基因工程重点

基因工程

1.基因：是遗传的物质基础.是DNA分子上具有遗传信息的特定核昔酸序列的总称，是

具有遗传效应的DNA分子片段。

2.基因图谱：

3.基因组：指单倍染色体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。

4.载体：能载带微量物质共同参与某种化学或物理过程的常量物质，是基因工程重组DNA

技术中将•DNA片段转移至受体细胞中的一种能自我复制的DNA分了•，三种常见的载体

为细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。

5.克隆载体：实际上是一种具有特定功能的DNA分子，它们能携带外源DNA片段或基因

进入细胞，并使其在受体细胞中得以维持表达。

6,表达载体：表达载体是用来在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基因的载体。

7.穿梭载体：YRp型载体是酵母的DNA片段插入到大肠杆筐质粒中构成的其中酵母DNA

片段不但提供了选择标记本携带来自酵母染色体DNA的自主复制顺序（ARS）.因为它同时

含有大肠杆菌和酵母的自由复制基因，所以能在两种细胞中存在和复制.可以在两种截然

不同的生物细胞中复制的载体称为穿梭载体。（这类载体可以在原核细胞中复制，也可

在真核细胞中扩增和表达.）

8.RACE技术：RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段CDNA片段，通过往两端延伸扩

增从而获得完整的3,端和5,端的方法。

9.密码子：mRNA上有一•段编码区，在这一区段内，每3个核昔酸组成一个密码子，密码

多肽链上的一个氨基酸。

10.CDNA文库：某种生物材料的基因转录产物mRNA经反转录形成不同的cDNA片段，与

克隆载体重组后贮存在受体菌群体中，这样的群体称为cDNA基因文库。

11.SD序列：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。SD序列在细菌mRNA起始密码子

AUG上游10个碱基左右处，有一段富含噂吟的碱基序列，能与细菌16SrRNA3'端识别，

帮助从起始AUG处开始触译。

12.MCS：多克降位点，是包含在多个限制性酶切位点的一段很短的DNA序列，是基因工程

中常用到的载体质粒的标掂配置序列。

13.EST：表达序列标签，是指基因序列中一段能特异地标记或表征基因的序列。（通常它含

有足够的结构信息以显示出该基因与其他基因的差异，长度为100~500bpo）

14.探针：是指具有同特异性目标分子产生很强的相互作用并可对其相互作用的产物进行有

效检测的分子。

15.蓝白斑筛选：是一种基因工程常用的细菌重组子的筛选方法，重组菌斑呈无色透明，非

重组菌斑则呈蓝色。

16.转座子：它是•种特殊的DNA序列，可以在染色体上从•个位置跳跃到另•个位置，

或者在染色体之间跳跃。

17.增强子：是能够增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列，可处于上游，也可处于下

游。

18.启动子：是一段提供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列，它一般位于基因的上游。

19.操纵子：是一组关键的核昔酸序列，包括了一个操纵基因（Operator）,一个普通的启动

子，及一个或以上的结构基因被用作生产信使RNA（mRNA）的基元。

20.基因诊断：就是在基因水平上对疾病或人体的状态进行诊断，它包括产前诊断，是一种

新的临床诊断方法。

21.基因治疗：是指以正常的基因代替或修补患者细胞中的缺陷基因从而达到治疗疾病的目

的，是治疗分子疾病最有效的手段之一。

22.基因敲除：基因敲除乂称基因打靶，该技术通过外源DNA与染色体DNA之间的

同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体D\A可

与R的片段共同稳定遗传等特点。它是在胚胎干细胞技术和同源重组技术基

础，上发展起来的。

23.转染：是采用与质粒DNA转化受体细胞相似的方法，将重组人噬菌体DNA分子直接导

入受体细胞中的过程。

24.转化：外源遗传物质（如质粒DNA等）进入细菌，引起细菌遗传变化的现象。

25.粘性末端：两条DNA链上磷酸二酣键断开的位置是交错的，酶切结果使DNA片段末端

的一条链多出1至几个核甘酸，可同另一DNA片段互补核甘酸末端黏结，这样的DNA

片段称为黏性末端。

26.平末端：两条DNA链上磷酸二酯键断开的位置处在识别序列的对称结构中心，衡切割

产生的DNA片段末端是平齐的，称之为平末端。

27.DNA芯片：又称基因芯片，它是指用原位合成或显微印刷技术，将数以万计的DNA探

针分子固定于支持物的表面上，产生的二维DNA探针阵列，

28.基因表达：是指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程，

合成特定的蛋白质，进而发挥其特定的生物学功能和生物学效应的全过程。

简答题和论述题

1.克隆载体DNA的基本条件。

（1）针对受体细胞的可转移性

（2）自主复制功能

（3）显著的筛选标记

（4）特定的多克隆位点

（5）安全性

2.限制性内切酶的活性受什么因素的影响。

⑴酶的纯度。

（2）DNA样品的纯度。

⑶DNA的甲基化程度。

⑷触切反应的温度与时间。

（5）DNA分子的构型。

（6邪艮制性核酸内切酶的反应缓冲液。

3.质粒的相溶性及机制。

能在同一宿主细胞中共存的不同质粒称为亲和性质粒或相溶性。质粒复制必须同细胞质

膜结合，各种质粒有各自的结合位点，而亲缘关系密切的质粒有着相同的结合位点。当一种

质粒占满结合位点后，亲缘关系密切的其他质粒即使进入细胞也无立足之地，只能自行消失。

4.染色体步移的步骤。

（1）首先用已知的基因或分子标记作为探针，从基因文库中筛选出与其有共同序列的克隆。

（2）再以克隆DNA片段制备探针从文库中筛选出与之有部分重登且更加靠近目的基因的

一个新克降。同理，以新克降DNA片段作探针可以依次筛诜出一些列克降来，直至获得所

需的目的基因克隆。

5.提高外源基因表达的方法。

（1）构建融合蛋白表达系统

（2）构建分泌蛋白表达系统

（3）构建包涵体表达系统

（4）选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统

6.原核细胞是理想受体细胞的原因。

（1）大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA的进入。

（2）没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA与裸露的染色体DNA

重组减少了麻烦。

（3）基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。

（4）原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料.并且培养简单，繁殖迅速，

实验周期短，重复实验快。

7.细菌碱性磷酸酶（BAP）和小牛碱性磷酸酶（GP）的差别与应用。

差别：CIP更为常用，因其在60℃〜70C条件下保温15min就可以完全失活，便于终止

反应;而BAP是耐热性酶，必须用酚-氯仿反复提取才能除去，终止反应。且QP的活性高出

BAP10〜20倍。

应用：（1）一是脱载体末端的磷酸基，避免在DNA重组时载体分子的自我连接。

（2）另一用途就是和T4多聚核甘酸激葡合用，用于DNA的末端标记。

8.DNA芯片的应用。

（1）基因测序

（2）基因表达水平的检测

（3）基因诊断

（4）新药筛选

（5）临床用药

9.肿瘤的细胞因子治疗有哪些种类。

（1）免疫效应细胞介导的细胞因子基因治疗。

（2）肿瘤细胞靶向的细胞因子基因治疗。

（3）成纤维细胞等载体细胞介导的细胞因子基因治疗。

（4）以抗原呈递细胞为基础的细胞因子基因治疗。

（5）肿瘤细胞靶向的细胞因子受体基因治疗。

10.构建质粒克隆载体的策略。

（1）能在受体细胞中进行有效的复制，并有较多的拷贝数。

（2）含有外源DNA片段克隆的位点，并且克隆位点越多越好。

（3）含有供选择克隆子的标记基因。

（4）载体DNA分子应尽可能的小。

（5）构建不同用途的质粒载体时，可以根据特殊需要组装各种元件。

11.增强子的特征。

（1）双向性

（2）重复序列

（3）增强子行使功能与所处的位置无关

（4）特异性

（5）增强子不仅与同源基因相连时有调控功能，与异源基因相连时也有功能。

12.代谢工程中提高目标产物的方法。

（1）增加限速步骤艇编码基因的拷贝数

（2）强化以启动子为主的关键基因的表达系统

（3）提高途径激活因子的合成速率

（4）灭活途径抑制因子的编码基因

填空或者选择

1.转基因的步躲及检测方法,

动物箝基因的主要步募.

试题答室•

主要步骤包括目的基因的分离与克展；表达爹休的构建；受体细期蟠得；基因导入；受体动物的选择及转基因

胚胎的移植；转基因整合表达的检浅；转基因动物的性砌费及转基因表达产物的分常与纯化；转基因动物的遗

传性差研究以及性能选育；组建造县因动物新类群等.

2,松弛型质粒与严紧型质粒的区别。

松弛型质粒：拷贝数较多(10拷贝数以上.)

严紧型质粒：拷贝数少(1至数个拷贝)

一般而言，小质粒多为松池型的，大质粒多为严紧型质粒的，但无严格界限。

3.那些酶需要引物，那些酶不要引物。

需要引物的防：引物酹、DNA聚合前，反转录酶

不需要引物的酶：RNA聚合酶

4.三种blot检测的产物是什么。

(1)southern印迹杂交：DNA分子

(2)northern印迹杂交：RNA分子

(3)western印迹法：蛋白质

5.各种教体的容量。

质粒载体容量：小于10kb。噬菌体载体容量：9〜23kb

6.DNA连接酶的活性以及使用方法。

DNA连接前，也称DNA黏合酶，此施依赖腺昔三磷酸(ATP)或烟酰胺腺喋吟二核甘酸(NAD)

水解提供的能量，催化毗邻的一条DNA链的5磷酸基5-P)与另一条DNA链的3-羟基

⑶-0H)之间发生缩合反应生成磷酸二酯键，结果使断裂的DNA链重新接合，或使双链

DNA上核甘酸之间因磷酸二幅键断裂而造成的裂口重新闭合。DNA连接酹不能催化两条

游离的DNA单链的连接，也不能催化双链中DNA因缺失一个或多个核甘酸所造成的缺口

(gap)连接。在细胞内，DNA连接酶参与DNA的复制、修复和重组作用;在体外，DNA

连接酣参与人为控制的DNA片段连接，使基因在试管内重组成为可能

7.基因的概念

是遗传的物质基础，是DNA分子上具有遗传信息的特定核甘酸序列的总称，是具有遗

传效应的DNA分子片段。

8.限制性内切酶的活性。

星号活性

9.病毒载体的应用。

(1)构钝CDNA基因文库

(2)用于克隆外源目的基因

10.总结各种酶类活性的方向，

11.CDNA文库的构建方法。

步骤：(1)分离细胞总RNA,并从总RNA中分离纯化出mRNA。

(2)以mRNA分子为模板，合成cDNA第一链。

（3）双链cDNA的合成。

方法•：大肠杆菌RNaseH酹降解取代法

方法二：oligo寡聚引物引导法合成双链cDNA。

方法三：PCR法

方法四：固相支持法

（4）将合成的双链CDNA与载体重组，导入大肠杆菌宿主细胞增殖

12.质粒的提取和电泳。

13.细菌人工染色体的特征。

BAC载体的容纳能力一般为100~350kb,容量比YAC载体小，但也具有YAC载体无可

比拟的优点，如下

（l）BAC的复制子来源于F因子，可稳定遗传，缺失、嵌合及重组现象少。

（2）以大肠杆菌为宿主,对宿主细胞的毒副作用小，转化率高。

（3）从大肠杆菌中提取制备及其体外操作等更方便。

（G构建BAC文库比YAC文库更容易。

（5）可以通过菌落原位杂交来筛选目的基因，方便快捷。

（6）BAC载体在克隆位点的两侧具有T7和SP6聚合酶启动子，可以用于转录获得RNA

探针或直接用于插入片段的末端测序。

基于上述优越性，BAC载体成为大片段基因组文库的主要载体，也是基因组测序和

基因组遗传图谱和物理图漕构建的主要工具。

14.入噬菌体载体的特征。

、噬菌体由DNA（人DNA）和外壳蛋白组成。入噬菌体分头部和尼部，DNA集中在头

部。

X噬菌体DNA在噬菌体中是线状DNA分子，全长48502bp,左右两端备有12个

核仃酸组成的5凸出黏性末端，而旦两者的核肯酸序列互补，即入DNA进人宿主细胞后，

黏性末端连接后形成环状DNA分子。把此能连接的末端称为cos位点。

15.黏性末端和平末端。

其一，两条DNA链上磷酸二酯健断开的位置是交错的，酶切结果使DNA片段末端的一

条链多出1至几个核甘酸，可同另一DNA片段互补核甘酸末端黏结，这样的DNA片段末端

称为黏性末端。如果DNA片段未端的引端比S端长的称为引黏性末端;同样，DNA片段5,端

比3,端长的称为5,黏性末端。

其二，两条DNA链上磷酸二酯键断开的位置处在识别序列的对称结构中心，酶切割产

生的DNA片段末端是平齐的，称之为平末端。

16.探针标记的方法。

（1）切口平移标记法

（2）随机引物标记法

（3）末端标记法

17.mRNA的分布。

（1）细胞中mRNA的含量虽然只占RNA总量的1%〜5%,但是mRNA的种类繁多，•个哺

我类动物的细胞中就有成千上万种不同的mRNA分子。

（2）真核细胞的一个mRNA分子一般只携带一种肽链编码信息，合成一种多肽链，属于单

顺反子的形式。

（3）原核生物结构基因转录的mRNA一般是不经过加工的，其5'端不含“帽子”结构；3

端不含poly（A）“尾巴”。

18.基因治疗与基因类型。

是指以止常的基因替代或修补患者细胞中的缺陷基因从而达到治疗疾病

的目的，是治疗分子疾病最有效的手段之一。

类型：第一：正常基因，第二：反义基因，第三，自杀基因

19.提高真核生物基因表达水平的方法。

20.全酶与核心酶。

核心酶(coreenzyme)：大肠杆菌的RNA聚合酶全酶由5个亚基组成(a2B,B

6),没有6基的酶叫核心酶。

酹蛋白和辅因子单独存在时，均无催化活力。只有二者结合成完整的分子时，才

具有活力。此完整的酶分子成为全酶。

全萌=酶蛋白+辅因子

21.RNA聚合酶的活性和种类。

RNA聚合酶I:合成核糖体RNA(rRNA)前体45S,当成熟后会成为28S、18S及5,8S

核糖为RNA，是将来核糖体的主要RNA部份。

RNA聚合解H:合成信使RNA(mRNA)的前体及大部份小核RNA(snRNA)以及微型

RNA(microRNA)o因为它在转录过程中需要多种转录因子才能与启动子结合，所以这是现

时最多研究的种类。

RNA聚合酶III:合成转运RNA(tRNAS)、rRNA5S及其他可以在细胞胞核及原生质找

到的细小的RNA。

前位置产物活性比较对a-鹅甘芭联的敏感性

RNA聚合酶I核仁rRNA50-70%不敏感

RNA聚合酶n核浆hnRNA20-40%敏感

RNA聚合酶m核浆小RNA10%有种属特异性

22.了解基因工程产生的药物的种类。

<1)基因工程激素类药物

(2)基因工程细胞因子类药物

(3)基因工程抗体

(4)基因工程受体

(5)基因工程疫苗

23.cos序列的概念。

噬菌体X为线性双链DNA病毒，野生型的x噬菌体其基因组两端各有12个核甘酸的

5'突出，碱基互补，为极有效的粘性末端，称为COS序列。

24.甲基化酶的作用。

甲基化前一般与限制性内切核酸酶具有相同的识别序列，所以用限制性内切核酸前的名

称来命名甲基。

(1)一旦在识别序列中的核甘酸被甲基化甑甲基化，就会影响限制性内切核酸酶的酶

切效率。

(2)甲基化对DNA起着保护作用，为了DNA的某些区域不被限制性内切核酸的酶切,

可以使其中的一些识别序列的碱基用甲基化

25.终止子的类型。P219

(1)本征终止子

（2）依赖终止子

26.DNA琼脂糖凝胶电泳。

琼脂糖凝胶电泳即非变性琼脂糖凝胶电泳，是指用琼脂糖制备的凝胶的电泳，主要

用于检测DNA分