2025年动物生物化学实验考试试题及答案

2025年动物生物化学实验考试试题及答案一、单项选择题（每题2分，共20分）1.双缩脲试剂的主要显色成分是（）A.酒石酸钾钠B.硫酸铜C.氢氧化钠D.碘化钾答案：B2.考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量时，反应体系的最大吸收波长为（）A.280nmB.540nmC.595nmD.620nm答案：C3.以下哪种试剂常用于核酸提取中抑制DNase活性？（）A.β巯基乙醇B.EDTAC.氯仿D.异丙醇答案：B4.SDSPAGE实验中，SDS的主要作用是（）A.破坏蛋白质二级结构B.赋予蛋白质均一负电荷C.提高凝胶交联度D.加速电泳迁移答案：B5.DNS法测定还原糖时，显色反应的关键物质是（）A.3,5二硝基水杨酸B.葡萄糖C.酒石酸钾钠D.氢氧化钠答案：A6.动物肝脏中提取谷丙转氨酶时，常用的组织匀浆介质是（）A.蒸馏水B.0.9%NaCl溶液C.0.02mol/LTrisHCl缓冲液（pH7.4）D.无水乙醇答案：C7.琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，溴酚蓝指示剂的迁移速率约相当于（）A.100bpDNA片段B.500bpDNA片段C.1000bpDNA片段D.2000bpDNA片段答案：B8.测定酶活力时，若底物浓度远大于Km值，此时反应速率与（）A.底物浓度成正比B.酶浓度成正比C.温度成反比D.pH无关答案：B9.以下哪种方法不能用于蛋白质纯度鉴定？（）A.SDSPAGEB.紫外吸收法C.高效液相色谱（HPLC）D.质谱分析答案：B10.实时荧光定量PCR（qPCR）中，SYBRGreenI染料的作用是（）A.特异性结合目标DNAB.嵌入双链DNA发出荧光C.标记引物D.抑制非特异性扩增答案：B二、多项选择题（每题3分，共15分，少选得1分，错选不得分）1.影响Folin酚法（Lowry法）测定蛋白质含量准确性的因素包括（）A.样品中含有还原剂（如巯基乙醇）B.缓冲液中含有TrisC.样品中含有酚类物质D.显色时间不一致答案：ABCD2.动物组织总RNA提取时，使用Trizol试剂的主要成分包括（）A.异硫氰酸胍B.苯酚C.氯仿D.乙醇答案：AB3.以下关于酶活性测定的描述正确的是（）A.需设置不含酶的空白对照B.反应时间应控制在初速度范围内C.pH需严格控制在酶的最适范围D.温度波动应小于±0.5℃答案：ABCD4.蛋白质透析实验中，选择透析袋的依据包括（）A.蛋白质分子量B.缓冲液离子强度C.目标分子的电荷性质D.透析袋的截留分子量（MWCO）答案：AD5.以下哪些实验需要使用标准曲线？（）A.考马斯亮蓝法测蛋白质浓度B.DNS法测还原糖含量C.紫外吸收法测DNA浓度D.双缩脲法测血清总蛋白答案：ABD三、填空题（每空1分，共20分）1.蛋白质变性后，其生物活性（），但（）结构未被破坏。答案：丧失；一级2.核酸的紫外吸收峰在（）nm，蛋白质的紫外吸收峰主要由（）、（）和（）三种氨基酸残基引起。答案：260；色氨酸；酪氨酸；苯丙氨酸3.测定血清谷丙转氨酶（ALT）活性时，常用（）法，其显色产物为（），在（）nm处有最大吸收。答案：赖氏；丙酮酸2,4二硝基苯腙；5054.亲和层析分离酶时，常用的配基包括（）（如辅酶）或（）（如抗体）。答案：底物类似物；生物大分子5.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中，分离胶的pH为（），浓缩胶的pH为（）。答案：8.8；6.86.提取动物基因组DNA时，蛋白酶K的作用是（），酚氯仿抽提的目的是（）。答案：降解蛋白质；去除蛋白质和脂类杂质7.测定酶的Km值时，通常采用（）作图法，其横轴为（），纵轴为（）。答案：LineweaverBurk；1/[S]；1/v四、简答题（共30分）1.（封闭型，6分）简述SDSPAGE实验中样品处理的关键步骤及原理。答案：关键步骤：①样品与上样缓冲液（含SDS、β巯基乙醇、溴酚蓝、甘油）按比例混合；②沸水浴加热35分钟。原理：SDS（十二烷基硫酸钠）与蛋白质结合，破坏氢键和疏水键，使蛋白质变性为线性结构；β巯基乙醇还原二硫键，确保蛋白质完全展开；加热加速SDS与蛋白质的结合，使每个蛋白质分子结合的SDS量与分子量成正比，从而赋予均一负电荷密度，消除电荷差异对电泳的影响；甘油增加样品密度，便于加样；溴酚蓝作为前沿指示剂。2.（开放型，7分）某同学用DNS法测定玉米匀浆中还原糖含量时，发现空白管（只含DNS试剂和蒸馏水）的OD540值显著高于正常水平（正常≤0.1），可能的原因有哪些？请至少列出3点并解释。答案：可能原因：①DNS试剂配制错误：如未使用分析纯试剂，或酒石酸钾钠未完全溶解，导致试剂中存在还原性杂质（如醛类），与DNS反应显色；②玻璃器皿污染：试管或比色皿未彻底清洗，残留还原糖（如葡萄糖、麦芽糖），与DNS反应；③显色条件控制不当：空白管与样品管未在同一温度（如沸水浴）下反应，或加热时间过长，导致DNS自身分解产生有色物质；④蒸馏水不纯：实验用水含有微量还原糖或还原性物质（如实验室环境中的灰尘污染）。3.（封闭型，6分）简述PCR扩增目的基因的基本步骤及各步骤的温度范围。答案：基本步骤：①变性（Denaturation）：9498℃，持续30秒2分钟，使双链DNA解旋为单链；②退火（Annealing）：5065℃（具体温度取决于引物Tm值），持续30秒1分钟，引物与单链DNA模板互补结合；③延伸（Extension）：72℃（TaqDNA聚合酶最适温度），持续时间根据扩增片段长度（通常1kb/分钟），Taq酶以dNTP为原料，沿引物3’端延伸合成新链。以上三步为一个循环，通常进行2535次循环。4.（开放型，7分）某实验室提取的动物肝脏总RNA经琼脂糖凝胶电泳后，条带模糊且28SrRNA亮度低于18SrRNA（正常应为2:1），请分析可能的实验操作问题。答案：可能的操作问题：①RNA酶污染：操作人员未戴手套、使用未DEPC处理的枪头/试管，导致RNA被降解；②组织匀浆不充分：肝脏细胞未完全破裂，RNA释放不完全，同时细胞内RNA酶未被及时抑制；③氯仿抽提不彻底：水相与有机相分离时混入蛋白质层，导致RNA被残留的RNA酶降解；④异丙醇沉淀时间不足：RNA未完全析出，导致低分子量RNA丢失；⑤电泳条件不当：凝胶中甲醛浓度不足（未有效抑制RNA酶），或电泳缓冲液被污染（含RNA酶）；⑥上样量过大或RNA浓度过高：导致条带扩散模糊。5.（封闭型，4分）简述硫酸铵盐析法分离蛋白质的原理及操作要点。答案：原理：高浓度硫酸铵可中和蛋白质表面电荷，破坏水化膜，使蛋白质因疏水作用聚集沉淀；不同蛋白质的溶解度（盐析常数）不同，通过调节硫酸铵饱和度可分步沉淀。操作要点：①缓慢加入硫酸铵粉末并搅拌，避免局部浓度过高；②控制温度（通常4℃），防止蛋白质变性；③达到所需饱和度后，静置足够时间（30分钟以上）使沉淀完全；④离心收集沉淀（10000g，4℃，20分钟）；⑤透析或超滤脱盐，去除残留硫酸铵。五、应用题（共25分）1.（计算类，8分）某实验室用考马斯亮蓝法测定牛血清白蛋白（BSA）标准品的吸光度，得到以下数据：|BSA浓度（μg/mL）|0|20|40|60|80|100||||||||||OD595|0.02|0.15|0.28|0.41|0.54|0.67|现测得未知样品的OD595为0.35（已扣除空白），请绘制标准曲线（需标注坐标），并计算样品中蛋白质浓度（μg/mL）。答案：标准曲线绘制：以BSA浓度为横坐标（X轴，0100μg/mL），OD595为纵坐标（Y轴，00.67），通过线性回归得到方程。计算过程：根据数据计算线性方程：X=0时，Y=0.02（空白值，需扣除，实际Y’=Y0.02）；修正后数据：Y’（0.00,0.13,0.26,0.39,0.52,0.65）与X（0,20,40,60,80,100）呈线性关系，斜率k=(0.650)/(1000)=0.0065；方程：Y’=0.0065X→X=Y’/0.0065；未知样品OD595=0.35，扣除空白后Y’=0.350.02=0.33；样品浓度X=0.33/0.0065≈50.77μg/mL（保留两位小数）。2.（分析类，9分）某实验小组进行WesternBlot实验检测小鼠肌肉组织中的肌动蛋白（Actin，分子量43kDa），但曝光后膜上无条带。请结合实验流程（样品制备→SDSPAGE→转膜→封闭→一抗孵育→二抗孵育→显色），分析可能的失败原因（至少列出5点）。答案：可能原因：①样品制备：组织匀浆时未添加蛋白酶抑制剂，导致Actin被降解；裂解液中SDS浓度不足，蛋白质未充分变性；上样量过低（低于检测限）。②SDSPAGE：凝胶浓度不合适（如分离胶浓度过高，43kDa蛋白迁移过慢）；电泳电压过高，导致蛋白质条带扩散；未使用预染Marker，无法判断电泳是否成功。③转膜：转膜时间不足或电流过低，蛋白质未从凝胶转移到PVDF膜；膜与凝胶之间有气泡，导致局部转膜失败；转膜缓冲液中甲醇浓度过高（>20%），导致小分子蛋白（如Actin）被过度固定在凝胶中。④封闭：封闭剂（如5%脱脂奶粉）中含有与一抗交叉反应的成分；封闭时间过短（<1小时），膜上非特异性位点未被完全覆盖。⑤一抗孵育：一抗浓度过低（需优化稀释比，通常1:10001:5000）；一抗种属不匹配（如使用兔抗人Actin抗体检测小鼠样品）；孵育温度过低（4℃孵育需过夜，室温需2小时）。⑥二抗孵育：二抗与一抗种属不匹配（如一抗为兔源，二抗为鼠源）；二抗未标记HRP（或标记效率低）；孵育时间过短。⑦显色：ECL发光液失效（未避光保存或超过保质期）；曝光时间过短（需根据发光强度调整时间）；显影液/定影液失效（化学发光法）。3.（综合类，8分）设计实验方案从猪肝脏中分离纯化谷丙转氨酶（ALT，分子量约56kDa，最适pH7.4，等电点pI=5.2），要求包含主要实验步骤、关键试剂及目的，并说明纯度鉴定方法。答案：实验方案：步骤1：组织破碎与粗提取新鲜猪肝脏（50g），用预冷的0.02mol/LTrisHCl缓冲液（pH7.4，含0.1mmol/LEDTA、1mmol/LPMSF）清洗去除血液；剪碎后加入4倍体积缓冲液，用组织匀浆机冰浴匀浆（10000rpm，3次，每次30秒）；4℃、10000g离心20分钟，取上清（粗酶液），去除细胞碎片和细胞器。步骤2：硫酸铵分级沉淀在粗酶液中缓慢加入硫酸铵粉末至30%饱和度（04℃），搅拌30分钟后离心（12000g，20分钟），弃沉淀；上清继续加入硫酸铵至60%饱和度，搅拌30分钟后离心，收集沉淀；沉淀用少量0.02mol/LTrisHCl缓冲液（pH7.4）溶解，装入截留分子量30kDa的透析袋，4℃对相同缓冲液透析过夜（中间换液3次），去除硫酸铵。步骤3：离子交换层析平衡DEAE纤维素阴离子交换柱（预先用pH7.4TrisHCl缓冲液平衡）；上样透析后的酶液，用00.5mol/LNaCl梯度洗脱（梯度体积为柱体积的3倍）；检测各管OD280（蛋白质）和ALT活性（赖氏法），收集活性峰对应的洗脱液。步骤4：凝胶过滤层析平衡SephadexG100层析柱（用pH7.4TrisHCl缓冲液）；上样离子交换纯化后的酶液，用相同缓冲液洗脱，流速0.5mL/min；收集分子量约56kDa的洗脱峰（通过预染Marker定位）。关键试剂及目的：EDTA：螯合金属离子，抑制金属依赖的蛋白酶；PMSF：丝氨酸蛋白酶抑制剂，防止ALT被降解；硫酸铵：通过