料[19]。疟疾是一种全球性疾病，易传染、且传播速度快，尽管近年来疟疾得到了有效控制，全球依然有数千万人口面临感染疟疾的风险，特别是亚洲和非洲一些经济不发达的国家和地区。由于疟原虫抗药性现象的出现，使得传统的抗疟药物——氯喹的使用受到了限制[5]，对治疗疟疾收效甚微，而青蒿素对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾的治疗具有速效且低毒的特点[11]，对治疗疟疾有显著作用。与之前的抗疟药物都不同，青蒿素的抗疟机理的主要作用为对疟原虫的表膜线粒体等的功能产生干扰，开始先作用于疟原虫的食物泡膜、线粒体、表膜[24]，然后再作用于内质网和核膜，会对核内的染色质也有一些影响，最后导致整个疟原虫体结构的全部瓦解，而不是通过干扰疟原虫的叶酸代谢[15]。青蒿素是治疗疟疾耐药性发挥效果最好的药物，而以青蒿素类药物为主的联合疗法，也是当下治疗疟疾最有效且最重要的手段[1]。近年来由于研究的深入，青蒿素的其它作用也被越来越多的研究者发现并应用研究，比如抗肿瘤、治疗抗胚胎毒性、肺动脉高压、抗糖尿病、抗真菌感染、免疫调节等[9]。基于青蒿素的联合疗法被世界卫生组织（WHO）推荐为对抗疟疾的首选方法，这更加让人们对于青蒿素的需求量变得非常巨大[13]。可是传统的提取分离法收益太低，而黄花蒿中又只含有极其少量的青蒿素，想要大量生产形成流水线供群众使用，还有技术难题。1.2青蒿素的合成途径青蒿素的生物合成途径基本上已经阐明，该途径中所涉及到的结构基因大部分已经被克隆鉴定，为采用代谢工程的方法、培养高产青蒿素的青蒿供予了基因资源[6]。青蒿素只存在于青蒿的花叶中，而茎中不含有，是一种含量极低的萜类化合物，其生物合成途径异常复杂[20]。萜类化合物源于异戊烯基焦磷酸(isopentenyldiphosphate,IPP)和二甲基丙烯基焦磷酸(dimethylallyldiphosphate,DMAPP)，其中包含甲羟戊酸途径（MVA途径,位于胞质）[21]，以及磷酸甲基赤藓糖途径（MEP途径,位于质体）。然而法尼基焦磷酸(farnesyliphosphate,FPP)是合成多种次生代谢产物的底物，且是多种萜类化合物生物合成的关键中间体，在青蒿素合成中起着重要作用[26]。青蒿素的前体法尼基焦磷酸C15)是由两个从胞质甲羟戊酸(MVA)途径衍生的C-5异戊二烯单元和一个从非甲羟戊酸(MEP或DXP)途径衍生的异戊二烯单元合成[8]。在青蒿素的合成途径中,第一步的特异性反应就是由FPP生成紫穗槐二烯(amorpha-4,11-diene)[27]。紫穗槐二烯合成酶(ADS)是青蒿素生物合成途径中的第一个关键酶，ADS将FPP催化生成紫穗槐二烯[12]，继而，紫穗槐二烯被细胞色素P450单氧化酶(cytochromeP450monooxygenase,CYP71AV1)催化,并形成青蒿醇(artemisinicalcohol,AAOH)、青蒿醛(artemisinicaldehyde,AAA)以及青蒿酸(artemisinicacid,AA)[13]。其中，青蒿醇可以被催化成为二氢青蒿醇(dihydroartemisinicalcohol,DHAAOH)，而二氢青蒿醇有可以被酶CYP71AV1和乙醛脱氢酶1(aldehydedehydrogenase，ALDH1)共同催化形成为二氢青蒿醛(dihydroartemisinicaldehyde,DHAAA),然后就经过二氢青蒿酸(dihydroartemisinicacid,DHAA)形成青蒿素[23]。青蒿醛途径是AAA在青蒿醛双键还原酶(artemisinicaldehydedelta-11(13)reductase,DBR2)的催化作用下生成二氢青蒿醛(DHAAA)[14]，DHAAA一方面可以经酶ALDH1催化形成DHAA；另外一方面也可以经过二氢青蒿醛还原酶(dihydroartemisinicaldehydereductase,RED1)还原形成DHAAOH[23]。青蒿酸可生成终产物青蒿素,也可以经过青蒿烯形成终产物青蒿素B[19]。黄花蒿植物中青蒿酸不能直接作为青蒿素合成的直接前体物质[16,17]，而二氢青蒿酸不需要酶的作用，在光下就能够自发的转化成青蒿素[18]，由此可知，青蒿醛是青蒿素合成途径中的重要分支点化合物，且酶ALDH1在其中起关键作用。乙醛脱氢酶1(ALDH1)是ALDH家族的成员,乙醛脱氢酶在人体中负责乙醛转化，在肝中负责将乙醇转化为乙醛，再进一步转化为乙酸[25]，在此过程中，ALDH1与ALDH2起重要作用。ALDH1是视黄酸合成过程中的主要酶，其主要存在部位为肿瘤干细胞表面，是一种细胞内醛氧化解毒酶[26]。ALDH1活性酶通常作为恶性肿瘤的肿瘤干细胞标志物，广泛应用于正常干细胞与肿瘤干细胞的鉴定与分离，在肿瘤干细胞的生长分化过程中有着重要影响[16]，是目前市场上应用前景较为广阔的干细胞通用标记物。而ALDH1在黄花蒿和拟南芥等作物中也有重要作用，在拟南芥腺毛部位中特异表达，在黄花蒿中参与青蒿素的合成，是青蒿素合成途径中的关键基因[11]，本研究就是为了探寻ALDH1在黄花蒿中的表达情况而做。ADS，CYP71AV1，DBR2等基因在许多方面已经被研究的很清楚，例如转基因方面，转录调控方面，和在不同的植物激素处理下基因的表达模式，以及启动子分析[1]。与上面的一些基因相比，对ALDH1基因的了解还较少，在分子水平研究ALDH1的组织器官表达部位及调控模式是很有必要的。1.3青蒿素的其它作用虽然青蒿素早就已经可以半化学合成，研究者们也正在通过植物组织培养法生产青蒿素，或者通过基因工程技术将青蒿素合成途径转入烟草、大肠杆菌或酵母中，以期望能通过发酵的方法来生产青蒿素，但转基因植株中目前只得到紫穗槐二烯、青蒿醇、二氢青蒿醇等青蒿素前体物质[2-7]，并不能直接生产出青蒿素。因而培育高产青蒿则成为了该行业共同追求的目标，而植物代谢工程技术是遗传改良青蒿素生物合成途径、培育高产青蒿的有效方法之一[5]。青蒿素也有抗真菌的作用，这使得青蒿素表现出一定的抗菌活性[4]，对痢疾杆菌、结核杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌等也有一定的抑制作用[3]。在临床上，青蒿素还可以和冬虫夏草合用以达到保护肾脏的目的。青蒿素还有抗纤维化的作用，可以显著减少肺组织纤维化程度，且对于瘢痕的治疗和预防有比较良好的实用前景[2]。另外，青蒿素也能够破坏卡氏肺孢子虫的膜系结构，以抵抗卡氏肺孢子虫肺炎[7]。青蒿素类的药物对胚胎也有比较高的选择性毒性，少量剂量就可让胚胎死亡从而导致流产[9]，有可能会被用来开发人工流产的药物。在青蒿素的基础上，市场上开发出了许多种青蒿素的衍生物，例如：双氢青蒿素、青蒿披酯、蒿甲醚、蒿乙醚等[8-9]。这些青蒿素类药物几乎都具有抗疟活性，对一些特定种类的癌细胞（比如乳腺癌细胞、肝癌细胞）有抑制作用、免疫作用或者激活作用，还能治疗血吸虫病、弓形虫病等[10]。青蒿素以及它的衍生物都是含过氧化基团的倍半萜内酯化合物，青蒿素结构里的C-10位的羧基可以还原成羟基，进而就可以形成双氢青蒿素[9]，而双氢青蒿素可进一步烷氧基化即可获得蒿甲醚，蒿甲醚再实行酯化就可以获得青蒿琥酯[20]。青蒿琥酯对白血病、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、大肠癌和肾癌细胞等都有抑制性作用[25-27]；而双氢青蒿素对骨肉瘤、胰腺癌、肺癌细胞、白血病等的抗肿瘤作用比较好。另外，在青蒿素合成代谢途径上还存在着某些中间次生代谢产物，如青蒿素、紫穗槐二烯、青蒿酸、杜松烯等[26]，这些中间次生代谢产物的合成与青蒿素的生物合成有着直接或间接的关系[10]。青蒿素的前景非常广阔，它的生物合成机制以及各类衍生物的应用，都很有研究意义。1.4研究目的与意义为了提高青蒿素产量，可有效利用转基因技术，将与青蒿素代谢过程有关的基因过量表达，从而达到大量生产青蒿素的目的。ALDH1基因的表达产物是青蒿素合成途径上的关键酶，它的过量表达可以有效提高青蒿素产量，但关于黄花蒿ALDH1基因的研究甚少，关于ALDH1基因启动子的研究更是少见。为研究黄花蒿ALDH1基因在黄花蒿组织部位中的表达情况，本研究利用实验室已构建的AaALDH1启动子驱动的GUS基因报告载体pCAMBIA1301-ALDH1Pro::GUS，通过对转化植株的抗性筛选及PCR分子验证获得转基因植株，同时通过GUS组织化学染色，对该基因的特异性表达部位进行组织定位分析，其结果可为深入研究AaALDH1在青蒿素生物合成途径中的功能提供有价值的依据。2实验材料2.1材料黄花蒿（品种：新南方）；根癌农杆菌LAB4404-pCAMBIA1301-AaALDH1Pro::GUS（均来自湖南农业大学细胞生物学研究室）。2.2试剂与培养基试剂：羧苄青霉素(Carb)、潮霉素B(Hyg)等抗生素（购自罗氏公司）；NaH2PO4·2H2O、NaOH、EDTA·Na22H2O、Gluc、DMSO、EDTA、甲醇、铁氰化钾、亚铁氰化钾等其他试剂（均为国产分析纯购自国药集团）；CTAB、50mmol/L磷酸缓冲液、50mmol/L铁氰化钾溶液、50mmol/L亚铁氰化钾溶液、0.5mmol/LEDTA溶液等自制试剂；检测引物（交由生工生物工程公司合成）。培养基：MS1培养基，MS2培养基，1/2MS液体培养基，YEB固体培养基，YEB液体培养基，Hyg筛选培养基，生根培养基。2.3仪器与设备PCR仪、梯度PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、微波炉、超净工作台、恒温震荡培养箱、真空干燥离心机、超低温冰箱、恒温仪、研究显微镜、水浴锅电子天平、低温离心机。3实验方法3.1工程农杆菌的活化3.1.1活化农杆菌做实验前准备，配制YEB固体培养基和YEB液体培养基，其中含抗生素Kan50mg/L，Rif50mg/L，Str50mg/L；待YEB培养基准备好后，将准备好的农杆菌从冰箱取出，并放置于冰上融化，保存活性；将工程农杆菌于YEB固体培养基上培养，进行菌种活化，并置于28℃培养箱，倒置黑暗培养；3.1.2菌落PCR验证其正确性从培养基上用无菌枪头挑取单菌落，将其溶于20μL的去离子水中，并以该菌液为模板，实行菌落PCR，PCR反应体系：LAB4404-pCAMBIA1301-AaALDH1Pro::GUS1μLUP1(10Mm)1μLDN1(10mM)1μL10×buffer2.5μLdNTPs(2.5mM)2μLTaq酶(1U)0.5μL去离子水17μLTotalVolume25μL其中上游引物(UP1)为：ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAAC；下游引物(DN1)为：GTCCAGTTGCAACCACCTGTTGATC。菌落PCR反应条件：95℃预变性5min95℃变性30s56℃退火1min72℃延伸1min30s72℃终末延伸7min30Cycles将菌落PCR的产物实行1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果为阳性，则说明该菌的正确性得到了验证。30Cycles3.1.3扩大培养工程菌使用无菌枪头，将生长良好的单菌落接种至5mL的含有相同抗生素浓度（Kan50mg/L，Rif50mg/L，Str50mg/L）的YEB液体培养基中，在培养箱中恒温28℃，180r/min培养8-12h；用移液枪取100μL的工程菌液加入到50mL的含有相应抗生素的YEB液体培养基中，扩大培养至OD600nm为1.0左右，该农杆菌液可以马上用于后续实验中。3.2黄花蒿遗传转化3.2.1黄花蒿叶盘法的遗传转化取生长良好的黄花蒿幼叶，将叶片切成四周均有伤口的叶盘，置于MS1(6-BA1.0mg/L，NAA0.1mg/L)培养基上，防止叶盘脱水；将叶盘接种至MS1培养基，密封放置于暗环境下预培养1d；将之前准备好的菌液3000r/min，2min的离心，然后用1/2MS液体培养基，将农杆菌体进行重悬；用移液器吸取菌悬液滴加至预培养1d的黄花蒿外植体切口处，用封口膜封好培养皿，暗培养条件下共培养3d。3.2.2转基因黄花蒿愈伤及抗性植株的筛选共培养结束后，将叶盘取出，将其放在准备好的已经灭菌完毕的吸水纸上，用来吸干叶盘上多余的菌液；将黄花蒿外植体用1/2MS液体培养基进行清洗，其间不时摇动，让叶盘充分到接触溶液，以便清洗干净；用镊子小心地夹起叶盘，暂时放置于吸水纸上，以吸干多余的水分；将清洗后的黄花蒿外植体分别均匀地平铺在含200mg/LCarb、30mg/LHyg的筛选培养基上培养，后将植物组织置于培养室，25±2℃培养，光照周期为16h/8h（light/dark）；约一个月后，留下长势良好的植物组织，切下带芽的叶缘，接种于MS2(Carb500mg/L，Hyg50mg/L)培养基中继续培养。3.3转基因黄花蒿愈伤及抗性植株的分子检测3.3.1提取转基因植株DNA选取长势良好的黄花蒿植物叶片，剪碎后放于研钵中，后加入适量的液氮充分进行研磨；再将已经研磨成了粉末的材料转入1.5mL的离心管中，待液氮充分挥发后，再加入700μL的CTAB混合均匀；加入25μL的β-硫基乙醇，65℃水浴30-60min，每隔10min轻轻混匀；再加入等体积的苯酚，12,000rpm离心7min，取走上清液移入另一个1.5mL的离心管中；加入与上一步上清液等体积、且比例为24:1的氯仿：异戊醇，轻摇混匀，12,000rpm离心8min，取上清液移入另一1.5mL离心管中；再加入等体积的比例为24:1的氯仿：异戊醇，轻轻摇动混匀，12,000rpm离心8min，取上清液移入另一个1.5mL离心管中；加入约上一步上清液的2/3体积的异丙醇，轻轻晃动混匀，置于-20℃冰箱中沉淀30min-2h；沉淀完后从冰箱中取出离心管，4℃，12,000rpm离心10分钟，倒掉上清，干燥沉淀，注意别把沉淀倒出；与离心管中滴加500μL70%的乙醇，洗涤沉淀，然后12,000rpm离心2min，除去上清；再次滴加500μL70%的乙醇洗涤沉淀，12,000rpm离心2min，去上清；将离心管放入在通风橱中，将管中的乙醇彻底吹干，然后加入40μL的去离子水溶解；沉淀溶解后加入1μLRNaseA，再将离心管放入37℃的水中水浴30min；最后取5μL样品进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，剩余的材料于-20℃冰箱冷冻保存。3.3.2PCR检测采用CTAB法提取转基因黄花蒿植株DNA后，利用GUS基因的特异引物，进行PCR检测。GUS基因检测长度为651bp。检测PCR体系：DNA1.0μL上游引物1.0μL下游引物1.0μL2×TaqMasterMix12.5μLddH2O9.5μL其中上游引物为：ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAAC；下游引物为：GTCCAGTTGCAACCACCTGTTGATC。GUS基因PCR反应程序：95℃预变性5min94℃变性1min58℃退火30Cycles1min30Cycles72℃延伸45s72℃终末延伸7min将GUS基因PCR的产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果为阳性的，就是我们所需要的阳性植株。3.4转基因抗性苗的GUS组织化学染色及观察3.4.1GUS染色液的配制50mmol/L磷酸缓冲液的配制：A液：称取3.12gNaH2PO4·2H2O，加蒸馏水定容至100mL，浓度为0.2M；B液：称7.17gNa2HPO4·12H2O，用蒸馏水溶解定容至100mL，浓度为0.2M；取39mLA液与61mLB液混合，加蒸馏水混匀定容至400mL，再用NaOH调节pH值至7.0；50mmol/L铁氰化钾溶液配制：称取3.295g铁氰化钾药品粉末，用蒸馏水溶解后定容至200mL；50mmol/L亚铁氰化钾溶液配制：称4.224g药品粉末，加蒸馏水定容至200mL；0.5mmol/LEDTA溶液的配制：称取37.2g的EDTA·Na22H2O，用蒸馏水将其定容至200mL，后用NaOH调节pH值至8.0；取Gluc10mg溶解于200μL的DMSO中，然后吸取上述配制的磷酸缓冲液12mL，再加入150μL的铁氰化钾和亚铁氰化钾溶液，以及300μL的EDTA溶液，将溶解完全的Gluc溶液加入其中，最后加入3mL甲醇充分混匀，于4℃避光保存。3.4.2转基因黄花蒿叶片GUS组织化学染色及显微观察将转GUS报告基因的黄花蒿抗性植株叶片及非转基因对照植株叶片，分别放入添加GUS染色液的培养皿中，保证材料浸没于染色液中，在37℃的培养箱中避光处理16h；将染色处理完的材料转入70%或95%乙醇中脱色2-3次，直至阴性对照材料呈白色为止；将转基因材料置于研究显微镜下观察染色结果，并记录分析染色情况。3.5转基因黄花蒿抗性植株生根培养待获得的分化苗培养长至3-5cm左右时，将长势良好的幼苗接种于生根培养基诱导生根，生根培养基为MS+0.1mg/LNAA+30mg/LHyg；并对每一株幼苗进行编号，室温25℃左右，16h/8h进行光、暗交替培养，且光照强度为1500-2000LX。3.6黄花蒿炼苗移栽出瓶前两周，将培养室中的黄花蒿植株培养瓶置于自然条件下的温度和光照强度中进行炼苗，以增强幼苗对环境的适应能力，出瓶前一周逐步将培养瓶盖打开，即首先松盖1-2d，然后部分开盖1-2d，最后完全揭盖，让瓶苗逐步适应外界的光照和温度，7d后将其移栽至实验室的营养土中培养，5d左右黄花蒿植株生长恢复正常。4结果与分析4.1工程农杆菌菌落PCR检测将实验室已构建保存的含Ti质粒(pCA1301-AaALDH1Pro::GUS)的根癌农杆菌划线接种于YEB固体培养基上培养活化，待长出抗性菌落，利用菌落PCR验证该工程农杆菌的正确性。菌落检测的是GUS的一段序列，检测长度为651bp，菌落PCR结果显示如下：图1.pCAMBIA1301-AaALDH1Pro::GUS菌落PCR电泳检测Fig.1ThePCRElectrophoreticDetectionofpCAMBIA1301-AaALDH1Pro::GUSBacterialColonyM：DNAMaker；1-3：重组质粒转化农杆菌LBA4404的菌落的PCR电泳；4：阴性对照；5：阳性对照上图中M为2KbDNA分子量标准，1-3号孔为农杆菌菌落PCR扩增凝胶电泳所得，4号孔为阴性对照样品，5号孔为阳性对照样品，其中1-3号样品与阳性对照大小一致，在同样的目的带位置有明亮条带。由此可知，该农杆菌菌落PCR检测为阳性，可用于后续的黄花蒿遗传转化实验。4.2叶盘法转化黄花蒿筛选结果黄花蒿叶盘与工程农杆菌共培养3d后，用1/2MS液体培养基进行清洗材料表面农杆菌液，后转入含200mg/LCarb、30mg/LHyg的筛选培养基中培养。一个月左右，转化成功的外植体在筛选培养基上生长较好，且叶盘伤口处有嫩绿色丛芽长出；而转化未成功的，由于耐受不住Hyg培养基的选择压力，绝大部分已逐渐枯竭褐化死亡。切下经筛选且长势良好的带芽叶盘，转入MS2培养基中继续培育生长。BA图2.转基因黄花蒿的诱导筛选BAFig.2InductingandscreeningoftransgenicArtemisiaannuaA，B：黄花蒿转基因植株的筛选（Bar=1cm）上图中有一小半愈伤长出了小丛芽，其它的则已褐化枯萎，转化成功率尚可。切下成功转化的丛芽，移入MS2培养基中继续培养成小幼苗。4.3黄花蒿抗性植株分子检测随机提取上述黄花蒿转化抗性植株的基因组DNA，利用GUS基因特异性检测引物，进行转基因植株的PCR分子检测。图3.转基因黄花蒿植株PCR检测Fig.3PCRdetectionoftransgenicArtemisiaannuaL.lantsM：DNAMaker；1-9：转AaALDH1Pro::GUS黄花蒿植株；10：空白对照；11：阴性对照；12：阳性对照结果如图4所示，1-9孔为随机检测的转基因植株单株分子检测结果，与预期GUS基因检测长度为651bp大小相符。图中第10、11孔分别为ddH2O空白和非转基因植株阴性对照，第12孔为质粒阳性对照。由图可见，转基因黄花蒿抗性植株与质粒阳性对照大小一致，说明成功获得转基因植株。4.4抗性苗的GUS组织化学染色观察将转AaALDH1Pro::GUS黄花蒿植株的叶片进行GUS组织化学染色，在叶片的腺毛部位，可见腺毛细胞均被染成蓝色，成功检测到GUS报告基因在黄花蒿腺毛细胞的表达活性，说明AaALDH1启动子能驱动GUS报告基因在黄花蒿腺毛细胞中特异性表达，同时预测和间接说明AaALDH1基因的表达部位集中在叶片的腺毛细胞。图4.黄转基因花蒿叶片GUS组织化学染色Fig.4GUShistochemicalstainingoftransgenicArtemisiaannuaL.leavesA、B：野生型黄花蒿叶片；C、D：转AaALDH1pro::GUS黄花蒿叶片（A、CBar=5mm；B、DBar=2mm）4.5黄花蒿抗性植株生根培养及移栽当抗性苗培育长到3-5cm左右时，将生长优良的幼苗转接于生根培养基(MS+0.1mg/LNAA+30mg/LHyg)上进行生根诱导；将生根后的植株转入室温下培养一周炼苗，并逐渐打开瓶盖，最后移栽至营养土中。图5.黄花蒿生根培养及移栽Fig.5RootingandtransplantingofArtemisiaannuaL.A-C：黄花蒿幼苗继代、生根、炼苗移栽的过程（Bar=1cm）将长势良好的转基因黄花蒿幼苗移入生根培养基中，待根长得健壮稳固时，再进行炼苗移栽。将炼苗一周的幼苗移入实验室的营养土中继续培养，炼苗成功的黄花蒿能茁壮生长。5讨论本研究围绕探讨黄花蒿ALDH1基因的表达部位而展开。将已构建好的AaALDH1启动子驱动的GUS基因报告载体pCAMBIA1301-ALDH1Pro::GUS通过农杆菌介导的叶盘法转化黄花蒿，筛选出抗性植株，最终观察ALDH1在黄花蒿叶片的腺毛部位表达活跃，黄花蒿腺毛部位也是青蒿素合成的关键部位，由此可知ALDH1基因在青蒿素合成过程中也有着重要作用，为青蒿素的研究开拓了一个方向，为更好研究青蒿素合成及应用提供了新的思路。要想提高青蒿素的生产效率，研究青蒿素的生物合成途径是必不可少的，ALDH1在其中更是有着关键作用，在青蒿素前体转化成青蒿素的过程中必不可少，若是能在该基因的研究上更进一步，对青蒿素的研究也能扩展更大的领域。农杆菌介导的叶盘法转化植物已经成为比较常用的遗传转化方法，应用的范围也越来越广。农杆菌主要分为两种，分别是根癌农杆菌和发根农杆菌。根癌农杆菌在自然条件可感染多种植物的伤口部位，并且可诱导生成冠瘿瘤；而发根农杆菌则可诱导植物生成发状根，即有数量多且分支杂的根系。本研究使用的是根癌农杆菌，通过浸染黄花蒿叶片的伤口，来达到转化的目的。本研究中最关键的一步就是遗传转化，在做转化之前一定要确认所用材料是否可用，比如实验室已构建的GUS基因报告载体是否已成功转化农杆菌，这需要凝胶电泳来验证其正确性。之后转化黄花蒿，筛选抗性植株，注意操作手法即可。培育成抗性幼苗后还需进一步电泳检测验证，确保得到的植株是已成功转化的转基因抗性植株，然后生根培养、炼苗移栽。观察GUS的表达情况只需取生长良好的叶片按步骤染色观察即可，同时要注意取非转基因叶片进行对照。传统的青蒿素提取方法效率低且质量不高，运用现代生物科技手段大量生产青蒿素才是大势所趋，且由于青蒿素的应用广泛，市场对其需求大、要求高，不应用生物技术手段无法供应这方面缺口较大的市场，这对所有与之相关的领域来说都是不利的。而运用生物技术，关键就是应该先把青蒿素合成的原理搞清楚，对各个基因的作用以及作用方式有个清晰的认识，实验中也要有对变量的控制，才能更有效率地进行后面的研究，实验才会顺利进行。这样，也是为提高青蒿素产量、运用于其它相关领域打下了理论基础。参考文献[1]王焕燕.黄花蒿ALDH1启动子的克隆及其功能分析[D].西南大学,2016.[2]曾利霞.超表达cyp71av1和cpr基因对黄花蒿青蒿素生物合成的影响[D].西南大学,2012.[3]向礼恩,严铮辉,王贵君,刘万宏,唐克轩,廖志华.青蒿素生物合成途径基因组织表达分析与青蒿素积累研究[J].中国中药杂志,2012,37(09):1169-1173.[4]王涛,沈乾,陆续,江伟民,唐克轩.CYP71AV1和CPR基因在转基因青蒿后代中的遗传分析[J].上海交通大学学报(农业科学版),2012,30(04):8-14+30.[5]景福远,张凌,李美芽,唐克轩.过量表达cyp71av1和cpr基因提高青蒿中青蒿素的含量[J].中国农业科技导报,2008(03):64-70.[6]王亚雄,龙世平,曾利霞,向礼恩,林智,陈敏,廖志华.过表达HDR和ADS基因对青蒿素生物合成的影响[J].药学学报,2014,49(09):1346-1352.[7]刘万宏.青蒿DXS基因家族功能分化及低温促进青蒿素合成的分子机制研究[D].重庆大学,2016.[8]肖玲,吕宗友,谭何新,周正,张磊.青蒿素代谢调控研究进展[J].中草药,2017,48(05):1005-1014.[9]陈韵斐,张芳源,唐克轩.过量表达DXR基因提高青蒿中青蒿素的含量[J].上海交通大学学报(农业科学版),2012,30(5):19-23.[10]尹纪业,王和枚,丁日高.青蒿素及其衍生物毒理学研究进展[J].中国药理学与毒理学杂志,2014,28(02):309-314.[11]方欣,卢山,于宗霞,陈晓亚.青蒿素的生物合成研究[J].科技导报,2015,33(20):31-35.[12]谭何新,肖玲,周正,张磊,陈万生.青蒿素生物合成分子机制及调控研究进展[J].中国中药杂志,2017,42(01):10-19.[13]王红,叶和春,刘本叶,李振秋,李国凤.青蒿素生物合成分子调控研究进展[J].生物工程学报,2003(06):646-650.[14]LingXiao,HexinTan,LeiZhang.Artemisiaannuaglandularsecretorytrichomes:thebiofactoryofantimalarialagentartemisinin[J].ScienceBulletin,2016,61(01):26-36.[15]PaskornMuangphrom,HikaruSeki,EryOdetteFukushima,ToshiyaMuranaka.Artemisinin-basedantimalarialresearch:applicationofbiotechnologytotheproductionofartemisinin,itsmodeofaction,andthemechanismofresistanceofPlasmodiumparasites[J].JournalofNaturalMedicines,2016,70(3).[16]ShenQian,ZhangLida,LiaoZhihua,WangShengyue,YanTingxiang,ShiPu,LiuMeng,FuXueqing,PanQifang,WangYuliang,LvZongyou,LuXu,ZhangFangyuan,JiangWeimin,MaYanan,ChenMinghui,HaoXiaolong,LiLing,TangYueli,LvGang,ZhouYan,SunXiaofen,BrodeliusPeterE,RoseJocelynKC,TangKexuan.TheGenomeofArtemisiaannuaProvidesInsightintotheEvolutionofAsteraceaeFamilyandArtemisininBiosynthesis.[J].Molecularplant,2018.[17]MillerLH,SuX.Artemisinin:discoveryfromtheChineseherbalgarden[J].Cell2011，146:855-8.[18]BouwmeesterHJ,WallaartTE,JanssenMH,vanLooB,JansenBJ,PosthumusMA,etal.Amorpha-4,11-dienesynthasecatalysesthefirstprobablestepinartemisininbiosynthesis[J].Phytochemistry，1999，52:843-54.[19]TeohKH,PolichukDR，ReedDW，NowakG，CovelloPS.ArtemisiaannuaL.(Asteraceae)trichome-specificcDNAsrevealCYP71AV1,acytochromeP450withakeyroleinthebiosynthesisoftheantimalarialsesquiterpenelactoneartemisinin[J].FebsLetters，2006，580:1411-6.[20]ZhangY,TeohKH,ReedDW,MaesL,GoossensA,OlsonDJ,etal.ThemolecularcloningofartemisinicaldehydeΔ11(13)reductaseanditsroleinglandulartrichome-dependentbiosynthesisofartemisinininArtemisiaannua[J].JournalofBiologicalChemistry，2008，283:21501-8.[21]TeohKH,PolichukDR,ReedDW,CovelloPS.MolecularcloningofanaldehydedehydrogenaseimplicatedinartemisininbiosynthesisinArtemisiaannuaThispaperisoneofaselectionofpaperspublishedinaSpecialIssuefromtheNationalResearchCouncilofCanada-PlantBiotechnologyInstitute[J].Botany，2009，87:635-42.[22]KimN,KimS.Biosynthesisofartemisininfrom11,12-dihydroarteannuicacid[J].JournaloftheKoreanAgriculturalChemicalSociety，1992.[23]BrownGD,SyL-K.InvivotransformationsofartemisinicacidinArtemisiaannuaplants[J].Tetrahedron，2007，63:9548-66.[24]BrownGD.