PCR检验技术培训测验试题及答案

PCR检验技术培训测验试题及答案一、单项选择题（每题2分，共30分）1.以下关于PCR反应体系中TaqDNA聚合酶的描述，错误的是：A.具有5'→3'聚合酶活性B.具有3'→5'外切酶活性（校正功能）C.最适反应温度为72℃左右D.高温下（95℃）仍能保持部分活性2.荧光定量PCR中，SYBRGreenⅠ染料的作用机制是：A.与双链DNA小沟结合，激发荧光B.与单链DNA特异性杂交，释放荧光C.通过水解探针释放报告基团荧光D.与引物结合后触发荧光共振能量转移3.引物设计时，若目标基因GC含量为60%，则引物的Tm值计算公式（Wallace公式）应为：A.Tm=4（G+C）+2（A+T）B.Tm=64.9+0.41（%GC）-500/LC.Tm=2（A+T）+4（G+C）D.Tm=81.5+0.41（%GC）-675/L4.下列哪种情况最可能导致PCR扩增出现“引物二聚体”？A.模板DNA浓度过高B.引物浓度过高且存在互补序列C.dNTP浓度过低D.Taq酶浓度过低5.进行反转录PCR（RT-PCR）时，若使用Oligo(dT)引物反转录，最适用于：A.总RNA中提取mRNAB.提取所有类型的RNA（包括rRNA、tRNA）C.扩增环状RNAD.扩增原核生物RNA6.荧光定量PCR的Ct值是指：A.荧光信号达到设定阈值时的循环数B.反应体系中荧光信号最强时的循环数C.扩增产物浓度达到平台期的循环数D.引物与模板完全结合的循环数7.PCR反应中，变性步骤的主要目的是：A.使Taq酶激活B.打断DNA双链间的氢键，形成单链模板C.促进引物与模板退火结合D.延长DNA链，合成新的DNA片段8.以下关于内参基因（管家基因）的描述，错误的是：A.常用于校正样本上样量差异B.需在不同实验条件下表达稳定C.选择GAPDH、β-actin等基因D.内参基因的扩增效率应显著低于目标基因9.若PCR扩增后电泳检测无条带，可能的原因不包括：A.模板DNA降解B.Mg²+浓度过高C.引物与模板不匹配D.退火温度过高10.多重PCR技术的核心要求是：A.所有引物的Tm值差异不超过5℃B.目标基因长度差异至少100bpC.dNTP浓度需提高至常规的2倍D.必须使用热启动Taq酶11.以下哪种物质会抑制PCR反应？A.牛血清白蛋白（BSA）B.乙二胺四乙酸（EDTA）C.二甲基亚砜（DMSO）D.甘油12.实时荧光定量PCR的标准曲线法中，若斜率为-3.32，说明：A.扩增效率为100%B.扩增效率为50%C.存在引物二聚体干扰D.模板浓度过高13.进行病原体检测时，为避免假阴性结果，最关键的措施是：A.增加循环数至50次B.同时设置阳性对照和内参基因C.提高退火温度D.减少模板量14.以下关于PCR产物纯化的描述，正确的是：A.凝胶电泳回收适用于微量产物纯化B.柱式纯化法主要通过离子交换去除杂质C.纯化后的产物A260/A280应在1.8-2.0之间D.纯化步骤可省略，直接用于测序15.热启动PCR的主要目的是：A.提高扩增特异性B.缩短反应时间C.降低dNTP消耗D.增加产物产量二、填空题（每空1分，共20分）1.PCR反应的三个基本步骤是________、________和________。2.荧光定量PCR的两种主要方法是________（基于染料）和________（基于探针）。3.引物设计的基本原则包括避免自身互补、避免引物间互补、________、________和________。4.反转录PCR中，常用的反转录酶有________和________（需写出具体名称）。5.PCR反应体系中的关键成分包括模板DNA、引物、________、________、________和缓冲液（含Mg²+）。6.若扩增片段长度为500bp，延伸时间通常设置为________（时间单位）。7.检测PCR污染时，常用的方法是________（如检测dUTP标记的扩增产物）或________（如扩增空白对照）。8.多重PCR中，为避免引物间相互作用，需确保各引物对的________和________无显著差异。9.荧光定量PCR的绝对定量需要________，相对定量常用________法（写出英文缩写）。三、判断题（每题1分，共10分。正确打“√”，错误打“×”）1.PCR反应中，dNTP浓度过高会导致错配率增加。（）2.引物的3'端应尽量避免使用G或C，以减少非特异性结合。（）3.荧光定量PCR中，熔解曲线分析可用于判断扩增产物的特异性。（）4.RT-PCR中，基因组DNA污染会导致扩增产物出现非特异性条带（如包含内含子的片段）。（）5.为提高扩增效率，PCR循环数越多越好（如设置45次循环）。（）6.扩增痕量模板时，使用热启动Taq酶可减少非特异性扩增。（）7.荧光探针法的特异性高于SYBRGreenⅠ染料法。（）8.PCR产物的电泳结果中，条带位置比预期长，可能是引物二聚体导致的。（）9.检测RNA病毒时，需先进行反转录，再以cDNA为模板进行PCR扩增。（）10.为避免交叉污染，PCR实验室应严格分区，实验操作遵循“试剂准备区→样本处理区→扩增区→产物分析区”的单向流程。（）四、简答题（每题6分，共30分）1.简述PCR技术的基本原理，并说明其与体内DNA复制的主要区别。2.列举荧光定量PCR（qPCR）的主要应用场景，并说明其相对于普通PCR的优势。3.引物设计是PCR实验成功的关键，试总结引物设计的核心参数（至少5项）及具体要求。4.PCR扩增过程中，若电泳结果出现“smearedband（拖尾条带）”，可能的原因有哪些？应如何解决？5.实验室开展新冠病毒核酸检测时，需严格控制假阳性和假阴性结果。请分别说明假阳性和假阴性的常见原因及预防措施。五、案例分析题（10分）某实验室使用荧光定量PCR检测患者样本中的结核分枝杆菌DNA，部分检测结果如下：-阳性对照：Ct=20.5（正常范围18-22）-阴性对照：无Ct值（正常）-样本A：Ct=32.5（仪器提示“扩增效率低”）-样本B：Ct=16.0（正常范围18-35），但熔解曲线显示两个峰（82℃和88℃）问题：（1）样本A的Ct值偏高且扩增效率低，可能的原因有哪些？（至少3点）（2）样本B的熔解曲线出现双峰，可能的原因是什么？如何验证？（3）针对上述问题，实验室应采取哪些改进措施？答案及解析一、单项选择题1.B（Taq酶无3'→5'外切酶活性，无校正功能，易导致错配）2.A（SYBRGreenⅠ与双链DNA小沟结合，单链时无荧光）3.C（Wallace公式适用于长度<20bp的引物，Tm=2(A+T)+4(G+C)）4.B（引物浓度过高或存在互补序列易形成引物二聚体）5.A（Oligo(dT)特异性结合mRNA的polyA尾）6.A（Ct值为荧光信号达到阈值时的循环数）7.B（变性步骤通过高温打断氢键，使DNA双链解旋）8.D（内参基因与目标基因的扩增效率应一致）9.B（Mg²+浓度过高会增加非特异性扩增，而非无条带）10.A（多重PCR要求引物Tm值相近，减少退火温度差异）11.B（EDTA螯合Mg²+，抑制Taq酶活性）12.A（斜率=-3.32时，扩增效率E=10^(-1/斜率)-1≈100%）13.B（设置内参基因可校正样本质量，避免假阴性）14.C（纯化后DNA的A260/A280应在1.8-2.0，过低提示蛋白污染）15.A（热启动通过抑制低温下引物非特异性结合，提高特异性）二、填空题1.变性（95℃）、退火（50-65℃）、延伸（72℃）2.SYBRGreenⅠ染料法、TaqMan探针法3.控制GC含量（40%-60%）、优化引物长度（18-25bp）、避免连续重复碱基（如4个G）4.M-MLV反转录酶、AMV反转录酶5.dNTP、TaqDNA聚合酶、双蒸水（或无核酸酶水）6.30秒（通常1kb延伸1分钟，500bp约30秒）7.dUTP-UNG酶法、空白对照扩增法8.Tm值、扩增片段长度9.已知浓度的标准品、2^(-ΔΔCt)10.单向流程（避免交叉污染）三、判断题1.√（dNTP过高会竞争Mg²+，增加错配）2.×（引物3'端可适当使用G/C增强结合稳定性，但避免连续G/C）3.√（熔解曲线单峰提示产物单一，双峰提示非特异性扩增）4.√（基因组DNA含内含子，扩增片段比cDNA长）5.×（循环数过多会导致平台期，产物降解，非特异性增加）6.√（热启动酶在低温下无活性，减少引物错配）7.√（探针法通过序列特异性杂交，特异性更高）8.×（引物二聚体条带通常小于100bp，过长可能是模板错误或引物结合位点异常）9.√（RNA病毒需先反转录为cDNA，再PCR扩增）10.√（分区操作是PCR实验室防污染的核心措施）四、简答题1.PCR原理：PCR通过高温变性（双链DNA解旋为单链）、低温退火（引物与单链模板结合）、适温延伸（Taq酶以dNTP为原料，沿模板合成新链）的循环过程，指数级扩增目标DNA片段。与体内DNA复制的区别：①体内复制依赖解旋酶、拓扑异构酶等多种酶，PCR仅需Taq酶；②体内复制为半保留复制，全程连续；PCR为周期性循环扩增；③体内复制起点为特定序列（复制原点），PCR由引物决定扩增起点；④体内复制产物为完整基因组，PCR为特定片段。2.主要应用场景：病原体定量检测（如新冠病毒载量）、基因表达分析（如mRNA相对定量）、基因突变检测（如SNP分型）、肿瘤标志物监测（如ctDNA定量）、转基因成分检测等。优势：①实时监测扩增过程，无需电泳，避免产物污染；②可精确定量（绝对/相对定量）；③灵敏度更高（可检测低至几个拷贝的模板）；④通过熔解曲线或探针法提高特异性。3.核心参数及要求：①长度：18-25bp（过短特异性低，过长扩增效率低）；②Tm值：55-65℃（上下游引物Tm差≤5℃，避免退火温度不一致）；③GC含量：40%-60%（过高易形成二级结构，过低结合不稳定）；④3'端序列：避免连续G/C（≤3个），避免与模板非特异性结合（如3'端最后1-2位为A/T可减少错配）；⑤自身互补性：引物内部避免形成发夹结构（ΔG≤-5kcal/mol），引物间避免形成二聚体（3'端互补≤2个碱基）；⑥特异性：通过BLAST比对确保引物与非目标序列无同源性。4.拖尾条带的可能原因及解决：①模板降解：DNA断裂成小片段，扩增产物大小不一；解决：重新提取高质量模板（A260/A280≈1.8，电泳显示主带清晰）。②Mg²+浓度过高：增加非特异性扩增和错配；解决：优化Mg²+浓度（常规1.5-2.5mmol/L，梯度实验确定最佳值）。③dNTP浓度过高：竞争Mg²+，导致酶活性异常；解决：降低dNTP浓度（常规200μmol/L）。④循环数过多：产物进入平台期后降解；解决：减少循环数（常规25-35次）。⑤Taq酶量过多：非特异性扩增增加；解决：降低酶浓度（常规1-2U/50μL体系）。5.假阳性原因及预防：原因：扩增产物污染（如气溶胶）、交叉污染（样本间混合）、试剂污染（如引物或水含目标DNA）。预防：①分区操作（试剂准备区、样本处理区、扩增区、产物分析区单向流动）；②使用一次性耗材（枪头带滤芯）；③定期用紫外线/75%乙醇清洁台面；④设置阴性对照（无模板反应）监测污染。假阴性原因及预防：原因：样本中病毒载量低（如采样不规范）、模板抑制物残留（如血液中的血红蛋白、痰液中的黏液）、反转录/PCR效率低（酶失活、引物失效）。预防：①规范采样（如新冠咽拭子需擦拭咽后壁）；②优化核酸提取方法（使用含抑制物去除功能的试剂盒）；③设置内参基因（如人RPLP0基因）监测提取效率；④定期检测试剂有效性（如阳性对照Ct值是否在正常范围）。五、案例分析题（1）样本ACt值偏高且扩增效率