分光光度法测发酵虫草菌多糖粉多糖含量

题目分光光度法测发酵虫草菌多糖粉多糖含量分光光度法测发酵虫草菌多糖粉多糖含量摘要冬虫夏草是一种中草药，传统上在中国提供宝贵的营养，并具有显着的保健和疾病预防作用。然而，由于缺乏天然虫草资源和市场尚未完善，虫草的人工发酵和栽培技术引起了人们的极大关注。在不同的发酵过程中产生的菌丝体是否具有与天然虫草相同的药理作用，也成为该领域研究的重点。本文采用蝙蝠蛾拟青霉菌粉（发酵虫草菌粉）的中间品发酵菌丝体中精提、浓缩，再经喷雾干燥制得的发酵虫草菌多糖粉作为实验材料，对发酵虫草菌多糖粉的单组分进行提取纯化，并对纯化后的组分的组成进行了初步探索，并对多糖粉的多糖含量进行了研究。关键词；分光光度法；发酵虫草菌多糖粉；多糖目录364765073_WPSOffice_Level1一、前言 32105192495_WPSOffice_Level21.1分光光度法 329695493_WPSOffice_Level21.2真菌多糖研究概况 3875944747_WPSOffice_Level21.3虫草液体发酵的研究 31002962644_WPSOffice_Level21.4液体培养基的筛选 32105192495_WPSOffice_Level1二、发酵虫草菌多糖的提取 31194012405_WPSOffice_Level22.1发酵虫草菌多糖的分离纯化 42105192495_WPSOffice_Level32.1.1沉淀法 429695493_WPSOffice_Level32.1.2除蛋白 4875944747_WPSOffice_Level32.1.3脱色素 41002962644_WPSOffice_Level32.1.4除小分子杂质 429695493_WPSOffice_Level1三、实验材料与方法 51679293267_WPSOffice_Level23.1实验材料、试剂及仪器 51194012405_WPSOffice_Level33.1.1实验材料 51679293267_WPSOffice_Level33.1.2主要实验试剂 51651849595_WPSOffice_Level33.1.3主要实验仪器 51651849595_WPSOffice_Level23.2实验方法 52115038396_WPSOffice_Level33.2.1发酵虫草菌多糖的分离纯化 5153512781_WPSOffice_Level33.2.2.1粗多糖提取工艺流程 5961450220_WPSOffice_Level33.2.2.2测定步骤 6875944747_WPSOffice_Level1四、结果与分析 71426887512_WPSOffice_Level34.1苯酸硫酸法测多糖含量 1002962644_WPSOffice_Level1结论 71194012405_WPSOffice_Level1参考文献 81679293267_WPSOffice_Level1致谢 8前言1.1分光光度法可见分光光度法是在紫外可见光区域（200-760nm）中测量材料的紫外可见光吸收光谱的方法。根据吸收光谱的性质对物质进行定性和定量分析的方法。可见分光光度法包括两种方法：紫外分光光度法和可见分光光度法。两种方法在测量，仪器操作等方面都是相同的。因此，通常使用紫外可见分光光度法。它在紫外区域（200-400nm）具有特征吸收，可用于通过紫外分光光度法进行药物分析。一些具有外观颜色或可以通过添加试剂着色的药物在可见光区域（400-760nm）具有特征吸收，并且能够进行可见分光光度法。药物分析方法，紫外-可见分光光度法在《中国药典》主要用于药物鉴定，杂质检测，含量测定，含量均匀度和溶出度测试。1.2真菌多糖植物中有大量的多糖，它是生物组织中的天然大分子化合物，由单糖分子与糖苷键结合而成，是生物的重要组成部分，具有多种生物活性。从子实体、发酵液或固体发酵菌丝如香菇、银耳、灵芝、桑黄、冬虫夏草等中提取和分离真菌多糖。它具有抗肿瘤、降低血糖、降低血脂、免疫调节、降低血压、抗辐射、抗衰老等作用[1]。由于近年来进行了许多研究，真菌多糖的分离、纯化和结构鉴定的方法正在不断改进。1.3虫草液体发酵目前，开发和应用冬虫夏草活性成分的主要方法是液体发酵。菌丝体是通过液体深层发酵产生的，因此生长迅速且发酵条件易于控制。细胞在最佳温度、pH、氧气和碳氮比的最佳条件下在反应器中生长，并及时排出呼吸产生的代谢废气。菌丝体生长迅速，可以有意获得大量次生代谢产物[2]。这不仅克服了上述缺点，而且还通过优化控制发酵过程实现并加速了生物活性物质的目标生产。更重要的是，产品质量稳定且不受原材料来源的影响。1.4液体培养基的筛选在冬虫夏草的液体发酵中，培养基的组成对发酵产物的形成有很大的影响。与其他发酵一样，冬虫夏草发酵培养基含有碳源，氮源，无机盐，生长因子和水。发酵培养基的选择不仅要考虑菌丝生长和繁殖的营养要求，而且还要考虑到原料来源丰富，价格低廉，发酵周期短，有助于产品的积累和提取。冬虫夏草具有好氧发酵的特性，发酵主要是为了获得高生物量和高含量的代谢产物-多糖，但在实际发酵过程中，这两种产品很难同时获得高产，因此必须根据实际需要。选择有利于目标产品生产的发酵条件。发酵虫草菌多糖的提取发酵虫草菌多糖提取原料一般包括发酵虫草菌子实体、固体发酵菌丝体、液体发酵菌丝体和液体发酵液。真菌多糖根据其溶解度可分为水溶性多糖和水不溶性多糖，水不溶性多糖包括可溶于酸的多糖和不溶性多糖。为了提取发酵虫草菌多糖，必须根据多糖的原料和性质选择不同的方法。从发酵虫草菌子实体中提取多糖通常需要研磨和提取。为了从液体发酵产物中提取细胞内多糖，需要离心提取菌丝体，直接采取滤液并浓缩以乙醇沉淀。提取霉菌多糖时，可以根据相似相容性原理选择合适的提取液。热水提取可用于提取水溶性多糖。水不溶性多糖可以用酸或碱例如稀盐酸、三氯乙酸和氢氧化钠的溶液提取。浸出后，提取液通常用乙醇沉淀，将粗多糖沉淀，然后用丙酮或乙醚和低分子量物质（如单糖、寡糖、短肽、氨基酸、无机盐）洗涤。最后，将获得的产物冷冻干燥以除去水，从而获得粗制多糖产物。在发酵虫草菌多糖的提取过程中，许多因素影响提取效率，例如提取所用溶剂的类型，液质比，提取温度和提取时间。请勿使用更多酸性溶液作为萃取溶剂，因为较低的值会破坏大分子多糖的糖苷键并将其分解为单糖。据报道，多糖的提取方法影响其结构，如果采用不同的提取方法从同一原料中提取多糖，则所得多糖的结构也不同。当使用相同的提取方法从不同组织部位提取多糖时，所得多糖的结构也不同。2.1发酵虫草菌多糖的分离纯化由于提取的粗制真菌多糖通常包含几种多糖成分和杂质，因此多糖的分离和纯化是先除去这些杂质，然后使用适当的方法分离几种成分以获得单一的活性多糖成分。纯化通常是从粗多糖中去除蛋白质和其他小分子杂质，然后使用柱色谱进行分离。2.1.1沉淀法氯化法使用NaCl、KCl、季铵盐沉淀法使用阳离子去污剂。阳离子去污剂（如头孢啶）可与酸性多糖阴离子形成水不溶性沉淀，从而形成粗多糖溶液。酸性多糖和中性多糖被分离。金属络合物法通常使用氯化铜、氢氧化铁、醋酸铅、Pelling试剂等络合剂进行络合反应，可以向溶液中添加过量的金属盐。试剂沉降后，可使用酸性酒精溶液或螯合剂回收沉淀。2.1.2除蛋白用水或其他溶液提取的粗多糖通常含有蛋白质，并且文献报道，去除蛋白质后，粗多糖的生理活性将得到显着改善。在实验室中，通常使用三氯乙酸法，Sevage法和酶法从粗多糖中去除蛋白质。其中三氯乙酸法的多糖损失率高，并且可能破坏糖链结构。酶水解法具有特异性；Sevage法是最常用的经典方法，其中Sevag方法脱蛋白效果较好，它是用氯仿：戊醇或丁醇，以4：1比例混合，加到样品中振摇，使样品中的蛋白质变性成不溶状态，用离心法除去，但是Sevage法也有一些缺点，这些缺点在实验过程中会被消除，大量有机溶剂、长流程和高多糖损失。据文献报道，使用阴离子交换树脂从多糖中去除蛋白质产生了良好的结果。2.1.3脱色素来源于子实体或真菌菌丝体的多糖通常含有色素。通常，通过吸附、离子交换、氧化和其他方法除去颜料。其中，最常用的漂白方法是使用DEAE-纤维素柱进行漂白。在通过DEAE-纤维素色谱法使样品脱色之后，不仅可以使样品中包含的各种成分的多糖脱色，而且可以将其分离。2.1.4除小分子杂质去除蛋白质和漂白后，多糖可能含有小分子杂质，例如盐和寡糖。透析是去除这些低分子量杂质的最常用方法。透析期间，选择合适规格的半透膜非常重要，以避免样品损失。由合适的半透膜制成的透析袋不会通过大的生物分子，而是通过小分子，例如无机盐。长期静态透析和流水透析可以去除样品中的小分子杂质。三、实验材料与方法3.1实验材料、试剂及仪器3.1.1实验材料发酵虫草菌多糖粉：由某生产厂家提供。3.1.2主要实验试剂本方法所用试剂除特殊注明外，均为分析纯；所用水为去离子水或同等纯化水。（1）无水葡萄糖对照品；（2）6%苯酚溶液；（3）硫酸；（4）0.1%十二烷基磺酸钠溶液。3.1.3主要实验仪器（1）752型紫外分光光度计；上海光谱仪器有限公司（2）离心机（3500r/min）；上海手术器械厂（3）万分之一电子天平；梅特勒托利（4）圆底烧瓶；天玻仪器厂（5）铁架台；盐城新明特玻璃仪器厂（6）电炉；上海尚仪（7）蛇形冷凝管；蜀牛玻仪厂（8）刻度吸管；蜀牛玻仪厂（9）容量瓶；蜀牛玻仪厂（10）冰箱；美的（11）数显恒温水浴锅；金坛实验仪器厂3.2实验方法3.2.1发酵虫草菌多糖的分离纯化以蝙蝠蛾拟青霉菌粉（发酵虫草菌粉）中间品发酵菌丝体为原料，经精提、浓缩，喷雾干燥等工艺制成的发酵虫草菌多糖粉，该产品作为食品原料。3.2.2.1粗多糖提取工艺流程实验比对标准：多糖的测定（以无水葡萄糖（C6H12O6计）含量测定；原料准备—加热—回流—乙醇沉淀—溶解原理：样品经加热、回流处理后，用乙醇沉淀，沉淀的多糖水溶液溶解后用苯酚-硫酸反应以碳水化合物形式比色测定其吸收度，其吸收强度与多糖中葡糖糖的含量成正比，以此计算多糖的含量。3.2.2.2测定步骤（1）对照品的制备取无水葡萄糖对照品，精密称定，加水制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。（2）标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml分别置试管中，加水至2.0ml，再加6%苯酚溶液1.0ml，混匀，迅速加入浓硫酸5ml，摇匀，置沸水浴中加热15min，立即冷却，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法（2005年版药典一部附录VA）试验，在490nm测定吸光度值。以吸光度值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。（3）样品的测定：取样品1g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入0.1%十二烷基磺酸钠溶液30ml，精密称定，加热回流2h，立即冷却，再称定重量，以水补足减失的重量，摇匀，立即离心（3500转/min），精密量取上清液10ml，加乙醇30ml，摇匀，冷藏24h，离心，弃去上清液，沉淀用少量的乙醇洗涤，弃去洗涤液，加水适量使溶解，转移至100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取2ml，置试管中，自“加6%苯酚溶液1.0ml”起，依法测定吸光度。从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的量，计算即得。本方法依据中华人民共和国药典2005年版一部P397页乌灵菌粉的多糖测定方法。四、结果与分析4.1苯酚硫酸法测多糖含量以490nm处吸光度值为纵坐标，葡萄糖质量数为横坐标，绘制标准曲线。见图，并计算回归方程为Y=0.6325X-0.0014,R=0.9929，式中:X是490nm处的吸光度值，Y-葡萄糖质量数(mg),由该回归方程式可计算出实验中虫草多糖的含量。结论根据实验，通过水提取和醇沉淀提取的粗多糖通过浓缩被水解为单糖，并迅速脱水为醛衍生物。这些糖醛衍生物和酚缩合形成有色化合物，并且可以在合适的波长下用分光光度法测量多糖含量。该方法简单，显色稳定，灵敏度高，重现性好。参考文献1.常花蕾.金针菇多糖的免疫调节作用、抗肿瘤作用及其机制研究[D].广州:南方医科大学，20192.陈露、虫草多糖的免疫调节作用及其抗肿瘤活性的研究[D].山东:山东师范大学，20193.程宏霞，田红伟，展筱林，冬虫夏草药理作用研究进展[J]，中医药导报，2015，11(10):86-884.付辰炜，刘万顺，韩宝芹.氨基葡萄糖对小鼠免疫功能的影响[J].营养学报2017，29(1):51-575.范卫强，尹鸿萍，周长林.虫草多糖的分离、纯化和初步药效活性研究[J].生物加工过程，2018，6(1):69-736.高巍，胡人杰。生物多糖非免疫活性的抗癌作用机制[J].天津药学，2015,17(5):42-457.恭敏，朱勤，王彤。冬虫夏草多糖的分子结构与免疫活性[J].生物化学杂志，2017,6(6):486-4918.龚晓健，季晖，卢顺高等，人工虫草多糖对小鼠免疫功能的影响[J].