北京大学药物毒理学2毒理学实验基础-药学修改后

毒理学研究设计及

实验基础TheDesignofToxicologyStudy&FoundationsofToxicologyExperiment

1本章的学习目的学习了解毒理学研究的基础（方法和手段）实验的设计实施观察结果评价方法科学手段上的毒理学：实验科学（以动物实验为中心）2一.药物的研发流程总的来说新药的研发分为两个阶段：研究和开发。

这两个阶段是相继发生有互相联系的。区分两个阶段的标志是候选药物的确定，即在确定候选药物之前为研究阶段，确定之后的工作为开发阶段。

31.药物的研究研究阶段包括四个重要环节：（1）靶标的确立（2）模型的确立（3）先导化合物的发现（4）先导化合物的优化

42.药物的开发开发阶段也包括四个重要环节：（1）临床前试验：由制药公司进行的实验室和动物研究，以观察化合物针对目标疾病的生物活性，同时对化合物进行安全性评估。（2）研发中新药申请（InvestigationalNewApplication,IND）（3）临床试验：（Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期）（4）新药申请（NewDrugApplication,NDA）

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临床前研究

（1）药学研究：

（2）药效学研究：评价化学物质的生物活性和确定药物作用机理。（3）一般药理学研究：指对新药主要药效作用以外广泛药理作用的研究。主要是药物作用特征、对机体重要系统（神经、心血管、呼吸系统）的影响。（4）药代动力学研究(ADME)

（5）毒理学研究6二.为什么要进行毒理学试验？

毒理学试验是对药物安全性评价的主要手段，各国际组织或各国的行政部门所颁布的规程或指南已将毒理学实验列为常规试验，也称为法规(管理)毒理学试验（regulatorytoxicologytest），这类毒理学试验是以筛查和描述药物的毒性为目的，属于描述毒理学范畴。7毒理实验种类1.体内试验：2.体外试验：3.人体调查和流行病学调查：8三.毒理学实验的原则和局限性1.基本原则（三个原则）第一原则：药物在实验动物产生的作用，可以外推于人。第二原则：实验动物必须暴露于高剂量受试物。第三原则：选择成年的健康（雄性和雌性未孕）实验动物和人可能的暴露途径。92.利用动物实验的局限性不确定性：用实验动物的毒理学试验资料外推到人群接触的安全性时，会有很大的不确定性。“给人使用时总是不可避免地要冒一定的风险。”（要知己知彼）不确定性的产生：药物的毒性作用受到许多因素的影响。

1.实验动物和人对药物的反应敏感性不同，有时甚至存在着质的差别。（症状和体征）

2.试验中选用较大的染毒剂量，有些药物在高剂量和低剂量的毒性作用规律并不一定一致。

3.毒理学试验所用动物数量有限，那些发生率很低的毒性反应，在少量动物中难以发现。

4.实验动物一般都是实验室培育的品系，一般选用成年健康动物，反应较单一。103.毒理实验的重要原则（1）贯彻优良实验室规范(GLP)（2）尊重动物福利（3R原则）11四.毒性评价试验的基本目的1.药物毒作用的表现和性质2.剂量-反应(效应)研究3.确定毒作用的靶器官4.确定损害的可逆性5.其它（1）毒作用的敏感检测指标和生物学标志（2）毒作用机制研究（3）受试物的毒物动力学和代谢研究（4）中毒的解救措施12四.毒性评价试验的基本目的1.药物毒作用的表现和性质2.剂量-反应(效应)研究3.确定毒作用的靶器官4.确定损害的可逆性5.其它（1）毒作用的敏感检测指标和生物学标志（2）毒作用机制研究（3）受试物的毒物动力学和代谢研究（4）中毒的解救措施13剂量-反应(效应)研究是毒性评价和安全性评价的基础。通过对不同有害作用的剂量-反应(效应)研究，可以得到该受试物的多种毒性参数。

急性(致死性)毒性试验：LD50、LD01和MTD。急性非致死性毒性试验中：急性可观察到有害作用的最低剂量

(LOAEL)和未观察到有害作用的剂量(NOAEL)。亚急性、亚慢性及慢性毒性试验：相应的LOAEL和NOAEL。致畸试验：LOAEL和NOAEL

致突变、致癌试验：表观的LOAEL和NOAEL。14四.毒性评价试验的基本目的1.药物毒作用的表现和性质2.剂量-反应(效应)研究3.确定毒作用的靶器官4.确定损害的可逆性5.其它（1）毒作用的敏感检测指标和生物学标志（2）毒作用机制研究（3）受试物的毒物动力学和代谢研究（4）中毒的解救措施15四.毒性评价试验的基本目的1.药物毒作用的表现和性质2.剂量-反应(效应)研究3.确定毒作用的靶器官4.确定损害的可逆性5.其它（1）毒作用的敏感检测指标和生物学标志（2）毒作用机制研究（3）受试物的毒物动力学和代谢研究（4）中毒的解救措施16四.毒性评价试验的基本目的1.药物毒作用的表现和性质2.剂量-反应(效应)研究3.确定毒作用的靶器官4.确定损害的可逆性5.其它（1）毒作用的敏感检测指标和生物学标志（2）毒作用机制研究（3）受试物的毒物动力学和代谢研究（4）中毒的解救措施17五.毒理学试验设计18环境条件(气温,气湿等)暴露药物———→机体→毒效应·化学结构·理化性质水溶性脂/水分配系数挥发度气/血分配系数·分散度·纯度/杂质·途径·时间/频率·溶剂·稀释度·交叉暴露·物种,品系·个体因素性别年龄生理状态营养/习惯疾病19五.毒理学试验设计要点1．剂量分组一般至少要设3个剂量组

高剂量组中剂量组

低剂量组希望能得到满意的剂量-反应(效应)关系。(一)体内毒理学试验设计20①未处理对照组（空白对照组）：确定本底值，进行质量控制（常用于遗传毒理学试验）②阴性（溶剂）对照：是染毒组比较的基础③阳性对照：检测试验体系的有效性④历史性对照：检测试验体系的稳定性对照组问题毒理学实践的基本手段之一就是比较分析。212．各组动物数3．试验期限221.测定药物的溶解性2.试验最高剂量的推荐3.代谢活化4.阳性对照5.重复（二）体外毒理学试验设计23环境条件(气温,气湿等)暴露药物———→机体→毒效应·化学结构·理化性质水溶性脂/水分配系数挥发度气/血分配系数·分散度·纯度/杂质·途径·时间/频率·溶剂·稀释度·交叉暴露·物种,品系·个体因素性别年龄生理状态营养/习惯疾病24六.药物1.受试样品的准备①纯度及杂质成分②化学结构和理化性质（挥发性和溶解性）③相似化合物的毒性参考资料④同种同一批号⑤成分和配方必须固定⑥稳定性受试物应一次备齐全部实验的用量。25受试物的准备剂型：水溶液、油溶液或混悬液对溶剂和助溶剂的要求：无毒，与受试物不起反应，稳定。制剂要点染毒容积：以受试的实验动物物种或制剂来确定。261.在制备制剂时加热受试物不应接近或者达到改变其化学性质或者物理性质的温度2.在评价固体受试物皮肤毒性时，应保持其形状和颗粒大小3.多成分的受试物应按照配方配制，使染毒制剂准确反映原混合物4.制剂应保持化学稳定性和一致性5.制剂应减少总试验容积，利用溶剂或赋形剂的量不应过多。6.制剂应易于准确染毒7.制剂的pH应为5-9.8.不应用酸碱解离受试物，基于保护动物的原因，并避免改变肠道或者肾小管内的pH值9.非胃肠道染毒，受试物应尽可能接近等渗27环境条件(气温,气湿等)暴露药物———→机体→毒效应·化学结构·理化性质水溶性脂/水分配系数挥发度气/血分配系数·分散度·纯度/杂质·途径·时间/频率·溶剂·稀释度·交叉暴露·物种,品系·个体因素性别年龄生理状态营养/习惯疾病28药物的化学结构

物理化学性质化学活性↓↓ADME毒动学靶毒效学29化学结构对其毒性的影响同系物的碳原子数：烷、醇、酮等碳氢化合物按同系物相比，碳原子数愈多，则毒性愈大(甲醇与甲醛除外)。但当碳原子数超过一定限度时(7～9个)，毒性反而迅速下降。取代基团：卤代烷烃、基团的位置不同也可能影响毒性分子中不饱和键构型异构：顺反异构和手性异构

3031药物的理化性质溶解度：水溶性：化学物在水中的溶解度直接影响其毒性大小，溶解度愈大，毒性愈大。脂溶性：脂溶性物质易在脂肪中蓄积，易侵犯神经系统。挥发度：分散度纯度和杂质：药物的纯度常常改变其毒性

32北医三院眼科用药33

上海华联抗癌药(甲氨喋呤、阿糖胞苷)致残130多人(其中因厂方瞒报药品被污染事实，导致真相延迟揭示，药害例数增加数十人)，症状为下肢疼痛乏力、进而行走困难瘫痪等。

调查原因：存在严重的质量管理混乱,导致在5方面违规生产行为。部分批次产品中混入了微量硫酸长春新碱——另一种不能用于鞘内注射的抗肿瘤药物（生产尾料未交三废处理人员，而由灌装工收集存放于储藏室，继续用于生产）。

鞘内注射甲氨蝶呤致患者双腿瘫痪变形34越战中美军使用落叶剂2、4、5-T（橙剂）TCDD35环境条件(气温,气湿等)暴露药物———→机体→毒效应·化学结构·理化性质水溶性脂/水分配系数挥发度气/血分配系数·分散度·纯度/杂质·途径·时间/频率·溶剂·稀释度·交叉暴露·物种,品系·个体因素性别年龄生理状态营养/习惯疾病36七.实验动物的选择和处理毒理学的动物试验是以实验动物作为研究对象的，为获得可靠的研究结果，先决条件是正确地选用实验动物。37(一)实验动物物种的选择基本原则①对受试物在代谢、生物化学和毒理学特征与人最接近的物种②敏感的物种③自然寿命不太长的物种④易于饲养和实验操作的物种;经济并易于获得的物种38动物物种大鼠小鼠豚鼠兔狗地鼠弥猴小型猪鸡等等。39表1常用实验动物生物学和生理学参数40

背肿了≠41（二）实验动物品系的选择1.近交系：C57、Balb/c、dba-1；shrn、ZDF大鼠、F344/DuCrlCrlj大鼠2.杂交群动物：3.封闭群：昆明种、ICR小鼠；F344大鼠、SD大鼠、wistar大鼠等42（三）对实验动物微生物控制的选择43（四）个体选择①性别

②年龄和体重

③生理状态

④健康状况44环境条件(气温,气湿等)暴露药物———→机体→毒效应·化学结构·理化性质水溶性脂/水分配系数挥发度气/血分配系数·分散度·纯度/杂质·途径·时间/频率·溶剂·稀释度·交叉暴露·物种,品系·个体因素性别年龄生理状态营养/习惯疾病45皮肤癌：饮酒：

46环境条件(气温,气湿等)暴露药物———→机体→毒效应·化学结构·理化性质水溶性脂/水分配系数挥发度气/血分配系数·分散度·纯度/杂质·途径·时间/频率·溶剂·稀释度·交叉暴露·物种,品系·个体因素性别年龄生理状态营养/习惯疾病47（五）饲养条件①合理的全营养饲料②水③温度和湿度④空气清洁度⑤人工照明的昼夜周期48（六）国家有关实验动物的质量监督和质量合格证制度1998年《实验动物管理条例》试验动物微生物学和寄生虫学检测等级实验动物哺乳类动物遗传质量控制实验动物全价营养饲料实验动物环境及设施49环境条件(气温,气湿等)暴露药物———→机体→毒效应·化学结构·理化性质水溶性脂/水分配系数挥发度气/血分配系数·分散度·纯度/杂质·途径·时间/频率·溶剂·稀释度·交叉暴露·物种,品系·个体因素性别年龄生理状态营养/习惯疾病50八.实验动物的染毒和处置①雌雄分开饲养②5～7天的检疫（适应环境）③标记和分组。实验动物分组的原则要求所有的动物分配到各剂量组和对照组的机会均等，避免主观选择倾向，减少偏性，以保证结果的准确可靠。正确的分组方法：随机分组(一)动物实验前的准备51(二)染毒途径选择原则：应尽可能模拟人在接触该受试物的方式途径：经口、经呼吸道、经皮及注射途径1.经口(胃肠道)染毒：灌胃、喂饲和吞咽胶囊2.经呼吸道染毒：吸入染毒（静式、动式）和气管内注入3.经皮肤染毒：备皮4.注射染毒：肌肉、皮下和静脉滴注（ip）52（1）经口(胃肠道)染毒灌胃、喂饲和吞咽胶囊

喂饲：5%53(二)染毒途径选择原则：应尽可能模拟人在接触该受试物的方式途径：经口、经呼吸道、经皮及注射途径1.经口(胃肠道)染毒：灌胃、喂饲和吞咽胶囊2.经呼吸道染毒：吸入染毒（静式、动式）和气管内注入3.经皮肤染毒：备皮4.注射染毒：肌肉、皮下和静脉滴注（ip）54（2）经呼吸道染毒：55(二)染毒途径选择原则：应尽可能模拟人在接触该受试物的方式途径：经口、经呼吸道、经皮及注射途径经口(胃肠道)染毒：经呼吸道染毒：经皮肤染毒：备皮注射染毒56环境条件(气温,气湿等)暴露药物———→机体→毒效应·化学结构·理化性质水溶性脂/水分配系数挥发度气/血分配系数·分散度·纯度/杂质·途径·时间/频率·溶剂·稀释度·交叉暴露·物种,品系·个体因素性别年龄生理状态营养/习惯疾病57药物的联合作用一种药物对机体的毒性作用，可以由于同时或先后接触另一种药物而使其所表现的联合毒性比任一单一药物的毒性增强或减弱，毒理学将两种或两种以上的药物对机体的交互作用称为联合作用(jointaction)。58类型相加作用(additionaljointaction)协同作用(synergisticeffect)加强作用(potentiationjointaction)拮抗作用(antagonisticjointaction)独立作用(independenteffect)

59环境条件(气温,气湿等)暴露药物———→机体→毒效应·化学结构·理化性质水溶性脂/水分配系数挥发度气/血分配系数·分散度·纯度/杂质·途径·时间/频率·溶剂·稀释度·交叉暴露·物种,品系·个体因素性别年龄生理状态营养/习惯疾病·各种毒性反应·死亡·各种血相、生化、病理改变60(三)实验动物处死及生物标本采集1.实验动物处死方法2.血液采集3.尿液采集4.病理解剖和标本留取5.大体解剖在实验动物处死后半小时内进行，解剖方法采用胸腔、腹腔脏器联合取出法。应观察有关脏器的外形和表面情况、颜色、边界和大小、质地、切面。对指定的脏器称重，并计算脏器系数。61病理解剖标准操作程序(大体解剖)动物固定在解剖板上，解剖颈部(颌下腺、腮腺、局部淋巴结等)↓取一侧乳腺及腹部皮肤；开腹并扩展切口(胰、脾、生殖器官、肾、肾上腺、直肠、胃、十二指肠、空肠、回肠、肠系膜淋巴结、肝脏等)↓开胸(舌、喉、气管、甲状腺、甲状旁腺、食管、心、肺、胸腺)↓剥离左后肢

(肌肉、坐骨神经、股骨)；头皮、耳；开颅

(颅神经、脑组织、垂体)；暴露脊髓(取出脊髓)组织病理学检查62九.毒理学