人教版高二下学期生物选择性必修3《生物技术与工程》全册知识点复习提纲

纲 (1)概念：指人们利用微生物.在适宜的条件下.将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。(2)原因：不同的微生物具有产生不同代谢物的能力。(3)实质：微生物在有氧或无氧条件下的细胞呼吸，是一个物质氧化分解的过程。不属于，使用前一次发酵保存下来的面团进行的才算；例如直接利用空气中毛酵技术，若直接接种毛霉，则不属于。(2)特点：以混合菌种的固体发酵及半固体发酵为主，通常是家庭式或作坊式的。主要食品有腐乳、酱、酱油、①优点：操作简单.传承文化：②缺点：生产条件不易控制.容易受杂菌污染.生产效率低。①参与腐乳发酵的微生物有酵母、曲霉和毛霉等，其中起主要作用的微生物是毛霉。毛霉代谢类型：异养需氧型生物分类：真菌(真核生物)适宜温度：15—18℃②发酵原理：经过微生物的发酵，豆腐中的蛋白质被分解成小分子的肽和氨基酸，味道鲜美，易于消化吸收，便 1.菌种：乳酸菌。分类：细菌(原核生物)发酵温度：室温。①代谢特点：厌氧细菌，代谢类型为异养厌氧型。②乳酸发酵的生产应用：乳制品的发酵、泡菜的腌制等。④常见类型是乳酸链球菌和乳酸杆菌。2.发酵原理：(1)利用植物体表面天然的乳酸菌来进行发酵；(2)发酵期间，乳酸会不断积累，当它的质量百分比为0.4%-0.8%时，泡菜的口味、品质最佳。(2)蔬菜装坛：将新鲜蔬菜洗净，切成块状或条状，混合均匀，晾干后装坛，装至半坛时，放入调味品(如蒜瓣、生姜及其他香辛料),继续装至八成满。(3)加盐水：将冷却好的盐水缓缓倒入坛中，使盐水没过全部菜料。(4)封坛发酵：盖好坛盖，向坛盖边沿的水槽中注满水，发酵过程中注意补充水，根据室内温度控制发酵时(2)盐水浓度为质量百分比为5%-20%。盐水浓度要适宜的原因：过高，乳酸发酵将受抑制；过低，杂菌易繁殖，导致泡菜变质。(3)盐水煮沸的目的：杀菌和除去氧气。(4)盐水冷却后使用的目的：为了保证乳酸菌的生命活动不受影响。(5)泡菜坛子使用之前要检查密封性的目的：给泡菜坛内创造无氧环境，严格控制厌氧条件。第2页共53页(6)用水密封泡菜坛的目的(水槽中注满水的原因):给泡菜坛内创造无氧环境，严格控制厌氧条件。(7)装至半坛放入香料的原因：防止注入盐水后调料上浮，目的使泡菜风味均匀。泡菜坛只能装八成满原因：太满发酵液会溢出；使盐水不容易完全(8)泡菜制作过程中，是否只有乳酸菌起作用?不是，还有一些酵母菌和大肠杆菌。(9)蔬菜应新鲜的原因：新鲜蔬菜中的亚硝酸盐含量低。(10)为什么含有抗生素的牛奶不易发酵为酸奶?牛奶发酵为酸奶主要依靠乳酸菌的作用，而抗生素能够杀死或抑制乳酸菌。(11)为什么乳酸菌会逐渐成为优势菌种：乳酸菌比其他种类微生物更耐酸；发酵中期pH下降，导致其他种类的微生物的生命活动受到抑制。(12)跟踪检测泡菜制作过程中亚硝酸盐含量变化的原因：为了把握取食泡菜的最佳时机。(13)泡菜制作过程中乳酸菌数量、乳酸含量和亚硝酸盐含量的变化发酵时期初期少(氧气抑制乳酸菌活动)少增加(硝酸盐还原菌的作用)中期最多(乳酸积累，抑制杂菌活动)分解)后期抑制自身活动)继续增多，pH继续下降，直至稳定下降至相对稳定(硝酸盐还原菌被完全抑制)曲线亚硝酸盐含量亚硝酸盐含量发发酵发酵发酵时期发酵发酵发酵发酵时期发酵时间某同学在制作泡菜前，查阅资料得知，可以向泡菜坛中加人一些“陈泡菜水”;在用质量百分比为5%的食盐水(1)泡菜制作过程中影响亚硝酸盐含量的因素有哪些?腌制方法、腌制时间长短、温度高低。(2)据图分析，从亚硝酸盐的含量来看，你认为该泡菜在什么时间食用比较合适?为什么?应该在11天后食用比较合适；因为这时亚硝酸盐含量已经降到较低的水平。(3)他第一次制作出的泡菜“咸而不酸”,造成这个结果最可能的原因是什么?可能是食盐浓度过高，抑制乳酸菌生长，产生乳酸较少。(4)加入“陈泡菜水”的目的是什么? “陈泡菜水”中含有较多的乳酸菌，加入“陈泡菜水”相当于接种乳酸菌。三、果酒和果醋的制作(1)酒精发酵菌种：酵母菌来源：附着在果皮上的野生型酵母菌①代谢特点：单细胞真菌，异养兼性厌氧微生物，在无氧条件下能进行酒精发酵，能以多种糖类作为营养物②发酵原理(反应简式)为(酒精)+2CO₂+能量。温度是影响酵母菌生长的重要因素；酿酒酵母的最适生长温度约为28℃。(2)醋酸发酵菌种：醋酸菌来源：空气中的醋酸菌量。②最适生长温度为30～35℃。(3)菌种的比较比较项目生物分类代谢类型菌种来源酵母菌真菌(真核生物)异养兼性厌氧型果醋制作醋酸菌细菌(原核生物)空气中的醋酸菌或人工接种(4)制作原理与发酵条件的比较发酵原理温度氧气需求果酒制作①有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大发酵温度为18—30℃,酿酒酵母最适生长温度约为28℃果醋制作①氧气、糖源充足时，醋酸菌将葡萄汁中的葡萄糖分解②缺少糖源，氧气充足时，醋酸菌直接将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变为乙酸：量最适生长温度为30—35℃需要充足的氧气①酵母菌的繁殖需大量能量，而发酵过程进行无氧呼吸，故果酒制作的前期应通入空气，而后期应保证严格的厌氧环境。②果醋制作过程中要求始终通氧，缺氧时醋酸菌的生长、增殖都会受到影响，另外，醋酸的生成2.制作流程挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵→果酒(→醋酸发酵→果醋)(1)对发酵瓶、榨汁机等器具进行清洗并用体积分数为70%的酒精擦拭消毒，晾干备用。(70%的酒精消毒的目(2)取新鲜葡萄，用清水冲洗葡萄1～2遍除去污物，注意不要反复多次冲洗。(冲洗的目的：去除表面灰尘、污物。不能反复多次冲洗的目的：防止果皮表面的菌种流失。)去除枝梗和腐烂的籽粒。(应该先冲洗，(3)用榨汁机榨取葡萄汁后，将其装入发酵瓶中，盖好瓶盖。(留1/3空间的目的：①留一定的空气，让酵母菌(4)将发酵瓶置于18～30℃的温度下发酵。在发酵过程中，每隔12h左右将瓶盖拧松1次(注意：不是打开瓶盖),进行排气。(5)10～12d以后，可以开始进行取样检验工作。例如，可以检验酒味、酒精的含量、进行酵母菌的镜检等工(6)当果酒制成以后，将瓶盖打开，在瓶口盖上一层纱布，进行葡萄醋的发酵。温度为30～35℃,时间7~酿果醋打开瓶盖的目的：为了提供有氧环境。酿果醋产生白膜：醋酸菌繁殖生成。拧松：排出CO₂,防止爆裂。不完全打开瓶盖：防止杂菌污染。酒精发酵旺盛时，醋酸菌不能发酵产生醋酸，原因是：醋酸菌的发酵需要充足的O₂,而酒精发酵时的缺氧环境能①葡萄酒呈现深红色的原因是红葡萄皮的色素进入发酵液。②为提高果酒的品质，并能更好地抑制其他微生物的生长，一般工厂生产时采取的措施是直接第4页共53页③检测果汁发酵后是否有酒精产生，通常用重铬酸钾来检验。在酸性条件下，发酵液呈现灰绿色。④结合果酒、果醋的制作原理，请分析此装置中：充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；排气口是在酒精发酵时用来排出CO₂的；出料口是用来取样的。排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接，其目的是既能排出CO₂,又能防止空气中微生物的污染。使用该装置制酒时，应该关闭充气口;制醋时，应将充气口连接气泵，输入空气。【合作探究】1.在果酒和果醋制作中，你认为哪些方法可防止发酵液被污染?(1)冲洗葡萄时应先冲洗再除去枝梗。(2)榨汁机要冲洗干净并晾干。(3)发酵瓶要清洗干净，并用70%的酒精消毒。(4)排气时只需拧松瓶盖，不要完全揭开瓶盖，防止杂菌污染。2.果酒制作过程中，在不灭菌的情况下，酵母菌是如何成为优势菌种的?发酵后期在缺氧和酸性发酵液中，绝大多数微生物的生命活动受到抑制，而酵母菌可以适应这一环境成为优势菌种。四、几种传统发酵技术微生物代谢特点主要菌种生物类型代谢类型适宜温度发酵对氧的需求腐乳的制作真核生物异养需氧型前期毛霉发酵需氧，后期密封发酵不需氧泡菜的制作乳酸菌原核生物异养厌氧型果酒的制作酵母菌真核生物异养兼性厌氧型前期需氧，后期不需氧果醋的制作醋酸菌原核生物异养需氧型一直需氧 ;如果是用紫色葡萄制作葡萄酒，随着发酵时间的延长，由果皮进入发酵液的会越来越因而发酵液的颜色会逐渐加深变成深红色。果醋发酵过程中一般不会出现气泡，发酵完成时，在发酵液的液面上出现一层菌膜，这是膜。酵母菌发酵产生CO₂花青素醋酸菌小结：1.泡菜腌制过程中，乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐相对含量(或数量)的变化后期发酵时间下降至相对稳定—亚硝酸盐2.果酒、果醋制作结果的评价标准(1)果酒制作的结果评价发酵后取样，可通过嗅味和品尝进行初步鉴定。此外，还可用显微镜观察酵母菌，也可用酸性重铬酸钾与酒精反应呈现灰绿色来检验酒精。制作成功的葡萄酒应色泽鲜艳、爽口、柔和、有浓郁的果香。(2)果醋制作的结果评价可通过观察菌膜的形成、嗅味和品尝进行初步鉴定，再通过检测和比较乙酸发酵前后发酵液的pH(可用pH试纸)进一步鉴定。此外，还可通过在显微镜下观察发酵液中是否有醋酸菌，并统计其数量进一步鉴定。 1.研究和应用微生物的前提(即发酵工程的重要基础):防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物。2.在实验室培养微生物的要求：(1)为微生物提供合适的营养和环境条件(培养基)。(2)要确保其他微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来(无菌技术)。(一)培养基的配制培养基作用：用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。2.种类：液体培养基和固体培养基，二者的区别为是否添加凝固剂。性质不加凝固剂扩大培养获得大量菌种、工业生产半固体培养基观察微生物的运动、分类、鉴定固体培养基化学天然培养基含化学成分不明确的天然物质工业生产分类、鉴定剂或化学药品鉴别不同种类的微生物，如可用伊红一亚甲蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(菌落呈深紫色，并带有金属光泽)质的要求。例如：①在培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素。②在培养霉菌时，需要将培养基调至酸性。③在培养细菌时，需要将培养基调至中性或弱碱性碳源：(1)概念(作用):提供碳元素的物质。(2)分类：无机碳源，如CO₂、CO₃²、HCO₃等。有机氮源，如葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等。(3)适用范围：①添加无机碳源培养基用来培养自养微生物；②添加有机碳源培养基用来培养异养微生(4)葡萄糖的作用：①作为碳源并提供能量②为其他有机物的合成提供原料。氮源：(1)概念(作用):提供氮元素的物质。(3)不添加氮源培养基可用来培养固氮微生物。(4)氮源的作用：培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。2.无机氮源能给自养型微生物提供能源吗?可以，例如NH₃既作为硝化细菌的氮源，NH₃氧化释放的化学能也作为能源。①提供无机营养②调节渗透压(③调节pH有些无机盐离子可以激活某些酶)4.是否所有培养基中都必须添加碳源、氮源?不是，例如分离固氮菌不需要额外添加氮源，其可 (二)无菌技术1.获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染。(1)消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)。消毒方法常用煮沸消毒法、巴氏消毒法(对于一些不耐高温的液体);还有化学药剂(如酒精、氯气、石炭酸等)消毒、紫外线消毒；生物消毒法：是指利用生物或其代谢物除去环境中的部分微生物的(2)灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内比较项理化因素的作用强度消灭微生物的数量芽孢和孢子能否被消灭消毒较为温和部分生活状态的微生物不能灭菌强烈能消毒和灭菌的种类应用范围煮沸消毒法家庭餐具等生活用品巴氏消毒法或72~76℃处理15s酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体紫外线消毒法手、用氯气消毒水源等皮肤、伤口、动植物组织表面和空气、手术灭菌湿热灭菌(高压蒸汽灭菌法)100kPa、121℃维持15～30min干热灭菌干热灭菌箱160～170℃加热1~玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等耐高温的和需要保持干燥物品，如玻璃灼烧灭菌酒精灯火焰灼烧金属用具等，接种过程中的试管口或瓶口等(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。(3)为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。(4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱；③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅。④表面消毒和空气消毒等使用紫外线消毒法，所用器械是紫外灯。(2)无菌技术措施的选择原则。活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒的方法，而不能采用灭菌的方2.对培养基、培养皿、接种环、实验者的双手、空气和牛奶常采用的灭菌或消毒方法分别是什么?分别为高压蒸汽灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌、化学药物消毒、紫外线消毒、巴氏消毒。3.用于生物消毒的微生物具有什么特点?用于生物消毒的微生物能产生杀死其他微生物的代谢产物或本身是寄生性的微生物。4.使用高压蒸汽灭菌锅时，能不能直接不能，一定要将锅内冷空气彻底排出，才能密封升温。否则可能引起锅内压力达到设定值而温度不能达到要5.高压蒸汽灭菌锅灭菌完毕后，可以立刻放气减压吗?不能，若立即放气减压瓶内液体会剧烈沸腾，冲掉瓶塞而外溢，甚至导致容器爆裂(须待灭菌锅内压力降至与大气压相等后才可打开排气阀开盖)。6.用紫外线进行消毒时，可以怎么做来加强消毒效果?照射前，适当喷洒酒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液。(三)微生物的纯培养培养物：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。纯培养物：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。纯培养：获得纯培养物的过程就是纯培养。得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。(2)微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。3.平板划线法逐AB步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。(一个菌落即一个种群)接种和分离酵酵母菌灭菌①制备培养基：配制培养基→灭菌①制备培养基：配制培养基→灭菌→倒平板。操平板冷凝后，要将平板倒置，倒置原因：防止在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与位，这个平板不能用来培养微生物，原因：空气中的微生物可能在②接种和分离酵母菌：通过接种环在固体培养基表面连续划线的操I.将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。Ⅱ.在火焰旁冷却接种环，并拔出棉塞。(冷却目的：避免接种环温度太高杀死菌种)Ⅲ.将试管口通过火焰。IV.将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。VI.左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注为什么划线时要注意不能划破培养基?②存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。VⅡ.灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五等量无菌水的平板)倒置，放入28℃左右(培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异)的恒温培养箱中培养24～48h。培养未接种培养基的作用是作为对照，检验培养基灭菌是否彻底或操作过程中是否被杂菌①平板划线操作中灼烧接种环的目的第二次及之后每次杀死上一次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时的划线结束后灼烧杀死接种环上残留的菌种，②在灼烧接种环之后，要等其冷却再进行划线，以免接种环的温度过③除第一次划线外，每次划线都从上一次划线的末端开始，这样能使细菌的数目随着划线次平板划线法过程中，接种环蘸了1次菌液；若分五个区划线，则接种环共需灼烧6次；b使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。(一)选择培养基1.实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度、pH等),同时抑制或阻止其他微生物的生长。2.选择培养基：在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。3.选择培养基配方的设计(以筛选能分解尿素的细菌的培养基为例)(2)培养基配方：碳源、无机盐、水，以尿素作为唯一的氮源。目的选择培养基青霉素能抑制细菌生长，对真菌无作用菌加入10%的酚分离酵母菌、霉菌不加氮源固氮微生物能利用空气中的氮气，非自生固氮微生物因分离固氮菌不加有机碳源自养型微生物能利用无机碳源(如二氧化碳)分离自养微生物以尿素为唯一氮源分离尿素分解菌以纤维素为唯一碳源能分解纤维素的微生物具有更多的生存机会而大量繁殖分离纤维素分解菌以石油为唯一碳源生存，从而分离出降解石油的微生物生物分离金黄色葡萄球菌鉴别培养基尿素被分解产生氨，培养基呈碱性，酚红指示剂变红。鉴别分解尿素的细菌复合物就无法形成，培养基中会出现以菌落为中心的透明鉴别纤维素分解菌(1)选择培养基的制备原理：根据不同微生物的特殊营养要求或对其某一化学(2)如何设计培养基筛选分解尿素的细菌?以尿素作为唯一氮源设计选择培养基，只有能合成脲除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。(4)在选择培养基上生长的一定是所选择的目的菌吗?不一定，有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证。(5)怎么证明一个选择培养基具有选择性?应该设置基础培养基(如牛肉膏蛋白胨培养基)或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。(二)微生物的选择培养1.方法：稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释后，将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基表面，进行培养。(1)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。(2)注意问题：统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。2.操作步骤①取样。②取10g土样加入90mL无菌水中摇匀，然后依次等比稀释。90mL稀释稀释稀释90mL稀释稀释稀释稀释稀释稀释③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。④涂布⑤平板倒置待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃的恒温培养箱中培养1～2d。在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。稀释涂布平板法基础操作：梯度稀释和涂布平板。注意：恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。缺点不能对微生物进行计数缺点不能对微生物进行计数操作复杂，需要涂布多个平板变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌；*固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带;比较项目图示关键操作平板划线法接种环在固体培养基表面连续划线稀释涂布平板法①一系列的梯度稀释；②涂布平板法操作注意事项每次划线前后均需灼烧接种环在具有所需显著菌落特征的区域的菌落中挑取菌体稀释度要足够高，为确保实验成功可以增加稀释度的范围从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体菌体获取优点可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落既可以获得单细胞菌落，又能对微生物进行计数3.平板划线法和稀释涂布平板法的比较平板划线法的作用：分离纯化微生物。稀释涂布平板法的作用：分离纯化微生物、统计样品中活菌的数目(三)微生物数量的测定稀释涂布平板法(间接计数法)显微镜计数法(直接计数法)原理当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌利用特定细菌计数板或血细胞计数板，公式板时所用的稀释液的体积×稀释倍数。菌数×400×10⁴×稀释倍数缺点当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落结果比实际值偏小比实际值偏大当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。练习：将1ml水样稀释100倍，在三个平板上用涂布法分别接入0.1ml稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为(39+38+37)÷3÷0.1×100×1000。稀释涂布平板法的注意事项：①选择菌落数在30～300的平板上计数。②需培养计算出三个或三个以上的平板菌落求平均数。③统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。为何需要涂布3个平板?作为重复实验，统计时取平均值，以减少偶然因素对实验结果的影响，增强实验结果的说服力。为什么一般选择菌落数为30～300的平板进行计数?若平板上菌落数过多，说明稀释度过低，菌体的密度大，就会出现更多的两个或两个以上的菌体形成的菌落，结果不准确，且计数较困难。若平板上菌落数过少，菌落形成的偶然性大，结果也不准确。为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果?尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值，防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。内容实验原理a.能合成脲酶的细菌才能分解尿素；b.配制以尿素为唯一氮源的培养基分解尿素的细菌a.直接计数法(显微镜下用特定细菌计数板或血细胞计数板实验流程土壤取样→配制土壤溶液和制备培养基→系列稀释→涂螺2.统计菌落数目时，培养基表面生长的1个菌落来源于样品稀释液中的1个活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数，推测出每克样品中的菌落数。3.设置重复组，增强实验的说服力与准确性。【深挖教材】1.(选择性必修3第18页正文拓展)为什么测定活菌的数量不能用平板划线法?由于在所划的线中，一般只有最后一次划线的末端才会形成只由一个细菌形成的菌落，而其他一些菌落往往由两个细菌或多个细菌繁殖而成，而在计数时一个菌落对应着一个细菌，这样在划线所得的平板中，菌落数第11页共53页2.(选择性必修3第18～19页“探究·实践”)结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养【拔高】三种筛选方法的特点及举例特点举例出分解尿素的细菌利用某种化学物质在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质对微生物产生的影响，抑加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌的选择培养改变微生物的培养条件温的微生物【合作探究】(1)如何从大豆田土壤中分离出固氮微生物?(2)要分离出分解纤维素的微生物，应在什么样的环境中取土样?应配制什么样的培养基?应从富含纤维素的培养基中取土样，如树林(3)根据选择培养基的原理，如何筛选出耐酸菌? 发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种,发酵,产品分离、提纯等方面。1.选育菌种：性状优良的菌种可以从自然界中筛选出来，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得。例如：生产柠檬酸需要筛选产酸量高的黑曲霉。2.扩大培养：工业发酵罐的体积很大，接入的菌种总体积也较大，因此在发酵之前还需要对菌种进行扩大培养。目的：在较短的时间内得到大量菌体用于工业生产。扩大培养的培养基：一般为液体培养基。3.配制培养基：在菌种确定之后，要选择原料制备培养基。培养基的配4.灭菌：发酵工程中所用的菌种大多是单一菌种5.接种：扩大培养的菌种和灭菌后的培养基加入发酵组分,要严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件。不同发酵条件的影响实例——谷氨酸发酵注意：菌种是谷氨酸棒状杆菌(异养需氧型)7.分离、提纯产物：如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束之后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥得到产品。如果产品是代谢物，可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。二、发酵工程的应用①生产条件温和、②原料来源丰富且价格低廉、③产物专一、④废弃物对环境的污染小、⑤容易处理。(1)在食品工业上的应用(食品工业是微生物最早开发和应用的领域。)①生产传统的发酵产品，如酱油、各种酒类。常见的食品添加剂种类：酸度调节剂、增味剂、着色剂、增稠剂、防腐剂。食品添加剂优点：增加食物的营养，改善食品的口味、色泽和品质，延长食品的保存期。,如α-淀粉酶、β-淀粉酶、脂肪酶等。酶制剂应用：食品的直接生产、改进多数通过发酵工程Ⅲ.碾磨：将干燥的麦芽碾磨成麦芽粉VI.蒸煮：作用是产生风味组分，终止酶的进一步作用，并对糖浆灭菌VII.冷却IX.过滤XI.终止：过滤、调节、分装啤酒进行出售不添加是否添加食品添加剂→添加达2个月7天左右麦芽汁浓度原料(2)在医药工业上的应用②发酵工程逐步扩展到了其他抗生素、多种氨基酸采用基因工程的方法，将植物或动物的基因转移到微生物中，获得具利用基因工程生产疫苗具体操作：将病原体的某个或某几个抗原基因转入适当的可以作为疫苗使用。例如一种生产乙型肝炎疫苗的方法就是将乙型肝炎病毒的抗原基因转入酵母菌，再通过发酵生产(P26)(3)在农牧业上的应用改良土壤结构，促进植株生长，常见的有根瘤菌肥、固氮菌肥等。微生物肥料的作用：①增进土壤肥力，改良土壤结构②促进植株生长③减少化肥使用、减少污染、保护生态环②生产微生物农药。微生物农药是利用微生物或其代谢物来防治病虫害的。微生物农药作为生物防治的重要a.单细胞蛋白：以淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液等为原料，通过发酵获得了大量单细胞蛋白，用单细胞蛋白制成的微生物饲料，能使家畜、家单细胞蛋白=微生物菌体指的是微生物，不是菌体内的某种蛋白质，类、脂质和维生素等物质。(4)在其他方面的应用a.解决资源短缺与环境污染问题：随着对纤维素水解研究的不断深入，利用纤维废料发酵生产酒精、乙烯等能b.将极端微生物应用于生产实践：自然界中还存在着一定数量的极端微生物，它们能在极端恶劣的环境(高温、高压、高盐和低温等环境)中正常生活。例如嗜热菌、嗜盐菌可以用来生产洗涤剂，嗜低温菌有助于提【深挖教材】1.(选择性必修3第23页“思考.讨论”)微生物菌种资源丰富，选择发酵工程用的菌种时需要考虑的因素有o在低成本的培养基上能迅速生长繁殖；生产所需代谢物的产量高，发酵条件容易控制；菌种不易变异、退化等2.(选择性必修3第22～23页图1-9)某生产谷氨酸的发酵装置，在中性和弱碱性条件下会积累谷氨酸，但在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺，由此可知环境条件不仅会影响微生物的生长繁殖，也会影响微生物的代谢物的形成应用实践：(1)微生物肥料使作物增产的原理是什么?微生物在代谢过程中产生的有机酸、生物活性物质能增进土壤肥力、改良土壤结构.促进植物生长。微生物农药是利用微生物或其代谢产物来防治病虫害的。第2章细胞工程第1节植物细胞工程是指应用细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学科的原理和方法，通过细胞器、细胞或组织水平上的操作，有目的地获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品的一门综合性的生物工程。 (二)植物细胞的全能性1.概念：细胞经分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能。2.原理：一般情况下，生物体的每一个细胞内都含有本物种发育所需的全套遗传物质。3.是否表现出全能性的两种判断标准：(1)产生完整生物体。(2)分化成其他各种细胞。注意：①种子发育成个体不能体现全能性。②胚胎干细胞分化成各种组织器官的细胞能体现。适宜浓度和比例的激素。(5)一定的营养条件。5.生长发育过程中细胞没有表现全能性的原因：在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会选择性地表达。判断以下例子是否表现出了细胞的全能性(1)利用菊花茎段培养获得试管苗是0(2)芽原基的细胞发育为芽，叶原基的细胞发育为叶否。(4)蜜蜂的孤雌生殖中，卵细胞直接发育成雄蜂是(5)造血干细胞可分化形成多种血细胞否。(6)通过花药离体培养，获得单倍体幼苗是。(7)胚胎干细胞可分化发育成为各种组织器官的细胞是。(8)种子发育成完整植株否□比较一般情况下下列细胞全能性的大小(2)分化程度低的细胞>分化程度高的细胞、(3)分裂能力强的细胞>分裂能力弱的细胞(4)植物细胞>动物细胞 (5)幼嫩的细胞>衰老的细胞 (三)植物组织培养技术1.概念：将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。2.植物组织培养的原理：植物细胞的全能性。植物组织培养的生殖方式：无性生殖。(花药离体培养是有性生殖)植物组织培养的分裂方式：有丝分裂。3.过程：培养结果：形成完整的植株。培养结果：形成完整的植株。诱导外植体①外植体：用于植物组织培养的离体的植物器官、组织或细胞。②脱分化：在一定的激素和营养等条件的诱导下，已经分化的细胞经过脱分化，失去其特有的结构和功能，转变成未分化细胞的过程。③愈伤组织：不定形的薄壁组织团块。其细胞的全能性高，分化程度低。④再分化：在一定的培养条件下，再分化出芽、根等器官的过程。4.实例——菊花的组织培养(1)操作流程①外植体的消毒：将流水冲洗后的外植体(幼嫩的茎段)用酒精消毒30s,用无菌水清洗2～3次后，再用次氯酸钠溶液处理30min,用无菌水清洗2～3次。选择幼嫩的菊花茎段的原因：细胞分裂能力强(分化程度较低)易诱导脱分化形成愈伤组织。②外植体的分割：用无菌滤纸吸去表面的水分，用解剖刀将外植体切成0.5～1cm长的小段。③接种：在酒精灯火焰旁，并且实验中使用的培养基和所有的器械及每次使用后的器械都要灭菌,将外植体的1/3～1/2插入诱导愈伤组织的培养基中。用封口膜或瓶盖封盖瓶口，并在培养瓶上做好标记。④培养：将接种了外植体的锥形瓶或植物组织培养瓶置于18～22℃的培养箱中培养。定期观察和记录愈伤组织的生长情况。诱导愈伤组织期间一般不需要光照，在后续的培养过程中，每日需要给予适当时间和强度光⑤转移培养(再分化过程):培养15-20d后，将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上。长出芽后，再将其转接到诱导生根的培养基上，进一步诱导形成试管苗。⑥移栽：试管苗不可以直接移栽入土，需先打开封口膜或瓶盖，让试管苗在培养箱内生长几日，将试管苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩上，壮苗后再移栽入土。(2)注意事项：①实验中使用的培养基和所有的器械都要灭菌。接种操作必须在酒精灯火焰旁进行，并且每次使用后的器械都要灭菌。杂菌与外植体细胞间的关系：种间竞争或寄生。②接种时注意外植体的方向，不要倒插。③由愈伤组织进行细胞分化时，因为生根后不易再生芽，一般要先诱导其生芽，然后诱导其生根，可通过控制培养基中生长素和细胞分裂素的比例来实现。④光照：在诱导愈伤组织阶段，对有些植物来说，避光培养有利于细胞脱分化形成愈伤组织。当愈伤组织再分化出芽和叶时，一定要有光照,有利于叶片内叶绿素的合成。⑤植物组织培养中所需的碳源一般为蔗糖，少数为葡萄糖和果糖。蔗糖作用：作为碳源，提供能量，维持渗透压而葡萄糖和果糖在与蔗糖提供相同数量碳源的前提下，其造成的渗透压可能过高5.植物组织培养的关键(1)条件：①离体条件②一定浓度的营养物质和植物激素③适宜的外界条件：适宜的温度、pH等④无菌条 (2)培养基状态：固体培养基(需更换培养基，生根培养基及生芽培养基)。(3)体内细胞未表现全能性的原因：基因的表达具有选择性。(4)光照的应用：脱分化阶段不需要给予光照，再分化阶段需要给予光照，以利于叶绿素的形成。6.植物激素对植物组织培养的影响由愈伤组织进行细胞分化时，一般要先诱导其生芽，然后诱导其生根，可通过控制培养基中生长素和细胞分裂素的比例来实现。①按照不同的顺序使用这两类激素，会得到不同的实验结果使用顺序实验结果素素同时使用细胞既分裂也分化分化频率提高②当同时使用这两类激素时，两者用量的比例影响植物细胞的发育方向生长素/细胞分裂素植物细胞的发育方向比值高比值低比值适中有利于根的分化、抑制芽的形成有利于芽的分化、抑制根的形成促进愈伤组织的形成【合作探究】1.在植物组织培养过程中，为什么要进行一系列的消毒、灭菌，并且要求无菌操作?避免杂菌在上面迅速生长消耗营养，且有些杂菌会危害培养物的生长。2.在组织培养过程中，诱导愈伤组织的培养基、诱导生芽的培养基和诱导生根的培养基的成分有什么不同?三种培养基成分的不同是生长素和细胞分裂素的比例不同。3.诱导愈伤组织期间一般不需要光，后续培养过程中，为什么每日要给予适当时间和强度的光照?后续培养过程中，给予适当时间和强度的光照的目的是诱导叶绿素的形成.进一步形成叶绿体进行光合作4.若培养物取自植物的幼茎、叶片等含有叶绿体的部位，愈伤组织中是否会含有叶绿体?培养物经过诱导后.失去其特有的结构和功能而转变成未分化细胞.愈伤组织中不含有叶绿体。5.如果外植体被污染了，试分析原因：①培养基、接种工具灭菌不彻底②外植体消毒不彻底③操作过程不符合(四)植物体细胞杂交技术1.概念：将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。2.原理：细胞膜的流动性和植物细胞的全能性。3.具有全能性的原因：一般情况下，生物体的每一个细胞内都含有本物种发育所需的全套遗传物质，都具有发育成为完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能。4.植物细胞表现全能性的条件：(2)一定浓度的营养物质和植物激素(3)适宜的外界条件：适宜的温度、pH等(1)去除细胞壁：酶解法(纤维素酶、果胶酶),获得原生质体纤维素酶和果胶酶处理去除细胞壁纤维素酶和果胶酶处理去除细胞壁生质体胞壁壁(融合完成的标志)杂种移栽后植株的植株诱导融【拔高】诱导融(1)诱导产物有三类(假设用于杂交的两种植物细胞分别为A、B):①未融合的细胞(A和B)、②两两融合的细胞(AA、BB和AB)(2)检测方法：对诱导产物中的细胞进行植物组织培养，然后根据得到的植物性状进行判结论若得到的是两种亲本性状的植物，且一种植物的性状得到加强多细胞融合体同种细胞融合原因：维持原生质体正常的形态结构(或防止原生质体吸水涨破)o(2)遗传物质的变化：经植物体细胞杂交形成的杂种细胞虽然具有两种细胞的遗传物质，但这些遗传物质并不一定都表达，且遗传物质的传递不遵循孟德尔遗传规律。7.优点：克服远缘杂交不亲和障碍8.意义：打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种。9.局限性：不能按照人的要求表达性状。体细胞杂交后细胞内染色体数目、染色体组数目及基因型的判断体细胞杂交即两个细胞融合成一个细胞，不管染色体、基因型还是染色体组都是两亲本之和(采用直接相加的方法)。若一植物细胞含有2x条染色体，2个染色体组，基因型为Aabb,另一植物细胞含有2y条染色体，2个染色体组，基因型为ccDd,则新植株应为异源四倍体，其体细胞中染色体为(2x+2y)条，4个染色体组，基因型为AabbccDd。离体的植物器官、↓脱分化愈伤组织↓再分化↓发育原生质体B诱导生质体化第17页共53页操作除脱分化、再分化外，还要用酶解法去除细胞关系植物组织培养是植物体细胞杂交的基础，植物体细胞杂交所用的技术更复杂【合作探究】(1)从结果上看杂种植株在遗传上有何特点?从杂种植株的染色体组成上看属于何种变异?生物基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达相互干扰，不能像马铃薯或番茄植株达。(基因之间、基因与基因产物之间、基因与环境之间存在着复杂的相互作用，两种生物的基因结合到一个细胞中之后，不能按照原来的顺序表达了)二、植物细胞工程的应用(一)植物繁殖的新途径1.快速繁殖(也叫微型繁殖)原理：植物细胞的全能性。(④不受自然生长季节的限制)进行作物脱毒的原因长期进行无性繁殖的作物(如马铃薯和草莓),它们感染的病毒很容易传给后代。病毒在作③操作过程：切取一定大小的茎尖进行组织培养，再生的植株就有可能不带病毒，从而脱毒苗：是选择植物的分生区如茎尖(刚形成，病毒含量极少，甚至无病毒)进行组织培养而获得的，属于细抗毒苗：是把抗某病毒的基因导入受体细胞中，并通过一定的方实例：目前采用茎尖组织培养技术来脱去病毒，在马铃薯、草莓、甘蔗、菠萝、植物组织培养到愈伤组织阶段，细胞进行有丝分裂，细胞分裂速度较快，从而获得大量的组织细胞，然后对于无性繁殖的作物，病毒在作物体内逐年积累，就会导致作物产量降低、品质变差。而植物极少，甚至无病毒，因此切取一定大小的茎尖进行组织培养，再生的植物就有可能不带病毒(二)作物新品种的培育 1.单倍体育种二倍体植株的的花药(或花粉)植物组织培养[单倍体植株染色体加倍选择优良品种(2)优点：①可以得到纯合子②明显缩短了育种的年限.(节约了大量的人力和物力)③单倍体植株是进行体细胞诱变育种和研究遗传突变的理想材料。【合作探究】与体细胞相比，生殖细胞如花粉的遗传物质减少了一半，为什么生殖细胞仍具有全能性?在生物的体细胞中染色体是成对存在的，基因也是成对存在的，生殖细胞中遗传物质虽然减少了一半，但基 因的种类没有少.仍具有控制生长发育的全套的遗传信息和全部的基因.因此生殖细胞仍具有全能性。2.突变体的利用(3)产生原因：在植物的组织培养过程中，易受培养条件和诱变因素(如射线、化学物质等)的影响而产生突(5)诱变育种的优点：通过人工诱变提高愈伤组织的突变率，从而筛选获得抗病、抗盐、高产、优质的新品种，加快育种进程。(P41)诱变育种的缺点：突变具有不定向性和低频性，因此需大量处理实验材料。(6)利用：筛选出对人们有用的突变体，进而培育成新品种。(P41)为什么用物理或化学因素处理愈伤组织更易诱发突变?产生的变异一定符合需要吗?因为愈伤组织细胞处在分裂过程中，细胞要进行DNA分子复制，因此更易发生突变。由于突变是不定向的，产生的变异不一定符合需要。(三)细胞产物的工厂化生产1.次生代谢物(1)概念：植物代谢产生的一些一般认为不是植物基本生命活动所必需的产物。(2)本质：一类小分子有机化合物(如酚类、萜类和含氮化合物等)。(3)作用：在植物抗病、抗虫等方面发挥作用，也是很多药物、香料和色素等的重要来源。(4)缺点：①植物细胞的次生代谢物含量很低。②有些产物不能或难以通过化学合成途径得到。2.细胞产物的工厂化生产生产技术手段：植物组织培养技术。(1)代谢产物的分类a.初生代谢：初生代谢是生物生长和生存所必需的代谢活动；初生代谢产物：糖类、脂质、蛋白质、核酸等(P41)b.次生代谢：植物代谢会产生一些一般认为不是生物生长所必需的，一般在特定组织或器官中，并在一定的环境和时间条件下才进行。次生代谢产物：一类小分子有机化合物(如酚类、萜类、含氮化合物等)(P41相关信息)(2)细胞产物的工厂化生产的目标产物：次生代谢产物。(P41)(3)次生代谢物作用：在植物抗病、抗虫等方面发挥作用，也是很多药物、香料和色素等的重要来源。(P41)(4)生产技术手段：植物组织培养技术(在离体条件下对单个植物细胞或细胞团进行培养使其增殖的技(6)优点：不占用耕地，几乎不受季节、天气等的限制，对于社会、经济、环境保护具有重要意义；生产速度(7)实例：利用紫草细胞的组织培养生产的紫草宁具有抗菌、消炎和抗肿瘤等活性。利用红豆杉细胞的组织培养生产的紫杉醇具有高抗癌活性。(P41)问题：细胞产物工厂化生产主要利用的是哪种结构?愈伤组织。该过程中是否需要培养得到完整植株?一般不需要。3.植物细胞培养与植物组织培养不完全相同，不需要经过再分化的过程。利用植物细胞培养获得细胞产物只需要通过脱分化得到愈伤组织，然后利用液体培养基大量培养愈伤组织细胞，从中提取所需目标产物。【拔高】.植物组织培养与植物细胞培养的比较获得细胞产物固体培养基愈伤组织J或细胞团细胞群(团)实例等染色体，2个染色体组，染色体，2个染色体组，第2节动物细胞工程动物细胞工程的技术包括：动物细胞培养、动物细胞融合、动物细胞核移植。动物细胞培养是动物细胞工程的 基础。一、动物细胞培养1.概念：从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。2.地位：动物细胞工程的基础。4.目的：获得细胞或细胞产物_ ①适宜的营养条件、②无菌、无毒的环境、③适宜的温度、pH和渗透压、④适宜的气体环境。(P43)(1)适宜的营养条件：糖类、氨基酸、无机盐、维生素、血清等，由于人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚，因此通常需要加入血清等一些天然成分。血清的作用：提供尚未全部研究清楚的细胞所需的营养物质。培养动物细胞一般使用液体培养基，也称(2)无菌、无毒的环境：保证无菌、无毒环境的具体措施：①培养液和培养用具进行灭菌处理;②在无菌环境下进行操作;③定期更换培养液6为什么培养液需要定期更换?(P44)清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。第20页共53页如何防止培养过程中的微生物污染?在细胞培养液中添加一定量的抗生素。(4)气体环境：95%的空气+5%的CO₂的混合气体的CO₂培养箱培养仪器：含有95%空气和5%CO₂的混合气体的CO₂培养箱。(P44)(二)动物细胞培养的过程单个加培养液细胞单个加培养液细胞细胞悬液传代培养传代培养原代培养②细胞贴壁：细胞需要贴附于某些基质表面才能生长增殖a悬浮生长类：会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。b贴壁生长类：会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻外，还会发生接触抑制。③接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖，这种现象称“细胞增殖到互相接触的时候，糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续繁殖，出现接触抑制的现象”试结合上述解释，举例说明哪种细胞最可能无接触抑制现象，并阐述原因：癌④原代培养：分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初原代培养的具体做法：将初次制备好的细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中培养。a.悬浮生长类：直接用离心法收集。b.贴壁生长类：重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心(2)将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。(P45)⑤进行动物细胞培养时，幼龄动物的细胞比老龄动物的细胞更易于培养，分化程度低的细胞⑥进行动物细胞培养时常用胰蛋白酶分散细胞，这说明第一次目的是使组织细胞分散开；第二次目的是使细胞从瓶壁上脱离下来，便于分瓶后继续培养。注意：使用胰蛋白酶时，要控制好作用时间，因为胰蛋白酶不仅能分解细胞间的蛋白质，长时间作用还会分可以用胃蛋白酶分散细胞吗?为什么?不可以。胃蛋白酶作用的适宜pH约为2,当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性，多数动物细胞培养的适宜pH为7.2-7.4,胃蛋白酶在此环境中没有活性，所以用胃蛋白酶不【拔高】动物细胞培养与植物组织培养的比较比较项目培养基性质固体培养结果等原代培养、传代培养相同点①都需要人工条件下的无菌操作，无菌培养；②提示：动物细胞培养是为了获得大量的动物细胞或细胞产物；植物组织培养是为了获得新个(三)干细胞培养及其应用1.干细胞的分布与类型(1)存在：早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。①胚胎干细胞(简称ES细胞):存在于早期胚胎中，具有分化为成年动物体内任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。②成体干细胞：成体组织或器官内的干细胞。常见类型：包括骨髓中的造血干细胞、神经系统中的神经干细胞、睾丸中的精原干细胞等；特点：具有组织特异性,只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力0③诱导多能干细胞(简称iPS细胞):是通过体外诱导成纤维细胞，获得的类似胚胎干细胞的一类细胞。制备iPS细胞的方法：①借助载体将特定基因导入细胞中②直接将特定蛋白导入细胞中③用小分子化合物等来诱导。iPS细胞最初是由成纤维细胞转化而来的，后来发现已分化的T细胞、B细胞等也能被诱导为iPS细胞。应用前景(优点):①诱导过程无需破坏胚胎，不涉及伦理问题;②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。因此应用前景优于胚胎干细胞。发现最早、研究最多的、应用最成熟的实例：造血干细胞，主要存在于成体的骨髓、外周血和脐带血中。2.干细胞的应用举例胚胎干细胞(ES细胞)诱导多能干细胞(iPS细早期胚胎特点能分化成任何一种细细胞的细胞应用造血干细胞用于治疗白血病，神经干细治疗镰状细胞贫血、阿尔茨海默病、心血管疾病等【合作探究】(1)诱导多能干细胞用于治疗人类的某些顽症的原理是什么?提示：诱导多能干细胞具有发育的全能性，可以被诱导分化形成新的组织细胞，经移植可使坏死或退化部位得以修复并恢复正常功能。(2)诱导多能干细胞为什么可以解决供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题?提示：通过干细胞体外诱导分化，可以培育出人造器官，从而解决供体器官不足的问题。另一方面，由于是自身细胞经诱导分化形成的，所以无免疫排斥反应。二、动物细胞融合技术与单克隆抗体(一)动物细胞融合技术(P48)1.概念：使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。2.诱导的结果：形成的杂交细胞，具有原来两个或多个细胞的遗传信息。(形成具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，可表现出两个或多个亲本的特点，称为杂交细胞。)3.诱导动物细胞融合的原理：细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖。第22页共53页4.诱导动物细胞融合的常用方法：PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等。其中，灭活病毒诱导法是②灭活的病毒是诱导动物细胞融合特有的方法.不能用于诱导植物原生质体融合。6.应用：①成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。②展起来的杂交瘤技术，为制备单克隆抗体开辟了新途“灭活病毒”中灭活的具体含义是什么?用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发(二)单克隆抗体及其应用早期获得抗体的方法：向动物体内反复注射某种抗原.使动物产生抗体.然后从动物血清中分离所需抗体。(1)B淋巴细胞特点：能产生单一的特异性抗体，但不能无限增殖。(2)骨髓瘤细胞特点：能在体外大量增殖，但不能产生抗体。2.单克隆抗体的优点：能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备。3.制备过程米尔斯坦和科勒由于发明了单克隆抗体的制备技术，于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖。(P49)杂交瘤细胞(既能迅速大量增殖，杂交瘤细胞(既能迅速大量增殖，注射到小鼠腹腔内对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和杭体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖抗体检测呆阳性的杂交瘤细胞(分泌的抗体能与特定抗原结合)从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单培养骨髓瘤细胞骨籍瘤细胞将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合又能产生抗体)▲图2-16米尔斯坦和科勒制备单克降抗体过程的示意图◎杂交细胞——第1次筛选：杂交瘤细胞筛选——第2次筛选：筛选出产生所需抗体的杂交瘤细胞体内培养从小鼠腹水中提取细胞单克隆抗体(1)给小鼠注射特定抗原的目的是获得能产生相应抗体的B淋巴细胞。(注意是从小鼠脾中得到的。)高pH融合法结果获得杂种植株应用培育植物新品种意义突破远缘杂交不亲和的障碍，打破了生殖隔离，扩展了杂交的亲本组合相同点动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理相同，诱导动物细胞融融合的方法相似【深挖教材】1.(选择性必修3第48～49页图2-16)制备单克隆抗体时，不直接用经过免疫的B淋巴细胞来获得提示：用于获得杂交瘤细胞的B淋巴细胞为浆细胞，是高度分化的动物细胞，培养时很难恢复分裂能力，不5.无增殖能力的细胞在培养基中存活仅5-7天，细胞的多聚体也容易死去；(一)动物体细胞核移植技术1.概念：将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，2.克隆动物：用核移植的方法得到的动物。(该个体不经过有性生殖过程，其遗传物质与细胞核供体基本相3.原理：动物细胞核的全能性、细胞膜具有一定的流动性。5.哺乳动物核移植分类：胚胎细胞核移植和体细胞核移植。两者中难度较高的是体细胞核移植。问题1:动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植；为什么?动物胚胎细胞分化程度低，表现全能性相对容易，动物体细胞分化程度高问题2:非人灵长类动物体细胞核移植的困难原因(1)供体细胞的细胞核在去核卵母细胞中不能完全恢复其分化前的功能状态，这导致了胚胎发育率低；(2)对非人灵长类动物胚胎进行操作的技术尚不完善。(二)体细胞核移植的过程第25页共53页MⅡ期去核去核卵母细胞重构胚代孕动物取供体细胞供体细胞1.采集的卵母细胞应培养至MIⅡ期(减数分裂Ⅱ中期)(P53)选择MⅡ期卵母细胞的原因(2)细胞体积大，易于操作。2.卵母细胞去核的方法：显微操作法。(P53)“去核”去除的为纺锤体-染色体复合物(P52相关信息)。*除此之外，还有梯度离心、紫外线短时间照射和化学物质处理等方法。*这些方法是在没有穿透卵母细胞透明带的情况下去核或使其中的DNA变性。注意：去核时.由于MII期卵母细胞核的位置靠近第一极体.一般用微型吸管一并吸出细胞核和第一极体。3.去核的原因：使核移植得到的胚胎或动物核内遗传物质全部来自有重要利用价值的动物。4.与直接注入核相比，将供体细胞注入卵母细胞的优点：对卵母细胞损伤较小。注入位置：将供体细胞注入去核卵母细胞的透明带内(卵细胞膜和透明带之间)o5.诱导供体细胞和去核卵母细胞融合的方法：电融合法。(1)物理方法：电刺激。(2)化学方法：Ca²载体、乙醇和蛋白酶合成抑制。9.以上方法处理重构胚的目的：激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程。(P53)新生犊牛的细胞质遗传物质来自去核卵母细胞。13.新生牛的性别与供体奶牛一致。(2)动物细胞培养技术。(3)动物细胞融合技术(移入供体细胞才涉及)-0①核移植中核供体动物、提供卵母细胞的动物、代孕动物和克隆动物之间的关系：克隆动物体动物相同，少数由线粒体DNA控制的性状与提供卵母细胞的动物相同，与代孕动物的性状无遗传关系。②克隆动物的亲本有3个，即体细胞核供体、卵母细胞细胞质供体和代孕母体。第26页共53页(三)体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题①转基因克隆动物作为生物反应器，生产珍贵的医用蛋白②转基因克隆动物的细胞、组织和器官可作为异种移植的供体。③以患者作为供体培育的人核移植胚胎干细胞，经过诱导分化能形成相应的细胞、组织或②克隆一批遗传背景相同的动物，可以通过它们之间的对比来分析致病基因。(2)各个技术环节有待进一步改进。操作对象：动物生殖细胞、受精卵、早期胚胎细胞；2.胚胎工程技术：体外受精、胚胎移植、胚胎分割3.哺乳动物受精和早期胚胎发育的规律。(P56)(一)受精2.受精场所：在自然条件下，在雌性动物的输卵管内完成。3.受精过程：包括受精前的准备阶段和受精阶段；4.精子获能一准备阶段1(1)概念：刚刚排出的精子不能立即与卵子受精，必须在相应的生理变化发生雌性动物的生殖道后，才能获得a.直接利用雌性动物生殖道使精子获能*获能液的成分因动物种类不同而有所差异；*获能液常见有效成分有肝素、Ca²载体等。注意：不同种类动物精子的形态相似，大小略有不同.与动物的体型大小无关。5.卵子的准备一准备阶段2有的可能是初级卵母细胞，如马、犬等；有的可能是次级卵母细胞，如猪、(1)精子释放多种酶溶解卵细胞膜外的一些结构，精子穿越透明带。透明带反应具体表现：精子的细胞膜与卵细胞膜融合，透明带迅速发生生理反应，阻止后来的精子进入透明(透明带反应发生时间：精子触及卵细胞膜的瞬间。)卵细胞膜反应：阻止多精入卵的第二道屏障。阻止其他精子入卵卵细胞膜反应具体表现：精子入卵后，卵细胞膜会立即发生生理反应，拒绝其他精子再进入卵内。卵细胞膜反应发生时间：精子入卵后。(4)雄原核的形成：精子入卵后，尾部脱离,原有的核膜破裂并形成一个新的核膜，最后形成一个比原来精子的核还大的核，叫作雄原核。(5)雌原核的形成：精子入卵后，被激活的卵子完成减数分裂Ⅱ,排出第二极体后，形成雌原核。雌、雄原核不能理解成卵子、精子原来的核，而是在原来细胞核的基础上形成的新核，原核膜已破裂。观察到两个极体(透明带和卵细胞膜之间)或者观察到雌、雄原核。注意：多数哺乳动物的第一极体不进行减数分裂Ⅱ,因而不会形成两个第二极体，观察到的两个极体为一个第 一极体和一个第二极体。(P58相关信息)防止多精入卵的两道屏障(1)透明带反应：精子触及卵细胞膜的瞬间，会产生阻止后来的精子进入透明带的生理反应，称作透明带反应，它是防止多精入卵受精的第一道屏障。(2)卵细胞膜反应：精子入卵后，卵细胞膜会立即发生一种生理反应，拒绝其他精子再进入卵内，称为卵细胞膜反应，这是防止多精入卵受精的第二道屏障。两道屏障防止多精入卵，其意义是：两道屏障防止多精入卵，保证受精卵中遗传物质与亲代体细胞一致，从而保证遗传的稳定性。内细胞团滋养层1.受精卵是胚胎发育过程中全能性最高的阶段。2.哺乳动物胚胎早期发育场所：输卵管和子宫3.胚胎早期发育阶段：受精卵→桑葚胚→囊胚→原肠胚胚胎早期发育各个阶段：受精卵(3)特点：细胞数量不断增加，胚胎总体积并不增加。(4)其他表现：每个细胞体积不断减小；每个细胞的核DNA数目不变有机物总量减少;有机物种类增加o2.桑甚胚(细胞数在32个左右)(1)概念：当卵裂产生的子细胞逐渐形成致密的细胞团，形似桑葚时，这时的胚胎称为桑葚胚。(2)特点：这一阶段及之前的每一个细胞都具有发育成完整胚胎的潜能，属于全能细胞。注意：桑葚胚及之前的细胞都未分化.都具有发育成完整胚胎的潜能.属于全能细胞。3.囊胚(1)概念：胚胎进一步发育，细胞开始出现分化,形成内细胞团、滋养层；随着胚胎进一步发育，胚胎内部出现了含有液体的囊腔—囊胚腔，这个时期的胚胎叫作囊胚。(2)特点：细胞逐渐分化。a.内细胞团：位置：聚集在胚胎一端。作用：将来发育成胎儿的各种组织。注意：内细胞团未分化具有全能性，是胚胎干细胞的来源。b.滋养层：位置：沿透明带内壁扩展和排列。作用：将来发育成胎膜和胎盘的一部分。注意：滋养层已分化，在原肠胚时发育成胎儿的胎膜和胎盘的一部分。c.囊胚腔：胚胎内部含有液体的腔。囊胚期的内细胞团细胞具有全能性。囊胚孵化后，将发育形成原肠胚；原肠胚表面的细胞层为外胚层，向内迁移的细胞形成内胚层；随着发育的进行，一部分细胞还会在内外两个胚层之间形成中胚层；这三个胚层将逐渐分化形成各种组织、器官等。全能细胞全能细胞细胞分化分化受精→2—4→8→桑椹→囊胚→原肠胚卵裂期囊胚腔内胚层滋养层外胚层胚胎发育个体发育出生性成熟发育个体胚后发育幼体【合作探究】1.胚胎发育过程中开始出现细胞分化的阶段和细胞分化最显著的阶段分别是哪些时期?细胞分化的原因是什么?开始出现细胞分化的阶段是囊胚期。细胞分化最显著的阶段是原肠胚的三个胚层分化形成各种组织、器官。细胞分化的原因是细胞内基因的选择性表达。2.在实际胚胎工程操作中，常以观察到两个极体或者雌、雄原核作为受精的标志，但观察不到3个极体，其原 多数哺乳动物的第一极体不进行减数分裂Ⅱ,因而不会形成两个第二极体二、胚胎工程技术及其应用胚胎工程的技术有很多，目前应用较多的是体外受精、胚胎移植、胚胎分割等(一)体外受精(技术)1.试管动物含义：通过人工操作使卵子在体外受精，经培养发育为早期胚胎后，再进行移植(1)主要技术(步骤):卵母细胞的采集、精子的获取和受精等步骤。(2)体外受精过程：卵巢MⅡ期卵母细胞(2)体外受精过程：卵巢MⅡ期卵母细胞新鲜或解冻的精液新鲜或解冻的精液精子离心处理获能精子适当的培养液共同培养体外受精受精卵培养体外受精受精卵培养①采集到的卵母细胞和精子，要分别在体外进行和获能处理，然后才能用于体外受精。②一般情况下，可以将获能的精子和培养成熟的卵子置于适当的培养液中共同培养一成受精。培养液是指获能溶液或专用的受精溶液。哺乳动物胚胎培养液成分：无机盐、有机盐类、氨基酸、核苷酸、激素、培养用CO₂培养箱(95%空气+5%CO₂)(3)意义：①是提高动物繁殖能力的有效措施。②可以为胚胎移植提供可用的胚胎。的卵子，已发育至减数第二次分裂中期(即MⅡ期),可直接与获能的精子【合作探究】(1)精子获能处理前为什么要离心处理?精液由精子和精清两部分组成。精清中含有一种能抑制精子获能的物质，因此在一般情况②培育的技术手段不同：试管动物需采用体外受精、胚胎移植等技术，克隆动物需采 ③是否遵循遗传定律：试管动物遵循遗传定律.克隆动物不遵循遗传定律。 (二)胚胎移植(技术)→超数排卵处理→超数排卵处理优良公牛→发情配种或人工授精胚胎移植胚胎移植月后进行下一次超数排卵处理具优良性状的后代1.胚胎移植概念：是指将通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。胚胎的来源：胚胎来源：体外受精及其他方式得到的胚胎。其他方式包括：体内受精、转基因技术、动物细胞核移植技术等。胚胎移植的实质：早期胚胎在相同生理环境条件下的空间位置转移，而胚胎本身的遗传物质并不发生改变，因此能保持其原来的遗传特性。 (1)供体、受体的选择和处理①供体：提供胚胎的个体称为供体。供体选择标准：遗传性状优良、生产能力强。③对受体进行的处理：同期发情处理。同期发情处理的目的：为胚胎移植前后提供相同的生理环境。相同的生理环境。这是胚胎移植成功与否的关键)④只对供体进行的操作：超数排卵处理。超数排卵处理需要用的激素：外源促性腺激素。超数排卵处理的结果：卵巢排出比自然情况下更多的成熟卵子。(2)配种或人工授精(应选择同种的优良公牛)。(3)胚胎的收集、检查、培养或保存胚胎收集的基础：哺乳动物早期胚胎形成后，在一定时间内不会与母体子宫建立组织上的联系，而是处于游离状态。(早期胚胎一定时期内处于游离状态)胚胎移植的实质：早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移。(5)移植后的检查移植后检查的目的：对受体进行妊娠检查(检查受体是否妊娠)选择和处理选择：遗传性能和生产性能优秀的个体(供体),健康、有正常繁殖能力的个体(受体)胚胎的收集、检查、培养或保存检查：发育到桑葚胚或囊胚阶段配种或人工授精胚胎移植后的检查检查受体母牛是否妊娠【合作探究】超数排卵处理中为什么使用的是促性腺激素而不是性激素?巢内卵泡的发育)3.胚胎移植的意义(优势):(1)充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力。(2)大大缩短了供体本身的繁殖周期。(3)对供体施行超数排卵处理后，增加后代数量。【拔高】1.胚胎移植的生理学基础移入受体体内存活2.胚胎移植中的四个注意点两次激素使用两次检查移植时间不同繁殖方式理牛、羊要培养到桑葚胚或囊胚阶段几乎所有动物都不能到原肠胚阶段移植胚胎由受精卵形成，属于有性繁殖胚胎由核移植或胚胎分割形成，属于无性繁殖项目胚胎分割动物体细胞核克隆动物相同点都属于无性生殖或克隆，最终技术是胚胎移植不同不同点胚胎的来源通过核移植技术获得的重组胚胎克隆动物的核遗传物质主要由供体细胞的细胞核提供克隆动物的核遗传物质主要由供体细胞的细胞核提供起点经过受精作用或其他方式形成的一个细胞经过核移植形成的一个细胞牛在自然情况下，胚胎最早可在8-16细胞阶段进入子宫，但在实践中通常对发育到囊胚阶段的胚胎进行移植的原因：提高移植后胚胎的发育率和妊娠率。(三)胚胎分割(技术)胚胎分割生殖方式：无性生殖(无性繁殖)。1.(1)概念：采用机械方法将早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。①胚胎分割理论基础：早期胚胎干细胞具有很强的分裂能力，并保持着细胞全能性。②物质基础：每个细胞核内具有相同的遗传物质。③特点：每个后代具有相同的遗传特性。(2)所需主要仪器设备：体视显微镜和显微操作仪。(3)操作对象及要求：选择发育良好、形态正常的桑葚胚或囊胚(原因：桑葚胚或囊胚的内细胞团细胞具有发育的全能性),将它移入盛有操作液的培养皿中，在显微镜下用分割针或分割刀分割。在分割囊胚阶段的胚胎时，要注意将内细胞团均等分割(原因：防止影响分割后胚胎的恢复和进一步发育)。(4)操作程序第33页共53页(5)操作结果：赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。(6)目的：定向改造生物性状(注意：这是定向的变异)(7)意义或优点：I.突破物种界限(克服远源杂交不亲和的障碍);IⅡ.定向改造生物的遗传性状。二、基因工程的基本工具1.限制性内切核酸酶(又称限制酶)—“分子手术刀”(1)来源：主要来自原核生物。①原核生物中存在限制酶的意义是：切割外源DNA、使之失效，以保证自身安全。②限制酶来源于原核生物，其不能切割自己的DNA分子的原因是：原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。_(确切来说应该是催化磷酸二酯键断开；功能中两个“特定”体现了酶的专一性。)。(3)限制酶识别序列：大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也