《生物化学》-第6章

６．１核酸的概述6.1.1核酸的发现和研究简史１８６８—１８６９年期间，瑞士青年科学家Ｆ．Ｍｉｅｓｃｈｅｒ从外科绷带上脓细胞的细胞核中提取到一种富含磷元素的酸性化合物，并在所有细胞的核里都找到了此物质，因其存在于细胞核中而将它命名为“核质”（ｎｕｃｌｅｉｎ），他的导师Ｆ．ＨｏｐｐｅＳｅｙｌｅｒ经过重复验证后于１８７１年将该发现的原论文和补充论文发表于世。此后，Ｆ．Ｍｉｅｓｃｈｅｒ将研究方向转为鲑鱼精子头部的物质，除分离到高相对分子质量含磷的酸性物质（即现在已知的ＤＮＡ）外，还分离得到了一种碱性化合物，称为鱼精蛋白（ｐｒｏｔａｍｉｎｅ），由此，Ｆ．Ｍｉｅｓｃｈｅｒ被称为细胞核化学的创始人和ＤＮＡ的发现者。下一页返回６．１核酸的概述

１８８９年，Ｒ．Ａｌｔｍａｎｎ发展了从酵母和动物组织中制备不含蛋白质的核酸的方法，核酸（ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ）这一名词就是由Ｒ．Ａｌｔｍａｎｎ提出的。１８９４年，Ａ．Ｋｏｓｓｅｌ和Ａ．Ｎｅｕｍａｎ报道了一种从胸腺中制备核酸的方法。酵母菌和胸腺细胞的核都比较大，核酸含量高，是制取核酸的极好来源，因此历史上这两种核酸也研究得最多。Ａ．Ｋｏｓｓｅｌ和同事还鉴定了核酸中的大部分碱基，其在核酸领域的研究成就获得了１９１０年诺贝尔医学奖，但他却认为决定染色体功能的是蛋白质，因而获奖后转而研究染色体蛋白质。上一页下一页返回６．１核酸的概述

6.1.2核酸的种类和分布核酸分为两大类，即脱氧核糖核酸（ＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ，ＤＮＡ）和核糖核酸（ＲｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ，ＲＮＡ），所有生物细胞都含有这两类核酸，目前发现的病毒只含ＤＮＡ或ＲＮＡ，未发现两者皆有的病毒。ＤＮＡ通常为双链结构，ＲＮＡ为单链结构。ＤＮＡ是绝大多数生物的遗传物质，ＲＮＡ是少数不含ＤＮＡ的病毒（如烟草花叶病毒、流感病毒、ＳＡＲＳ病毒等）的遗传物质。上一页下一页返回６．１核酸的概述

ＲＮＡ在蛋白质合成过程中起着重要作用，其中转运核糖核酸，简称ｔＲＮＡ，起着携带和转移活化氨基酸的作用；信使核糖核酸，简称ｍＲＮＡ，是合成蛋白质的模板；核糖体的核糖核酸，简称ｒＲＮＡ，是细胞合成蛋白质的主要场所。此外，还有一些其他类别的ＲＮＡ。从所含核苷酸分子数量上比较，ＤＮＡ一般都比ＲＮＡ大得多。如人的细胞核最小的ＤＮＡ分子含有４５００００００个碱基对，而人细胞培养中最大的ＲＮＡ分子仅含约５００００个核苷酸分子，略大于最短的ＤＮＡ链的１／１０００倍。上一页下一页返回６．１核酸的概述

１.脱氧核糖核酸（犇犖犃）脱氧核糖核酸（ＤＮＡ）是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸，即腺嘌呤脱氧核苷酸（ｄＡＭＰ）、胸腺嘧啶脱氧核苷酸（ｄＴＭＰ）、胞嘧啶脱氧核苷酸（ｄＣＭＰ）、鸟嘌呤脱氧核苷酸（ｄＧＭＰ）。脱氧核糖（五碳糖）与磷酸分子以酯键相连，组成其长链骨架，排列在外侧，四种碱基排列在内侧。每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连，这些碱基沿着ＤＮＡ长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，指导蛋白质的合成。大多数ＤＮＡ含有两条这样的长链，也有的ＤＮＡ为单链，如大肠杆菌噬菌体φＸ１７４、Ｇ４、Ｍ１３等。上一页下一页返回６．１核酸的概述

ＤＮＡ有环形ＤＮＡ和链状ＤＮＡ之分。在某些类型的ＤＮＡ中，５-甲基胞嘧啶可在一定限度内取代胞嘧啶，其中小麦胚ＤＮＡ的５甲基胞嘧啶特别丰富。在某些噬菌体中，５-羟甲基胞嘧啶取代了胞嘧啶。不同物种ＤＮＡ的碱基组成不同，但其中的腺嘌呤数等于其胸腺嘧啶数（Ａ＝Ｔ），鸟嘌呤数等于胞嘧啶数（Ｇ＝Ｃ），因而嘌呤数之和等于嘧啶数之和。原核细胞中ＤＮＡ集中在核区。真核细胞ＤＮＡ分布在核内，组成染色体（染色质），线粒体、叶绿体等细胞器内也有ＤＮＡ。原核生物染色体ＤＮＡ、质粒ＤＮＡ（染色体外基因，能自主复制并给出附加性状）、真核生物细胞器ＤＮＡ都是环状双链ＤＮＡ。上一页下一页返回６．１核酸的概述

真核生物染色体是线型双链ＤＮＡ（ｌｉｎｅａｒｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡ），末端具有高度重复序列形成的端粒（ｔｅｌｏｍｅｒｅ）。病毒必须依存宿主细胞，可以看作是一些游离的基因，ＤＮＡ病毒种类很多，结构各异。２.核糖核酸（犚犖犃）核糖核酸（ＲＮＡ）存在于生物细胞及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体，是少数不含ＤＮＡ的病毒（如烟草花叶病毒、流感病毒、ＳＡＲＳ病毒等）的遗传物质。ＲＮＡ由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。上一页下一页返回６．１核酸的概述

一个核糖核苷酸分子由磷酸、核糖和碱基构成。ＲＮＡ的碱基主要有４种，即Ａ（腺嘌呤）、Ｇ（鸟嘌呤）、Ｃ（胞嘧啶）、Ｕ（尿嘧啶），其中，Ｕ（尿嘧啶）取代了ＤＮＡ中的Ｔ。ＲＮＡ主要分布在细胞质中。6.1.3核酸的生物学功能１８６５年，Ｇ．Ｍｅｎｄｅｌ发现豌豆杂交后代性状分离和自由组合的遗传规律；１９６８年，Ｆ．Ｍｉｅｓｃｈｅｒ发现核素。直到２０世纪４０年代才了解ＤＮＡ和ＲＮＡ都是细胞的重要组成物质，前者引起遗传性状的转化，后者参与蛋白质的生物合成。上一页下一页返回６．１核酸的概述

核酸的研究已成为生命科学研究的核心和前沿，研究成果改变了生命科学的面貌，促进了生物技术产业的发展，充分表明核酸具有重要的生物功能。上一页返回６．２核苷酸核酸的基本单位是核苷酸（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ），核苷酸是核糖核酸及脱氧核糖核酸的基本组成单位，是体内合成核酸的前身物。核苷酸随着核酸分布于生物体内各器官、组织、细胞的核及胞质中，并作为核酸的组成成分参与生物的遗传、发育、生长等基本生命活动。生物体内还有相当数量以游离形式存在的核苷酸，它们具有重要的生理功能。下一页返回６．２核苷酸６.２.１核苷酸的结构核苷酸可分为（核糖）核苷酸［（ｒｉｂｏ）ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ］和脱氧（核糖）核苷酸［ｄｅｏｘｙ（ｒｉｂｏ）ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ］两类（图６１），二者化学结构基本相同，只是所含戊糖不同。戊糖Ｃ５与磷酸间形成酯键，戊糖Ｃ１与嘌呤Ｎ９或嘧啶Ｎ１间形成核苷键，三者联成一体。核苷酸碱基（ｂａｓｅ）由含氮杂环化合物嘌呤（ｐｕｒｉｎｅ）和嘧啶（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）两大类构成。上一页下一页返回６．２核苷酸核苷酸中的嘌呤碱主要指腺嘌呤（ａｄｅｎｉｎｅ，Ａ）和鸟嘌呤（ｇｕａｎｉｎｅ，Ｇ），在ＤＮＡ和ＲＮＡ中均含有这两种碱基。核苷酸中的嘧啶碱主要指胞嘧啶（ｃｙｔｏｓｉｎｅ，Ｃ）、胸腺嘧啶（ｔｈｙｍｉｎｅ，Ｔ）和尿嘧啶（ｕｒａｃｉｌ，Ｕ），其中胞嘧啶存在于ＤＮＡ和ＲＮＡ中，胸腺嘧啶只存在于ＤＮＡ中，尿嘧啶则只存在于ＲＮＡ中。上一页返回６．３ＤＮＡ的结构6.3.1DNA的一级结构ＤＮＡ是由成千上万个脱氧核糖核苷酸聚合而成的多聚脱氧核糖核酸，ＤＮＡ分子上四种核苷酸（ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ）按照一定的排列顺序，通过磷酸二酯连接形成的多核苷酸叫作核酸的一级结构。由于核苷酸之间的差异仅仅是碱基，故又可以把ＤＮＡ一级结构称为碱基顺序，不同的ＤＮＡ分子具有不同的核苷酸排列顺序，并携带不同的遗传信息。核酸中核苷酸的连接方式是以分子式中一分子磷酸和核苷脱去一分子水形成单核苷酸，只含有一个磷酸基团。下一页返回６．３ＤＮＡ的结构

6.3.2DNA的高级结构１.DNA的二级结构１９５３年，Ｗａｔｓｏｎ和Ｃｒｉｃｋ建立了ＤＮＡ的双螺旋结构模型（ｄｏｕｂｌｅｈｅｌｉｘｍｏｄｅｌ），揭示了遗传信息如何储存在ＤＮＡ分子中，以及遗传性状何以在世代间得以保持。两条单链ＤＮＡ通过碱基互补配对的原则，所形成的双螺旋结构称为二级结构，此结构是在核酸一级结构基础上形成的更为复杂的高级结构。主要有三方面依据：①核酸化学结构、核苷酸键长和键角数据。②ＤＮＡＸ射线衍射分析。上一页下一页返回６．３ＤＮＡ的结构

③ＤＮＡ碱基组成的Ｃｈａｒｇａｆｆ规则，同一物种不同组织和器官无特异性，ＤＮＡ碱基组成具有生物物种特异性，且碱基摩尔数为Ａ＝Ｔ、Ｇ＝Ｃ、Ａ＋Ｃ＝Ｇ＋Ｔ，不受生长发育、营养状况和外界环境的影响。２.DNA的三级结构双螺旋ＤＮＡ进一步扭曲盘绕则形成其三级结构，包括不同二级结构单元间的相互作用、单链与二级结构单元间的相互作用及ＤＮＡ的拓扑特征。ＤＮＡ双螺旋分子在溶液中处于能量最低状态时为松弛态，当其额外多转或少转几圈时，就会产生张力。如果双螺旋分子末端是开放的，这种张力可以通过链的转动释放出来，恢复正常双螺旋状态。上一页下一页返回６．３ＤＮＡ的结构

但如果ＤＮＡ分子两端是固定的，或者是环状分子，张力不能释放，ＤＮＡ分子本身就会扭曲，以抵消张力。这种扭曲就是超螺旋，是ＤＮＡ三级结构的一种主要形式。２０世纪６０年代，Ｊ．Ｖｉｎｏｇｒａｄ对环状ＤＮＡ分子的拓扑结构进行了研究，提出了ＤＮＡ的拓扑学公式。细菌染色体ＤＮＡ、质粒ＤＮＡ、细胞器ＤＮＡ、某些病毒ＤＮＡ等都是双链环状分子（ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｅｄｃｉｒｃｕｌａｒｍｏｌｅｃｕｌｅ）。环状ＤＮＡ的三种典型构象是：①松弛环形ＤＮＡ，线形ＤＮＡ直接环化；②解链环形ＤＮＡ，线形ＤＮＡ拧松后再环化；上一页下一页返回６．３ＤＮＡ的结构

③正超螺旋与负超螺旋ＤＮＡ。细菌中可以提取到相对分子质量不太大的天然环状ＤＮＡ，通常可以观察到３种形式的ＤＮＡ：共价闭环ＤＮＡ（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙｃｌｏｓｅｄｃｉｒｃｕｌａｒＤＮＡ，ｃｃｃＤＮＡ），这类ＤＮＡ常呈超螺旋型（ｓｕｐｅｒｈｅｌｉｃａｌｆｏｒｍ）；双链环状ＤＮＡ的一条链断裂，称为开环ＤＮＡ（ｏｐｅｎｃｉｒｃｕｌａｒＤＮＡ，ｏｃＤＮＡ），分子呈松弛态；环状ＤＮＡ双链断裂，称为线型ＤＮＡ（ｌｉｎｅａｒＤＮＡ）。环状ＤＮＡ的重要拓扑学特性：上一页下一页返回６．３ＤＮＡ的结构

３.DNA与蛋白质复合体生物体内的核酸通常都是与蛋白质结合形成复合体。自然界最简单的生物———病毒，以及细胞内最重要的细胞器———染色体和核糖体，都是由核酸和蛋白质组成的复合体，它们的活性部分地或几乎全部地表现为生命的特性，即自我复制（ｓｅｌｆｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）和自我表达（ｓｅｌｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）的特性。（１）病毒病毒（ｖｉｒｕｓ）是主要由核酸和蛋白质组成的非细胞生物，因此，有些学者把它们看成是裸露的染色体，其上载有几个到几百个基因。上一页下一页返回６．３ＤＮＡ的结构

从结构上看，核酸在内、蛋白质在外包裹着核酸，这层蛋白质外壳称为衣壳（ｃａｐｓｉｄ），它由许许多多亚基（ｓｕｂｕｎｉｔ）组成。病毒核酸也分为两类：ＤＮＡ和ＲＮＡ。只含ＤＮＡ的病毒称为ＤＮＡ病毒，只含ＲＮＡ的病毒称ＲＮＡ病毒，目前尚未发现既含ＤＮＡ又含ＲＮＡ的病毒。衣壳起着保护核酸和识别宿主细胞的作用。依宿主不同，可将病毒分为动物病毒、植物病毒和细菌病毒。细菌病毒又叫噬菌体。植物病毒多为ＲＮＡ病毒。动物病毒和噬菌体既有ＤＮＡ病毒，也有ＲＮＡ病毒。上一页下一页返回６．３ＤＮＡ的结构

研究的较详细的噬菌体是Ｔ２噬菌体，研究得较详细的植物病毒是烟草花叶病毒（ＴＭＶ）。Ｔ２噬菌体是一种ＤＮＡ病毒，有一个多面体的头部，连接一个尾部，尾部末端有基板尖钉和尾丝。ＴＭＶ是一种ＲＮＡ病毒，呈杆状，长约３００ｎｍ，直径约１８ｎｍ。衣壳由２１３０个含１５８个氨基酸残基组成的亚基（ｓｕｂｕｎｉｔ）构成，内含一条６４００个核苷酸残基的ＲＮＡ单链。大多数病毒的核酸为双链ＤＮＡ或单链ＲＮＡ，但已发现一些简单的噬菌体含单链ＤＮＡ，一些ＲＮＡ病毒（如呼肠孤病毒）含双链ＲＮＡ。病酸的大小差异也很大，例如噬菌体ＱＢ的核酸序列上只载有三个基因，而牛痘病毒的核酸却含有２４０个基因。上一页下一页返回６．３ＤＮＡ的结构

病毒核酸感染其宿主细胞后，在主观上使自身增殖，在客观上使宿主细胞或宿主细胞所在的生物个体产生裂解、病变或癌变。（２）细菌的拟核细菌虽然没有真核的核结构，但染色体ＤＮＡ并非完全散开的，而是紧密缠绕，形成致密小体，称为拟核（ｎｕｃｌｅｏｉｄ），也称核区（ｎｕｃｌｅａｒｒｅｇｉｏｎ）。例如，大肠杆菌体长１～２μｍ，其ＤＮＡ长度为１１００μｍ，等于菌体的１０００倍。由于高度折叠，拟核只占菌体的很小一部分。大肠杆菌基因组为双链环状的ＤＮＡ分子，其上结合碱性蛋白和少了ＲＮＡ，在细胞中以紧密缠绕成的较致密的不规则小体形式存在于细胞中。上一页下一页返回６．３ＤＮＡ的结构

它在电子显微镜下看到的是一个透明的，不易着色的纤维状区域，经特殊染色可以呈现各种形状，在光学显微镜下可见，呈球状、棒状、哑铃状。（３）真核生物的染色体染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）的组成成分是组蛋白和ＤＮＡ。组蛋白（ｈｉｓｔｏｎｅ）是富含碱性氨基酸赖氨酸（Ｌｙｓ）和精氨酸（Ａｒｇ）的碱性蛋白质。根据Ｌｙｓ／Ａｒｇ比值的不同，可将组蛋白分为Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３和Ｈ４五种，每种组蛋白都是单链蛋白，相对分子质量为１１０００～２１０００Ｄ。Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３和Ｈ４各两分子对称聚合形成组蛋白八聚体，其外形为１０ｎｍ×５．５ｎｍ的椭圆形。上一页下一页返回６．３ＤＮＡ的结构

约１４６ｂｐ长的ＤＮＡ双螺旋沿短轴盘绕在椭圆形八聚体的表面上而成为核小体（ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ），直径为１１ｎｍ。核小体之间的ＤＮＡ双螺旋长度为１５～１００ｂｐ，一般是６０ｂｐ，其上结合有Ｈ１。随着细胞周期的变化，这种串联的核小体结构，即染色质（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ），将进一步折叠，最终成为染色体，压缩比能达到１００００。因此，染色体和染色质是同一种核蛋白体———核小体在不同折叠层次上的不同存在形式。上一页返回６．４ＲＮＡ的结构

6.4.1DNA的一级结构细胞中的ＲＮＡ，按其在蛋白质合成中所起的作用，主要可分为三种类型，即核糖体ＲＮＡ（ｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡ，ｒＲＮＡ）、转运ＲＮＡ（ｔｒａｎｓｆｅｒＲＮＡ，ｔＲＮＡ）和信使ＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒＲＮＡ，ｍＲＮＡ）。ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ是ＤＮＡ双螺旋中的反义链局部转录的产物，因此，它们具有与ＤＮＡ不同的结构特点。这些ＲＮＡ的一级结构一般是比相应的ＤＮＡ反义链短得多的单链；核苷酸之间仍以３′，５′磷酸二酯键相连；单链回折在能配对的区段形成双螺旋（配对原则是Ａ配Ｕ、Ｇ配Ｃ），在不能配对的区段形成突环，因此，ＲＮＡ分子中的Ａ与Ｕ和Ｇ与Ｃ不遵从碱基当量定律。下一页返回６．４ＲＮＡ的结构局部双螺旋所占的比例越大，ＲＮＡ分子越稳定。三种ＲＮＡ的螺旋化程度以ｔＲＮＡ为最高，ｒＲＮＡ次之，ｍＲＮＡ最小。6.4.2DNA的高级结构ＲＮＡ的多核苷酸链可以在某些部分弯曲折叠，形成局部双螺旋结构，此即ＲＮＡ的二级结构。在ＲＮＡ的局部双螺旋区，腺嘌呤（Ａ）与尿嘧啶（Ｕ）、鸟嘌呤（Ｇ）与胞嘧啶（Ｃ）之间进行配对，无法配对的区域以环状形式突起，这种短的双螺旋区域和环状突起称为发夹结构，ＲＮＡ在二级结构的基础上进一步弯曲折叠，就形成各自特有的三级结构。上一页返回６．５核酸的理化性质6.5.1一般物理性质核酸属于大分子化合物，ＤＮＡ相对分子质量特别巨大，一般为１０６～１０１０。不同生物、不同种类ＤＮＡ相对分子质量差异很大，如多瘤病毒ＤＮＡ相对分子质量为３×１０６，而果蝇染色体ＤＮＡ相对分子质量为８×１０１０。ＤＮＡ具有双螺旋结构，使分子具有一定的刚性，但ＤＮＡ极为细长，又具有柔性。ＲＮＡ相对分子质量在数百至数千万之间。ＤＮＡ为白色纤维状固体，ＲＮＡ为白色粉末状固体，ＤＮＡ和ＲＮＡ属于极性化合物，微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。下一页返回６．５核酸的理化性质

但其钠盐在水中的溶解度大，如ＲＮＡ在水中的溶解度可达４％。核酸在７０％的乙醇中形成沉淀，故常在核酸粗溶液中加入二倍体积的乙醇，使核酸沉淀出来。ＤＮＡ分子细长，分子长度有的达数厘米，如人的第十三对染色体ＤＮＡ相对分子质量为６．４×１０１０，伸展长度可达３．２厘米，而分子直径只有２ｎｍ，因此即使是稀溶液，也有很大的黏度。当ＤＮＡ变性时，分子形状由双螺旋变为无规线团，空间伸展长度变短，使溶液黏度降低，因此可用黏度作为ＤＮＡ变性的指标。上一页下一页返回６．５核酸的理化性质

6.5.2核酸的紫外吸收核酸及其降解物核苷酸由于其分子中嘌呤环或嘧啶环的共轭体系而使之强烈地吸收２６０～２９０ｎｍ波段的紫外光，其最高吸收峰接近２６０ｎｍ，可用紫外分光光度计进行定量和定性测定。核酸和核苷酸的紫外吸收性质可用来测定其浓度和纯度。6.5.3核酸的酸碱性质核酸分子中具有很多呈酸式解离的磷酸残基和呈碱式解离的氮原子，因此核酸是两性电解质，在水溶液中能发生两性电离，具有等电点。ＤＮＡ双螺旋两条链间氢键的形成与其解离状态有关，在ｐＨ４．０～１１．０范围内碱基最稳定。上一页下一页返回６．５核酸的理化性质

由于磷酸基的ｐ犓较低，所以当溶液ｐＨ大于４．０时，核酸呈多阴离子状态，易与碱性蛋白结合。6.5.4核酸的变性、复性及杂交１.核酸的变性指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，并不涉及共价键的断裂。多核苷酸骨架上共价键（３′，５′磷酸二酯键）的断裂称为核酸的降解。降解引起核酸相对分子质量的降低。引起核酸变性的因素主要有：温度引起的热变性；由酸碱度引起的酸碱变性；尿素是聚丙烯酰胺凝胶时测定ＤＮＡ序列的常用的变性剂。上一页下一页返回６．５核酸的理化性质

当将ＤＮＡ的稀盐溶液加热到８０～１００℃时，双螺旋结构即发生解体，形成无规线团。其理化性质也随之发生改变：①２６０ｎｍ区紫外吸收值升高，原因是碱基的暴露；②黏度降低，因为失去了双螺旋结构，把黏度的改变作为ＤＮＡ变性的指标；③浮力密度升高；④生物活性丧失。ＤＮＡ变性的特点是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。通常把ＤＮＡ的双螺旋结构失去一半时的温度称为该ＤＮＡ的熔点或熔解温度，用犜ｍ表示。ＤＮＡ的犜ｍ值一般为７０～８５℃。上一页下一页返回６．５核酸的理化性质

２.核酸的复性定义：在适当条件下，变性ＤＮＡ分开的ＤＮＡ单链重新缔和为双螺旋结构的现象。３.核酸的杂交将不同来源的ＤＮＡ放在试管里，经热变性后，慢慢冷却，让其复性。若这些异源ＤＮＡ之间在某些区域有相同的序列，则复性时，会形成杂交ＤＮＡ分子。ＤＮＡ与互补的ＲＮＡ之间也可发生杂交。以Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹法为例，介绍ＤＮＡＤＮＡ的杂交：上一页下一页返回６．５核酸的理化性质

将ＤＮＡ样品经限制性内切酶降解后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离。将胶浸泡在碱（ＮａＯＨ）中使ＤＮＡ进行变性，然后将变性ＤＮＡ转移到硝酸纤维素薄膜上（硝酸纤维素薄膜只吸附变性后的ＤＮＡ），在８０℃烤４～６ｈ，使ＤＮＡ牢固地吸在纤维素薄膜上。然后与放射性同位素标记的变性后的ＤＮＡ探针进行杂交。杂交须在较高的盐浓度及适当的温度（一般６８℃）下进行数小时或数十小时，然后通过洗涤除去未杂交的标记物；将纤维素薄膜进行放射自显影。除ＤＮＡ外，ＲＮＡ也可用探针进行杂交。上一页返回6.6核酸的研究方法6.6.1核酸的分离、纯化和定量测定核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起构成复合物（ＤＮＰ、ＲＮＰ）。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子分开。在分离核酸时，应遵循两个原则：一是保证核酸一级结构的完整性，因为完整的一级结构是核酸结构和功能研究的最基本的要求；二是尽量排除其他分子的污染，保证核酸样品的纯度。核酸分离与纯化的过程一般都包括了材料的选择、核酸的释放、核酸与其他生物大分子的分离、核酸的纯化与鉴定、核酸的浓缩、保存等几个主要步骤。每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。下一页返回6.6核酸的研究方法常见的标本血液、组织及体外培养的细胞等都可作为提取核酸的原料，具体实验材料的选择应根据实验的目的来确定。核酸的释放方法有：①机械法：包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎，但机械力也可引起高相对分子质量线性分子的断裂，因而不适用于染色体ＤＮＡ的分离纯化。②化学法：在一定的ｐＨ环境下，加入表面活性剂或强离子剂使细胞裂解，蛋白质和多糖沉淀，核酸被从细胞内释放出来。向缓冲液中加入一些金属离子螯合剂抑制核酸酶的活性，保护核酸不被降解。③酶法：通过加入溶菌酶或蛋白还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。上一页下一页返回6.6核酸的研究方法溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖Ｎ-乙酰葡糖胺和Ｎ-乙酰胞壁酸残基间的β-１，４键水解。蛋白酶Ｋ能催化水解多种肽键，且在６５℃及有ＥＤＴＡ、尿素和去垢剂如０．５％ＳＤＳ存在时仍保留有酶活性，对于高相对分子质量核酸的提取有很大的优势。核酸的分离与纯化的基本方法有：①酚抽提法：细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加入等体积的酚氯仿异戊醇混合液，混匀后离心分离。疏水性的蛋白质被分配至有机相，核酸则被留于上层水相。在含核酸的水相中加入醋酸钾或醋酸钠，形成核酸盐，核酸盐可被一些有机溶剂沉淀，离心得到的核酸可以用７０％乙醇洗涤，以除去多余的盐分，即可获得一定纯度的核酸。上一页下一页返回6.6核酸的研究方法②层析法：包括吸附层析、亲和层析、离子交换层析等。因分离和纯化同步进行，并且有商品试剂盒供应而被广泛应用于核酸的纯化。在一定的离子环境下，核酸可被选择性地吸附到硅土、硅胶或玻璃表面而与其他生物分子分离。③密度梯度离心法：双链ＤＮＡ、单链ＤＮＡ、ＲＮＡ和蛋白质具有不同的密度，因而可经密度梯度离心的方法形成不同密度的纯样品区带，该法适用于大量核酸样本的制备。氯化铯溴化乙锭梯度平衡离心法是纯化大量质粒ＤＮＡ的首选方法。氯化铯是核酸密度梯度离心的标准介质，梯度液中的溴化乙锭与核酸结合，离心后形成的核酸区带经紫外灯照射产生荧光而被检测。用注射针头穿刺回收后，通过透析或乙醇沉淀除去氯化铯而获得纯化的核酸。上一页下一页返回6.6核酸的研究方法核酸纯度检测可用紫外分光光度法和荧光光度法，完整性鉴定可用凝胶电泳法。ＤＮＡ溶于ｐＨ８的ＴＥ缓冲液后在－７０℃可以储存数年。ＲＮＡ可溶于０．３ｍｏｌ／Ｌ的醋酸钠溶液或双蒸消毒水中，－７０～－８０℃保存，ＲＮＡ沉淀溶于７０％的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，可于－２０℃长期保存。6.6.2核酸的超速离心超速离心机的离心速度为每分钟６００００转或更多，离心力约为重力加速度的５０００００倍。在操作技术上，最常用的是差速离心和密度梯度离心。前者是交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。上一页下一页返回6.6核酸的研究方法欲分离沉降系数接近的物质，则广泛使用密度梯度离心法。这种方法使用一种密度能形成梯度（在离心管中，其密度从上到下连续增高）又不会使所分离的生物活性物质凝聚或失活的溶剂系统，离心后各物质颗粒能按其各自的密度平衡在相应的溶剂密度中形成区带。差速离心时，不同沉降系数的组分在不同的离心速度下沉降的速度不同，以此来分离亚细胞组分。物体围绕中心轴旋转时，会受到离心力的作用，离心力越大，被离心物质沉降得越快。应用：此法多用于分离细胞匀浆中的各种亚细胞组分，用低渗匀浆、超声破碎或研磨等方法可使细胞质膜破损，形成细胞核、线粒体、叶绿体、内质网、高尔基体、溶酶体等细胞器和细胞组分组成的混合匀浆，再通过差速离心将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开。上一页下一页返回6.6核酸的研究方法6.6.3核酸的凝胶电泳核酸分子的糖磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，会向正电极方向迁移；由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质，电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成反比。而摩擦系数是分子大小、介质黏度等的函数，因此，在一定电场强度下，在同一凝胶中分离出不同相对分子质量大小或相同相对分子质量但构型有差异的核酸分子。核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化ＤＮＡ或ＲＮＡ片段。优点是便于分离，便于检测，便于回收。相对分子质量越大，迁移率越小。相同相对分子质量的迁移率：超螺旋环状ＤＮＡ（ＳＣＤＮＡ）＞线性ＤＮＡ（ＬＤＮＡ）＞开环ＤＮＡ（ＯＣＤＮＡ）。上一页下一页返回6.6核酸的研究方法常用类型有琼脂糖（ａｇａｒｏｓｅ）凝胶电泳、聚丙烯酰胺（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）凝胶电泳等。6.6.4核酸的核苷酸序列测定２０世纪６０年代，Ｒ．Ｗ．Ｈｏｌｌｙ首先测定了酵母丙氨酸ｔＲＮＡ的序列，测定策略基本与蛋白质序列测定一样，只能测几十个核苷酸的小分子。１９８０年，英国生物化学家Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ