富含二硫键多肽的重组表达研究进展

富含二硫键多肽的重组表达研究进展RESEARCHONTHERECOMBINANTEXPRESSIONOFPEPTIDESWITHMULTIPLEDISULFIDEBONDS目录摘要……………………1关键词…………………11前言……………………12真核表达系统…………22.1酵母表达系统………………………22.2昆虫细胞表达系统…………………32.3哺乳动物细胞表达系统……………32.4植物细胞表达系统…………………42.5动物表达体系………………………43原核表达系统…………43.1大肠杆菌表达系统…………………43.2芽孢杆菌表达系统…………………53.3乳酸球菌表达系统…………………64富含二硫键多肽的分离与纯化………65小结……………………6参考文献………………6致谢……………………9

富含二硫键多肽的重组表达研究进展摘要：二硫键是一种共价键，起着稳定肽链空间结构的作用。对于提高蛋白质稳定性而言，增加二硫键是用于提高热稳定性的方法之一。动物多肽毒素是一类富含二硫键的多肽，广泛分布于一些有毒的动物当中，有着多种生物学活性，如抗镇痛等等。因此针对富含二硫键多肽毒素的表达的研究进展,对于天然动物毒素多肽的功能认识和药用研究具有重要意义。本文就富含二硫键多肽的重组表达的研究进展作一综述。关键词：二硫键；多肽；大肠杆菌；重组表达ResearchontheRecombinantExpressionofPeptideswithMultipleDisulfideBondsAbstract:Thedisulfidebondisacovalentbondthatplaysaroleinstabilizingthespatialstructureofthepeptidechain.Forimprovingproteinstability,increasingdisulfidebondsisoneofthemethodsusedtoimprovethermalstability.Animalpeptidetoxinsareaclassofpeptidesrichindisulfidebonds,widelydistributedinsometoxicanimals,andhaveavarietyofbiologicalactivities,suchasanti-analgesicandsoon.Therefore,theresearchprogressontheexpressionofdisulfidebond-richpolypeptidetoxinsisofgreatsignificanceforthefunctionalunderstandingandmedicinalresearchofnaturalanimaltoxinpolypeptides.Thisarticlereviewstheresearchprogressofrecombinantexpressionofdisulfidebond-richpolypeptides.Keywords:disulfidebonds;peptides;Ecoli;recombinantexpression1前言多肽在我们的生活一直扮演着极其重要、不可或缺的角色，部分生物毒素多肽已被证实具有极其广阔应用前景的生物学活性，如抗心血管疾病、抗癫痫、抗肿瘤等等[1]。广泛分布于蜘蛛、蜈蚣、海葵等有毒的动物当中[2-4]。芋螺毒素能特异作用于动物细胞膜上Na+、Ca2+、Ka+等离子通道和烟碱型乙酰胆碱受体，在帕金森病、成瘾、疼痛等疾病方面有着很好的前景和研究价值[5-7]。因此蛋白多肽类药物一直被广为研究，作为部分疾病，如癌症、自身免疫相关的疾病等的治疗手段[8]。二硫键在许多多肽类药物中都有发现存在，增加二硫键是用于提高多肽的热稳定性的方法之一[9]二硫键的存在对于决定多肽的生物活性和维持其空间构象有着重要作用，二硫键的正确形成是其发挥生物学功能的前提[10]如提高多肽与靶分子结合的特异性等。针对富含二硫键的药用多肽进行研究，对了解这些多肽内二硫键的作用和改变其药性都有着长远意义[11]。富含二硫键的多肽毒素二硫键密集（大多数含有2~5对二硫键），常见的多肽毒素其分子量小，体外折叠效率较低。一般来说，用化学合成的方法较难实现获得多于40个氨基酸的多肽毒素的高产率，因为化学合成中二硫键的形成是一难点。目前对于序列比较长的多肽毒素一般采用基因表达的方式制备，在多种表达体系中大肠杆菌表达体系和酵母表达体系最为常见。由于多肽类药物具有靶向性强、活性高、合成效率高、在体内易于代谢等特点，受到了制药领域的广泛关注。其中毒素多肽是一类具有特殊功能的富含二硫键的多肽，它的作用机理是通过与细胞的特定受体蛋白（如通道蛋白）相互结合进而发挥作用。富含二硫键的毒素多肽被发现具有潜在的生物学活性，针对其研究，有助于了解天然多肽资源的多样性。如芋螺多肽MVIIA已用于癫痫和慢性及急性疼痛。而蝎子毒素，其通常含有3至4对二硫键，部分的蝎子毒素已被发现具有治疗精神障碍、抗癫痫、抗心血管疾病、痉挛等多种药用价值。长度不同的蝎子毒素作用机制也有所不同，如短链的蝎子毒素作用于Ca2+、Cl-或K+通道，而长链的蝎子多肽毒素则主要作用在于Na+通道[12-14]。蜘蛛毒素多肽一般含有3至5对二硫键，也同样可以作用于Ca2+、Cl-、Na+和K+通道，并能刺激递质释放或阻断突触前胆碱受体等。蝎子毒素多肽及蜘蛛毒素多肽已经在抗癌、肿瘤治疗、镇痛等方面显现了广阔的发展需求和发展前景。不仅如此，富含二硫键的多肽结构稳定性良好，靶点特异性强，抗酶解能力强，具有潜在的开发价值[15]。然而，对于会在翻译后形成二硫键的目标蛋白，其重组表达并且拥有高产率就显得极为困难。因此富含二硫键多肽的表达备受关注。2真核表达系统2.1酵母表达系统酵母菌(saccharomyce)是一种基因克隆实验中常见的真核生物受体细胞。由于酵母宿主细胞结合了细菌和高阶生物宿主细胞表达系统的优良特性，当外源蛋白未能成功地在大肠杆菌中表达时，酵母表达系统往往是不错的选择。然而，酵母表达系统也有着明显的问题，其生长周期较长，易染菌以及分泌的多肽在培养基中容易被蛋白酶降解等。用于表达的酵母菌株包括酿酒酵母（Schizosaccharomycespombe）、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、毕赤酵母(Pichiapastoris)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)[16]。Hepcidin是一种鱼类抗菌肽，它来源于斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)和尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)，是一种碱性小分子肽，在各物种间具有较高的结构保守性，由信号肽、前导肽和成熟肽这三部分构成,尤其是在成熟肽区域含有8个半胱氨酸残基,以致在空间上可形成4个二硫键,这与其结构稳定和生物活性有着密切关系。李文婧[17]等通过SOE-PCR将两个不同来源的Hepcidin的cDNA基因进行串联，选择pPIC9K真核表达载体构建重组表达载体，在毕赤酵母GS115中成功诱导表达。蒋立平[18]等通过随机测序虎纹捕鸟蛛(Ornithoctonushuwena)毒腺cDNA文库,获得编码多肽毒素HWTX-XVIIa的基因,对其进行生物信息学分析,构建HWTX-XVIIa基因真核表达质粒,成功利用S78株酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)进行表达。2.2昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统是目前一种通用性广真核表达系统，其能表达来自真菌、植物和动物几乎所有蛋白。依托杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子而构建的表达载体,使很多真核目的基因得到表达，但由于其本身是一个蛋白裂解型性系统，所以裂解细胞前要加入蛋白酶抑制剂防止蛋白被降解。大多数的昆虫细胞表达系统都是将外源基因通过杆状病毒载体转染宿主细胞,含有目标基因的标记盒通过同源重组并入宿主基因组中[16]。陈风晔[19]等成功构建pFastBac-PRF-6xHis重组质粒，转化入含有杆状病毒质粒bacmid的DH10α-Bac感受态细胞中，并最后成功在Sf9昆虫细胞中表达出穿孔素。付月君[20]等将BmKIT基因插入到苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)基因组中,形成重组杆状病毒AcMNPV-BmKIT。发现AcMNPV介导的重组杆状病毒表达兴奋性昆虫毒素BmKIT可以促进Sf9细胞凋亡,增强其杀虫效应。2.3哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达往往可以提供多种复杂的翻译后加工功能，与原核及其他真核表达系统相比，哺乳动物细胞表达系统具有以下优势:1、表达水平高，且稳定。2、能实现翻译后的正确修饰以及折叠。3、生产过程无内毒素污染[21]。常用于表达的哺乳动物细胞系包括海拉(Hela)细胞、小鼠骨髓淋巴瘤细胞(NS0和Sp2/0-Ag14)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和人胚肾细胞(HEK293)。郭延松[22]成功克隆并在Cos-7细胞中表达了有活性的抗血小板多肽。2.4植物表达体系植物细胞表达体系已逐渐开始获得关注，比如利用烟草作为宿主细胞可以生产出同位素标记的外源蛋白，不仅如此，目前植物叶绿体的表达系统也正在成为研究热点，高等植物叶绿体由于其结构和遗传上的特殊性使得它在重组多肽表达方面具有显著优势，外源基因表达量高、基因转化容易、生产成本较低等等特点使植物表达体系都在备受关注与发展。2.5动物表达体系通过奶或者蛋的生产来表达，如徐晟[23]等通过扩增及双酶切乳腺特异性表达载体获得目的基因片段（zpz-Ⅰ），再将其注射入雌性奶山羊胎儿成纤维细胞，通过核移植、电融合等技术获得重构胚并移植入受体等待分娩，检测发现羊乳清中含有重组人乳铁蛋白（RecombinentHumanLactoferrin,rhLF）。3原核表达系统3.1大肠杆菌表达系统相较于哺乳动物细胞表达系统和酵母表达系统等等，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、能在廉价培养基中高密度培养、遗传操作简便、成本低、表达量高等特点。围绕大肠杆菌，许多技术都相应飞速发展，如菌株改造、载体构建、诱导表达和蛋白纯化等[5.16.24]。常用的大肠杆菌表达菌株有SHuffleTM菌株（适合表达富含二硫键的多肽）、BL21（DE3）菌株（适合表达非毒性的蛋白）、BL21（DE3）pLysS菌株（其含有表达T7溶菌酶的基因，不会干扰目标蛋白的表达，适合表达毒性或费毒性蛋白）等[25]。但大肠杆菌表达也有着一些缺点如外源多肽在大肠杆菌表达中往往处于还原性环境的胞质中，故在胞质中外源多肽不易形成折叠，容易形成不可溶的包涵体以及表达易泄露等。对于提高大肠杆菌重组多肽的可溶性，有许多研究者提供了很多方法。比如，可以选择适当的载体和宿主进行有效改造和组合，例如陈阿娜[26]等学者就有对pAVEwayTM质粒进行启动子替换和操纵子双回文结构改造，使得大肠杆菌在表达人源化治疗性抗体片段时表达量能显著提高。由于发现Origami菌株字胞质中缺乏二硫键异构酶，使得重组多肽不能正确识别并校正错配的二硫键，LobsteinJ[27]等在Shuffle菌株的染色质中整合了大肠杆菌二硫键异构酶DsbC基因，并于该大肠杆菌的胞质中表达了有活性的DsbC蛋白，根据其研究成果表明，该方法可有效校正错误配对的二硫键。还可以通过减缓重组多肽表达速率来增加可溶性多肽的比例，如采用中等或低等强度的启动子（如lac等）来替代T7等强启动子，帮助多肽的可溶性表达[28]，以及利用低温来降低大肠杆菌的代谢速率，一般其诱导温度都位于30℃以下。如曹顺[29]等通过实验比较发现25℃为大肠杆菌高效表达重组HLIF蛋白的最优温度，还可以通过调整IPTG浓度来提高重组多肽的可溶性，刘云海[30]等通过改变发酵条件，获得了重组芋螺毒素His-Xa-MrVIB表达的最佳IPTG浓度为0.4mmol/L。还可以与其他辅助蛋白共表达来提高重组多肽的可溶性表达，以及引导二硫键的正确形成。因为大肠杆菌中辅助折叠的因子无法保证重组多肽的正确表达，因而配合其他辅助蛋白，如二硫键异构酶等，与重组多肽共表达，可以提高重组多肽的表达产量，为二硫键正确形成提供充足的保障。如刘志刚[31]等学者发现共表达硫氧还蛋白(TrxA)和二硫键异构酶(DsbC)两种分子时，单链抗体-低分子量尿激酶融合蛋白（C6-UK）在大肠杆菌中完全以可溶形式表达。利用融合标签也可辅助重组多肽的可溶性表达，融合标签一般易于纯化和表达，其N-末端或者C-末端连接靶蛋白，常见的一些融合标签有GST、His、NusA、MBP、Trx等，邵婕[32]等以MBP为纯化标签和融合伴侣，将其与大肠杆菌表达载体pMAL-p2x相融合，构建了重组表达质粒pMAL-jz51以及pMAL-jz26，并在BL21(DE3)以及TB1中对两个重组表达质粒分别进行IPTG诱导表达，并最终获得大量目标多肽。并且MBP不含半胱氨酸，使其避免与目标蛋白的半胱氨酸形成不正确的二硫键的可能。除去以上这些方法，利用分子伴侣也可辅助重组多肽的表达。富含二硫键的重组多肽的表达有胞质表达和周质表达，针对不同的表达方式，其分子伴侣也不同。胞质表达中有关折叠的分子伴侣有触发因子(triggerfactor,TF)、DnaK-DnaJ-GrpE和GroEL-GroES。大肠杆菌的胞质维持着还原性环境，这导致多肽的二硫键无法稳定存在。如Kryatsous[33]等设计GroEL与DnaK的融合载体，在大肠杆菌中表达出了可溶性的鼠类朊蛋白。对于富含二硫键的多肽，周质表达一般作为首选。细胞周质的分子伴侣包括DegP、FkpA、Skp、SurA等。FkpA是一类折叠增强子，具备了肽基脯酰胺顺反异构酶和分子伴侣的活性。另外当共表达周质分子伴侣时，可以减少多肽分泌后的聚集，使得最后的表达量可以增加甚至10倍[34]。细胞周质相较于细胞质有着独特的氧化环境，这使得二硫键等可以稳定存在，富含二硫键的多肽也可表达。但由于其分泌的不可控性以及分泌多肽活性的不确定，使得活性多肽产量出现问题。不过一些实验表明可以通过部分分子伴侣的协助下，使得蛋白质折叠效率增加，从而提高分泌多肽的活性产率。3.2芽孢杆菌表达系统芽孢杆菌表达系统的优点就在于前二者的次级代谢产物无法用于食品行业，而枯草芽孢杆菌对农作物安全，培养便捷，生长速度快等各种优点，是食品级安全微生物，不仅如此，枯草芽孢杆菌还是一种可以分泌胞外酶的菌株。田艳杰等利用枯草芽孢杆菌WB600为宿主菌，将木聚糖酶基因xynZF-318与高表达载体pWB980相连，在通过电击转化到枯草芽孢杆菌WB600中，获得了木聚糖酶的重组工程菌[35]。3.3乳酸球菌表达系统乳酸菌膜单一，为革兰氏阳性菌。赵翠[36]等提取了幽门螺旋杆菌基因组DNA并特异性扩增黏附素基因以及细胞毒素相关基因，构建出原核表达载体PNZ8149-hpaA-cagA，电击转化到乳酸球菌NZ3900，成功获得以乳酸球菌为疫苗载体的原核表达系统NZ3900/PNZ8149-hpaA-cagA。4富含二硫键多肽的分离与纯化富含二硫键的多肽，如部分毒素多肽，其分离纯化的一般过程是通过高速离心分离出培养液中表达毒素的部分，再根据表达多肽的性质选择凝胶柱、层析或离子交换分离目标肽，过柱纯化后再浓缩，若是带有分离标签的重组毒素，则是先采用亲和层析分离融合蛋白，再利用酶切法或者化学法切除融合标签再通过RP-HPLC进行最终分离纯化[37]。最常用的融合标签6×His就是通过镍柱来亲和纯化。其中一种镍柱材质是琼脂糖微球体，微球体与Ni2+可在琼脂糖螯合介质的作用下发生螯合，螯合后的Ni2+能与His上的咪唑环发生特殊的相互作用，从而实现蛋白质的纯化。5小结富含二硫键的多肽在农业和医药行业等都有着巨大的发展前景，作为药物，其靶向性高，在体内易于代谢，毒副作用低等等，生产制备上，多肽药物接近小分子化学药物，具有纯度高、质量可控且结构容易确定等特点，所以已广泛应用于心血管疾病、抗肿瘤、糖尿病、艾滋病等疾病的预防、诊断和治疗，被认为是具有高选择性、有效且相对安全的潜在疗法。一般来说获取富含二硫键的多肽多为三种途径，化学合成，直接提取和异源表达。直接提取的动物养殖成本高，且因为动物体内多肽种类复杂，针对目标多肽的纯化将会变得尤为困难。化学合成的技术日趋成熟，其纯化后的纯度可大于95%以上，但于溶液中如何正确形成二硫键，以及产量低下、花费昂贵的问题难以解决。而通过重组表达制备多肽，其成本低，周期短，产率高。所以针对重组表达制备多肽的研究具有长远的生物学意义。而针对富含二硫键，其所想要表达的多肽的性质的分析、采用何种辅助表达方式、表达水平、实验所用时间、实验成本等等有诸多因素需要考虑其中，表达产生的多肽的可溶性以及其二硫键是否能形成以及其稳定性，是否错配也都是难点。参考文献[1]张科军,李力,戴秋云.富含二硫键多肽毒素的表达与纯化[J].中国生物工程杂志,2013,33(11):106-111.[2]DiochotS,BaronA,SalinasM,etal.Blackmambavenompeptidestargetacid-sensingionchannelstoabolishpain[J].Nature,2012,490(7421):552-555.[3]Primon-BarrosM,JoseMacedoA.Animalvenompeptides:potentialfornewantimicrobialagents[J].CurrTopMedChem,2017,17(10):1119-1156.[4]Lewis

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