非高龄患者囊胚评级与染色体整倍体率相关性分析

非高龄患者囊胚评级与染色体整倍体率相关性分析[摘要]目的：分析行胚胎植入前遗传学检测的非高龄患者的囊胚染色体结果，比较不同形态参数胚胎的整倍体情况。方法：收集2018年1月至2019年7月在本中心行植入前遗传学检测患者，超促排卵后胚胎培养至囊胚阶段，激光法活检后进行第二代测序（NGS）和数据分析。囊胚形态学评价参数包括女方年龄、活检时间、囊胚分期、内细胞团和外滋养层评级等，分析胚胎的形态参数与整倍体的发生率。结果：本研究共活检402枚囊胚，成功获得396枚囊胚最终测序结果(98.51%)，其中整倍体囊胚190枚(47.98%)，多因素分析结果表明3期囊胚[OR0.64(0.44-0.92),p=0.03]和C级内细胞团[OR0.34(0.25-0.77),p=0.01]所对应囊胚非整倍体率较高。结论：4期及4期以上囊胚的整倍体率较高，C级内细胞团的囊胚整倍体率较低（22.73%），需进行染色体检测后方可移植。关键词胚胎植入前遗传学检测；囊胚形态学评级；染色体整倍体CorrelationbetweenblastocystmorphologyandchromosomalploidyrateReproductiveMedicineHospitalofTheFirstHospitalofLanzhouUniversity，KeyLaboratoryforReproductiveMedicineandEmbryoGansuProvince,Lanzhou730000,China【Abstract】Objective:Toinvestigateeuploidyofembryoswithdifferentdevelopmentalmorphologicalparametersbyanalyzingthechromosomeresultsofblastocyststhroughpre-implantationgenetictesting．Methods:Patientsfrompre-implantationgenetictestingwerecollectedfromJanuary20,2019toApril2019inourcenter.Afterovulation,theembryoswereculturedtotheblastocyststage,andthesecondgenerationsequencing(NGS)anddataanalysiswereperformedafterlaserbiopsy.Theblastocysteuploidevaluationparametersincludedthewoman'sage,biopsytime,blastocyststage,innercellgroupandectotrophoblastrating,etc.Themorphologicalparametersofembryosandtheincidenceofaneuploidywereanalyzed.Results:Inthisstudy,402blastocystswerebiopsiedand396blastocystsweresuccessfullysequenced(98.51%).Amongthem,therewere190euploidblastocysts(47.98%).Multivariateanalysisshowedsignificantdifferencesintheincidenceofeuploidyandaneuploidyinwomenwithstage3blastocystsandgradeCinnercellmass.Conclusion:Amongtheblastocystmorphologicalparameters,theblastocystwithhigherexpansionstagehadhighereuploidyrate,whiletheeuploidyrateofblastocystwithc-gradeintracellulargroupwasonly22.73%.Chromosomedetectionwasrequiredbeforetransplantation.【Keywords】preimplantationgenetictesting;morphologicalgradingofblastocysts;chromosomeploidy不孕症是一种常见的社会和医学问题，据世界卫生组织评估大约影响到至少10%～15%的育龄夫妇。自1978年第一例试管婴儿在英国诞生以来，体外受精-胚胎移植术（InVitroFertilizationandEmbryoTransfer，IVF-ET）这一技术在不孕症治疗中发挥越来越重要的作用。近年来分析发现通过试管婴儿方法获得的胚胎有35-50%存在染色体异常，且随着孕妇年龄越大，胚胎染色体异常的风险越高，现在普遍认为染色体异常是导致妊娠失败和自然流产的主要原因之一[1-3]。评估不同发育阶段不同形态学评级的囊胚染色体整倍体率，有助于我们较为全面判断不同评级囊胚的染色体整倍体规律。本研究通过分析兰州大学第一医院行PGT染色体结果，比较不同形态参数胚胎的整倍体和非整倍体率，研究胚胎发育形态学参数与整倍体的相关性。1对象与方法1.1研究对象选取2018年1月至2019年4月在兰州大学第一医院生殖医学专科医院行胚胎植入前遗传学检测（Preimplantationgenetictesting,PGT）的患者，以其胚胎整倍体率为研究对象。PGT检测在兰州大学第一医院生殖医学专科医院高通量测序中心完成，采用高通量测序技术检测。高通量测序技术（High-throughputsequencing）又称“下一代”测序技术（"Next-generation"sequencing,NGS），可一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，使得对基因组进行细致而全貌的分析成为可能。本研究获得兰州大学第一医院伦理委员会的批准，所有患者均完全知情告知并签署知情同意书。纳入标准[4,5]：①女方年龄小于35岁，行常规卵胞浆内单精子显微注射技术（Intracytoplasmicsperminjection,ICSI）助孕和植入前遗传学检测，适应症包括不明原因反复自然流产2次及以上和不明原因反复种植失败；②妊娠行为受相关法律法规保护；③签署知情同意书。排除标准：①夫妻任何一方处于乙肝、肺结核、HIV感染等感染性疾病活动期或恶性肿瘤；②夫妻任何一方使用导致生殖系统功能异常、妊娠风险增加的药物；③女方合并药物难以控制的高血压、糖尿病或其他可能由妊娠或辅助生殖治疗加重的肝肾功能异常。退出标准：①患者主动要求终止并退出研究；②任何研究者考虑可能危及受试者个人利益的情况。1.2方法1.2.1ICSI授精和囊胚培养采用常规的长方案进行促排卵，优势卵泡有2个直径达到18mm（或者有1/3卵泡达到18mm）时注射人绒毛膜促性腺激素（humanchorionicgonadotrophin,hCG）5000—10000IU，36h后行B超引导下经阴道穿刺取卵术。取卵后3-6h采用ICSI法进行卵子授精，第2天早晨观察受精情况，并将每个受精卵分别移入预平衡好的G1plus（vitrolife,瑞典瑞利芙公司）培养液微滴中，培养48小时后更换囊胚培养液，观察记录胚胎发育情况并根据囊胚形态学进行囊胚评级。囊胚评级根据Garnder囊胚分级法进行修订和细化[6,7]。先根据囊胚的扩张和孵出程度将囊胚分成1-6期，内细胞团和外胚层细胞评级根据细胞数目和紧凑程度等依次评为A，B，C三级。对于内细胞团：A级为直径在60微米以上且结合紧密，B级为直径在40微米左右，细胞结合较松散，C级为细胞数目极少或能观察到退化坏死细胞。对于滋养外胚层，A级：正面呈近似的圆形或者多边形，互相镶嵌，侧面呈聊镰刀形、新月形或者梭形，囊胚中央“赤道面的”细胞数目大于10个细胞；B级：由不多的细胞组成，结构松散；C级：由稀疏的细胞组成或者基本看不清细胞轮廓和界限。所有囊胚评级均需要两名胚胎研究员一起判定。1.2.2囊胚活检囊胚在受精后第5天或第6天活检，首先在内细胞团对侧进行透明带打孔，然后继续培养6小时左右，使囊胚腔扩张，滋养层细胞从透明带缺口处部分孵出。此时再次使用激光打断孵出的少量滋养外胚层细胞（4-8个细胞）与囊胚其他细胞的连接，小心转移样本并进行遗传分析。活检后胚胎采用玻璃化冷冻进行冷冻保存并编号。活检标准：第5天4期及4期以上囊胚，第6天3期及3期以上囊胚，除CC级囊胚外其余囊胚均进行活检。1.2.3活检细胞的扩增及检测按照QiangeneDNA提取试剂盒说明书操作提取活检细胞DNA，裂解细胞，通过预扩增和指数扩增两步法进行全基因组DNA扩增，并对扩增产物进行检测。然后酶切法对扩增后的基因组DNA进行片段化操作并纯化。1.2.4DNA文库构建室温平衡纯化磁珠，末端补平DNA片段并进行磁珠纯化，乙醇洗涤两次后连接接头，PCR扩增带有接头的DNA片段并做好标记和登记。1.2.5上机测序及分析配制测序乳液反应体系，采用NGS技术进行基因测序，对检测结果进行数据库对比分析，筛出整倍体胚胎。其中胚胎植入前染色体非整倍体检测试剂盒和测序反应通用试剂盒均购自苏州贝康医疗公司。1.3统计学方法本研究采用SPSS19.0软件包进行统计学处理，单因素分析中率的统计学检验采用χ2检验，等级资料率的检验采用秩和检验，多因素分析采用logistic回归分析法，所有检验均计算效应估计值（OR），P＜0.05标记为差异有统计学意义。2结果2.1基本临床资料本研究共活检402枚囊胚，成功获得396枚囊胚最终测序结果(98.51%)，其中整倍体囊胚190枚(47.98%)。共统计96取卵周期，女方年龄30.23±4.76岁，不孕年限3.04±2.77年，女方BMI指数21.62±3.02kg/m2，促排Gn总量2270.29±694.42IU，促排天数13.13±1.64天，促排起始剂量165.20±39.16IU，平均每周期活检囊胚4.19枚。2.2囊胚染色体整倍体率单因素分析和多因素分析396枚囊胚中整倍体囊胚190枚，总体整倍体率47.9%。囊胚整倍体评价参数包括女方年龄、活检时间、是否优质囊胚、囊胚分期、内细胞团和外滋养层评级等，比较其染色体整倍体率差异，结果见表1.总体而言活检日期[D6,OR0.71(0.57-0.88),p＜0.001]、囊胚分期[3期,OR0.64(0.44-0.92),p=0.02]和内细胞团评级[C级,OR0.54(0.39-0.74),p＜0.001]显著影响囊胚非整倍体发生率。综合以上因素进行多因素分析（表2），结果表明活检时间、3期囊胚和C级内细胞团评级在非整倍体发生率方面具有统计学差异，而外滋养层形态评级没有表现出统计学差异，具体数据见表2所示。表1囊胚染色体整倍体单因素分析囊胚总数(枚)整倍体数(枚)整倍体百分比(%)OR(95%置信区间)p值总数39619047.9女方年龄30-35岁32315848.9Reference小于30岁733243.80.90(0.77-1.83)0.56活检时间D5活检1488758.8ReferenceD6活检24810341.50.71(0.57-0.88)＜0.001囊胚分期5期543055.6Reference4期25212850.80.91(0.70-1.20)0.533期903235.60.64(0.44-0.92)0.02内细胞团评级A级704158.6ReferenceB级28213949.30.82(0.60-1.10)0.16C级441022.70.54(0.39-0.74)＜0.001外滋养层评级A级402255.00ReferenceB级23211650.000.90(0.62-1.30)0.56C级1245241.90.78(0.53-1.13)0.15表2囊胚整倍体多因素分析汇总影响参数OR(95%置信区间)p值活检时间D5活检ReferenceD6活检0.78(0.69-0.89)0.02囊胚分期5期Reference4期0.91(0.57-1.47)0.593期0.46(0.24-0.95)0.03内细胞团评级A级ReferenceB级0.75(0.41-1.40)0.37C级0.34(0.25-0.77)0.01外滋养层评级A级ReferenceB级0.88(0.39-1.97)0.77C级0.66(0.32-1.39)0.283讨论染色体异常是导致妊娠失败和自然流产的主要原因之一，因此植入前遗传学检测技术开始越来越受到重视[8]。对胚胎24条染色体拷贝数异常的分析检测已频繁用于胚胎植入前的检测，从而避免植入染色体错误的低发育潜能胚胎。多项回顾性结果表明胚胎植入前非整倍体诊断（PGT-A）能够显著改善高龄孕妇的流产率和活产率，同时大幅度降低流产率[9]，目前国际上大规模随机对照实验正在进行。自2012年全基因组外显子深度测序检测单细胞基因获得成功后，NGS技术逐步应用于植入前胚胎染色体筛查。第二代测序技术主要包括全基因组扩增、DNA文库构建、乳液PCR、微珠分选、测序芯片杂交及扫描、数据分析等操作步骤，理论上可以检出全染色体相关非整倍体以及DNA片段重复或缺失。相比较其他方法，该技术在结果准确性和所获得数据的全面性等方面具有明显优势[10]。同时我们也应该看到PGT是一种有创检测，对胚胎后续发育有一定损伤[11]，且远期损害仍不明确[12]，对于植入前遗传学筛查的广泛应用造成困难。现有初步研究针对染色体的整倍体与胚胎形态学参数相关性存在一定争论[13-15]，本研究比较不同形态参数胚胎的整倍性，研究胚胎形态学参数与整倍体的相关性。我们数据显示囊胚总体整倍体率为47.98%，其中活检日期[D6,OR0.71(0.57-0.88),p＜0.001]、囊胚分期[3期,OR0.64(0.44-0.92),p=0.02]和内细胞团评级[C级,OR0.54(0.39-0.74),p＜0.001]显著影响囊胚整倍体发生率，而外滋养层形态没有表现出统计学差异。其中D6活检囊胚整倍体率低于D5活检囊胚，与施文浩等[14]发表数据不完全一致，我们活检标准为第5天4期及4期以上囊胚，第6天3期及3期以上囊胚，活检时间该数据本质上体现了囊胚发育速度与染色体整倍体率的关系，且我们针对囊胚动态观察数据发现前两次卵裂时间和囊胚形成时间与染色体整倍体率有明确相关性（该部分数据暂未发表），基于此，初步认为活检日期可能会影响染色体整倍体率。此外，针对4AA和5AA囊胚（共计28枚）进行单独统计，其整倍体率达到89.29%（25/28），提示非高龄患者的AA级别囊胚可尝试直接移植，后续需要更大样本验证。参考文献[1]SomiglianaE,ViganòP,BenagliaL,etal.Ovarianstimulationandendometriosisprogressionorrecurrence:asystematicreview[J].ReprodBiomedOnline,2019,38(2):185-194.[2]ZhengX,LinD,ZhangY,etal.InositolsupplementimprovesclinicalpregnancyrateininfertilewomenundergoingovulationinductionforICSIorIVF-ET[J].Medicine,2017,96(49):e8842[3]AlviggiC,ConfortiA,CarboneIF,etal.Influenceofcryopreservationonperinataloutcomeafterblastocyst-vscleavage-stageembryotransfer:systematicreviewandmeta-analysis[J].UltrasoundObstetGynecol,2018,51(1):54-63.[4]徐艳文,黄国宁,孙海翔,等.高通量基因测序植入前胚胎遗传学诊断和筛查技术规范(试行)[J].生殖医学杂志,2017(05):13-20.[5]隋宜伦.植入前胚胎非整倍体筛查的临床应用研究进展[J].生殖与避孕,2015,35(2):114-120.[6]TranA,CookeS,IllingworthPJ,etal.Artificialintelligenceasanovelapproachforembryoselection[J].FertilSteril,2018,110(4):e430.[7]MannaC,NanniL,LuminiA,etal.Artificialintelligencetechniquesforembryoandoocyteclassification[J].ReprodBiomedOnline,2013,26(1):42-49[8]delReyJ,VidalF,RamírezL,etal.NovelDoubleFactorPGTstrategyanalyzingblastocyststageembryosinasingleNGSprocedure[J].PloSOne,2018,13(10):e0205692.[9]GrecoE,MinasiMG,FiorentinoF.Healthybabiesafterintrauterinetransferofmosaicaneuploidblastocysts[J].NEnglJMed,2015,373(21),2089-