高三生物一轮复习基础练习：基因工程的基本工具和基本操作程序

基因工程的基本工具和基本操作程序练习

一、选择题

1.某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，

将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切

割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。

下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（）

A.质粒和目的基因都用酶3切割，用£coliDNA连接酶连接

B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接

C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接

D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用£co/iDNA连接酶连接

2.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，表

示氨茶青霉素抗性基因，〃。。表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的

是（）

A.在构建重组质粒时，可用Pst\和7dli［切割质粒和外源DNA

B.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因

C.若只用Pst\处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和

反向连接

D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨节青霉素的培养基中生长

3.用氨芾青霉素抗性基因（弱射）、四环素抗性基因（足小）作为标记基因

构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶

切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下

列叙述错误的是（）

A.若用必力dlH酶切，目的基因转录的产物可能不同

B.若用酶切,在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目

的基因

C.若用SphI酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功

与否

D.若用加力I醐切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨节青霉素）和

Tet的培养基中能形成菌落

4.“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解f分离一沉淀一鉴

定。下列叙述错误的是（）

A.裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质

B.分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等

C.沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度

D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色

5.提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的泰储水并搅拌，过滤后

所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂

后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（）

A.加入适量的木瓜蛋白酶

B.37〜40℃的水浴箱中保温10〜15分钟

C.加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精

D.加入NaCl调节浓度至2mol/L一过滤一加入NaCl调节浓度至0.14

mol/L

6.下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是（）

A.用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近

B.DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂

C.预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA

D.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热

二、非选择题

7.用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类

需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性

内切核酸酶的切割位点如图所示。

GAATTCCCCGGGCTGCAGGATATC

CTTAAGGGGCCCGACGTCCTATAG

限制酶：EcoRISmaIPxlIEcoRV

回答下列问题：

⑴常用的DNA连接酶有E.co〃DNA连接酶和T4DNA连接酶。上图中

酶切割后的DXA片段可以用EcoliDNA连接酶连接。上图中

酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。

(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键

是O

(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上

有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能;质粒DNA分子

上有，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记

基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿

主细胞,方法是________________________________________________

(4)表达载体含有启动子，启动子是指

8.GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以烟

基因为材料，利用基因工程技术获得了其他颜色荧光的蛋白，丰富了

荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。

双"复制原点

G②

件

毒

索

抗

件

基

囚

①基大

⑴构建目的基因表达载体。科研人员从构建的源突变基因文库中提

取目的基因（均为突变基因）构建表达载体,其模式图如图所示（箭头为

湃突变基因的转录方向）。图中①为;②为，其作

用是_________________________________________________________

图中氨茉青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是.

⑵目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进

行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发

荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是_______

_（答出1点即可）。

⑶新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分

离纯化后，对其所含的G#突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP

基因的不同，将该67T突变基因命名为力守基因（黄色荧光蛋白基因）。

若要通过基因工程的方法探究J制基因能否在真核细胞中表达，实验

思路是

9.接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻

止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。

重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗

原（一种病毒蛋白）。回答下列问题。

（1）接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是—

（2）制备重组乙肝疫苗.时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原

基因（目的基因）导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生

素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是o能识别载

体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是o

⑶若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请

简要写出实验思路。

10.如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已

知序列两侧的序列，具体流程如图（以歹coRI酷切为例）:

染色体DNA

pG^ATTC)

ICTTAA；Q)

混合的DNA片段

仁］未知序列|已知序列|未知序列

片段F

II连接DNA连接传

已知序列、

环状DNA

IBVmITaqDNA聚占能

JPCR产物

N测序、分析I

.........................3，片段F的

完播序列

请据图回答问题:

(1)步骤I用的皮床I是一种________酶，它通过识别特定的

切割特定位点。

⑵步骤n用的DNA连接酶催化相邻核甘酸之间的3'一羟基与5,-

磷酸间形成;PCR循环中，升温到95°C是为了获得.

Tacfi^聚合醵的作用是催化__________________________________

(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤HI选用

的PCR引物必须是(从引物①②③④中选择，填编号)。

DNA序列(虚线处省略了部分核甘酸序列)

5AACTATGCGCTCATGA.......GCAATGCGrAGCCICr-3'

已知序列IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII

3-TTGATACGCGAGTACT……CGTTACGCATCGGAGA-5'

①5'-AACTATGCGCTCATGA-3'

PCR②5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3'

引物③5'-AGAGGCTACGCATTGC-3'

④5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'

(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链

序列中（虚线处省略了部分核昔酸序列），结果正确的是

A.5'-AACTATGCG——AGCCCTT-3'

B.5'—AATTCCATG——-CTGAATT-3'

C.5'-GCAATGCGT——TCGGGAA-3'

D.5'—TTGATACGC——-CGAGTAC-3'

11.PCR是以模拟体内DNA复制的方式在体外选择性地将DNA某个特

殊区域进行扩增的技术。DNA扩增过程的产物有长产物片段和短产物

片段两种，其形成过程如图1所示。请回答下列问题：

扩增区域

IIIIIIIIIIIIIMHM

5,___3'物【I

3=：5'物1、_二氏产物

原DNA第一•次循序一5片段

3

图

（DDNA复制时子链延伸的方向是（填“5’一3,”或

“3,一5'"）。由于DNA聚合酶不能直接催化两个单核甘酸之间的反

应，因此DNA复制需要一段单链DNA或RNA作为________。

⑵如果扩增序列为图2所示的两段序列之间的DNA片段，请从表中列

出的引物中选出一对合适的引物o

5'—GACCTGTGGAAGC...CATACGGGATTG—3z

3'—CTGGACACCTTCG...GTATGCCCTAAC—5'

图2

引物引物n

I

甲5'—GACCTGTGGAAGCA5'—CATACGGGATTG

乙5'—CTGGACACCTTCGB5'—GTATGCCCTAAC

丙5'—CGAAGGTGTCCAGC5'—GTTAGGGCTTAC

T5'—GCTTCCACAGGTCD5’—CAATCCCGTATG

⑶下面为某同学利用PCR仪进行PCR的操作步骤，请完善相关步骤内

容。

a.按配方准备好各组分。

b.用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分：模板DNA、4种脱氧

核糖核苻=磷酸、、引物、缓冲液等0

c.使反应液聚集在微量离心管底部。

d.将微量离心管放入PCR仪，设定好PCR仪的循环程序。

e.进行PCRo

(4)PCR的产物片段中，只有才是符合要求的目标产物。

12.为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术

构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：

构

拟

的

建bp'让:EGFP英光假门

族因

结

构

EGFPAnBl

AnBl用来抗体

士£F2片冒PCR引

FI-F物及目

FI片段「的产物

片段

基FI-R

®线性质

克Amp**>%}构史体

流

PCR产物片段与

绶性教体温合•emw

-*表示PCR用物：

相同背景方框表示

同源序列

图1

⑴分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不

同的有，扩增程序中最主要的不同是o

⑵有关基因序列如图2。引物F2—F、F1-R应在下列选项中选用

EGFP基因序列：5'ATGGTGAGCAAGGGC—GACGAGCTGTACAAGB7

AnBl基因序列：5'CATGTCCAGCTGCAG-CCAAAACCACAACCA3'

图2

A.ATGGTG——CAACCA

B.TGGTTG——CACCAT

C.GACGAG——CTGCAG

D.CTGCAG——CTCGTC

(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环

化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，

无需使用的酶主要有o

(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误

的有________o

A.稀释涂布平板需控制每个平板30〜300个菌落

B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高

C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落

D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化

(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计,用不同菌落的质粒为

模板，用引物F1—F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1〜P4的扩增产

物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有

(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测

序确认，原因是_______________________________________________

13.某小组为研究真菌基因的功能，构建了融合表达蛋白."和tag

标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题：

用物

1Tz上说同薄序”(^cccF祐同源RX

.JKVMririMi*通7G汗GKfifTk门fXfXfk仆:wimAM"

T^irrAAC^iciJiG^TCxvTMxnaKxioK^crrriAMU1从$OTTCCAGHN

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(1)目的基因的扩增

①提取真菌细胞_—___，经逆转录获得C〃物，进一步获得基因加片

段。

②为了获得融合eg标签的蛋白肌设计引物区时，不能包含基因加

终止密码子的编码序列，否则将导致

⑵重组质粒的构建

①将Sma［切开的载体力与添加同源序列的力混合，用特定〃切酶处

理形成黏性末端，然后降温以促进，形成/一勿结合体。将/

一加结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的〃相聚合酶及________

酶等，完成质粒的环化。

②若正确构建的重组质粒/一/仍能被SmaI切开，则SmaI的前切

位点可能在___________________________________________________

_____________________________________________________________________________________O

⑶融合蛋白的表达

①用含有尿嚏咤的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌,

导入质粒A—m,然后涂布于无尿啥咤的培养基上，筛选获得目的菌株，

其机理是_____________________________________________________

②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，说明

，后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。

答案：

1.C酶3切割后得到的是平末端，应该用T4DNA连接酶连接，A错

误；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是

黏性末端，二者不能连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2

切割后得到黏性末端，用T4DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在

质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正

确；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗

性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛

选，D错误。

2.D切割目的基因时，用弦加II切割会破坏目的基因，只用切

割目的基因和质粒载体，会出现目的基因和质粒的自身环化，或目的

基因和质粒的反向连接，而用心仪和切力dlH进行酶切，能确保目的

基因和质粒的正向连接，并且质粒上保留新霉素抗性基因作为标记基

因，A^C正确；在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因，至

少需保留其中的一个，B正确；用心"切割后，质粒上氨节青霉素抗

性基因被破坏了，导入重组质粒的大肠杆菌不可以在含氨苇青霉素的

培养基中生长，D错误。

3.D若用必力dlH酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，

转录的产物可能不同，A正确；若用&W酶切,重组质粒和质粒中都

有四环素抗性基因（左/），因此在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不

一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的

DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功

与否，c正确；加方I的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用加方1

酶切，会破坏四环素抗性基因，重组质粒中含氨节青霉素抗性基因

（W），因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨茉青霉素）的培养基中

能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。

4.D裂解是加蒸储水让细胞吸水涨破，释放出DNA等物质，A正确；

DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L的NaCl

溶液，将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B

正确；DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒

精沉淀出DNA,提高DNA纯度，C正确；将DNA溶解于NaCl,加入二

苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D错误。

5.A粗提取DNA时，向鸡血细胞溶液中加入一定量的蒸馄水，鸡血细

胞吸水涨破，释放内容物，过滤后DNA存在于滤液中，但DNA主要与

蛋白质结合以染色体的形式存在，所以使用木瓜蛋白酶，可以分解蛋

白质,DNA仍然存在于得到的滤液中，然后加入体积分数为95%的酒精,

使其溶解度下降，DNA析出，呈白色丝状物，A正确；保温不会分解蛋

白质，也不会析出DNA,B错误；C选项是最后析出DNA时使用，属于

提纯步骤，C错误；加入NaCl调节浓度至2mol/L,此浓度下DNA溶

解度高，溶解在滤液中，而逐渐调节NaCl浓度至0.14mol/L的过程

中，DNA溶解度下降，会析出，不会进入滤液与题干后面“得到的滤

液中加入特定试剂……”不相符，D错误。

6.A哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核和细胞器，不能提取到DNA；

鸡血细胞具有细胞核和各种细胞器，用同样方法从等体积兔血和鸡血

中提取的DNA量差异很大，A错误；为防止DNA断裂，在DNA析出过

程中搅拌操作要轻柔且沿着一个方向，B正确；DNA不溶于酒精溶液,

但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精溶液，预冷的酒精溶液可用来进

一步纯化粗提的DNA,C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会呈

现蓝色，因此，用二半胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热，D正确。

7.⑴&oRIPstI£coRISmaI、FstI、&oRV(2)

磷酸二酯键(3)自我复制限制酶切割位点用含有该抗生素的培

养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞(4)RNA

聚合酶识别、结合和驱动转录的一段DNA序列

解析(1)由题图可以看出，EcdRT、SmaT、PstT、aoRV切割

后分别形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端，£.co〃DNA连接

酶可用于连接黏性末端,T4DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端。

(2)DNA连接酶催化DNA链的5'端与另一DNA链的3,端生成磷酸二

酯键。(3)宴制原点是在基因组上复制起始的一段序列，可以保证质粒

在宿主细胞中进行自我复制。质粒上有限制酶切割位点，该位点可被

限制酶切开并使外源目的基因插入其中。若质粒DNA分子上有某种抗

生素抗性基因，则可以用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够

存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。⑷启动子是RNA聚合酶识别和

结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需要的蛋

白质。

8.(1)终止子启动子提供RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动

07突变基因转录出mRNA将含有表达载体的细胞筛选出来(2)GFP基

因虽然发生了突变，但由于存在密码的简并现象（密码子的简并），突

变基因所编码的氨基酸序列并未改变（3）将次P基因插入表达载体,再

将构建成功的重组表达载体导入不能发黄色荧光的真核细胞中，观察

黄色荧光是否出现

解析（1）从图中可以知道，转录方向是顺时针，所以①为终止子，②

为启动子，启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因的转录。

而标记基因是为了鉴证受体细胞中是否含有表达载体，从而将含有表

达载体的细胞筛选出来。（2）基因突变，但是性状不改变的情况，有多

种可能，如因为非编码区改变，但是编码区不变导致mRNA不变，或者

由于密码子的简并导致氨基酸序列不变等等。（3）用基因工程将目的基

因导入真核细胞，检测是否发黄色荧光即可。如以酵母菌为受体菌，

以〃产为目的基因，通过基因工程技术，观察导入基因表达载体后的

受体酵母菌是否可以发黄色荧光。

9.（1）疫苗中不含乙肝病毒DNA（2）用于筛选含有重组表达载体的细胞

RNA聚合酶（3）从酷母细胞中提取蛋白质，再用相应的抗体进行抗原一

抗体杂交，检测是否出现杂交带

解析（1）重组乙肝疫苗的主要成分是乙肝病毒表面的一种病毒蛋白。

蛋白质注入人体后，无法完成病毒遗传物质的复制与蛋白质的合成，

无法独立增殖。（2）抗生素抗性基因作为标记基因，用于重组表达载体

的筛选。RNA聚合酶识别目的基因启动子并驱动转录。（3）检测目的蛋

白在宿主细胞中是否表达。要从细胞表达的众多蛋白中检测目的蛋白，

通常采用抗原一抗体杂交的实验方法。因此，要检测目的蛋白在酵母

细胞中是否表达，首先需要提取酵母细胞的总蛋白，然后用特异性抗

体进行杂交，若出现杂交带，则说明酵母细胞表达了目的蛋白。

10.（1）限制性内切核酸（或限制）核甘酸序列⑵磷酸二酯键DNA

单链以DNA为模板的DNA链的延伸（3）②④（4）B

解析（1）根据题图可知，步骤1是获取目的DNA片段,所用的AoRI

是一种限制酶，其能识别特定的核甘酸序列，并使每一条链中特定部

位的两个核甘酸之间的磷酸二酯键断开。⑵步骤II是将目的DNA片段

连接成环状，其中DNA连接酶的作用是催化相邻核甘酸之间的3'-

羟基和5,一磷酸间形成磷酸二酯键。PCR循环中，升高温度到95°C

是为了打开氢键使双链解旋，获得DNA单链，AqDNA聚合酶的作用是

催化游离的脱氧核甘酸连接到引物3'端，合成DNA子链。（3）引物的

作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始延伸DNA子链,因为DNA

的合成方向总是从子链的5'端向3,端延伸，故为扩增未知序列，选

择的与模板链相结合的引物应为5'—TCATGAGCGCATAGTT—3'（引物

④）和5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3（引物②）。（4）分析题意可知，片

段F的两端为限制酶历oRI切割后产生的黏性末端，因此其5'端序

列应为一AATT,3,端序列应为一TTAA,B正确.

11.（1）5'-3'引物（2）甲和D（3）b.耐高温的DNA聚合酶c.离心

（4）双链短产物片段

解析（l）DNA复制时子链延伸的方向是5'-3'。由于DNA聚合醐不

能直接催化两个单核苜酸之间的反应，因此DNA复制需要一段单链DNA

或RNA作为引物，当引物与模板链结合后，单个的脱氧核甘酸才能结

合上来。（2）引物与DNA的模板链的3'端能够配对，如果扩增序列为

图2所示的两段序列之间的DNA片段，则根据碱基互补配对原则，最

合适的引物为甲和D。（3）PCR是在体外进行DNA复制的技术。该过程

需要模板、原料、引物、耐高温的DNA聚合酶等。离心使反应液聚集

在微量离心管底部。（4）DNA是双链，PCR的产物片段中，只有双链短

产物片段才是符合耍求的目标产物。

12.⑴模板、PCR引物延伸时间（2）CD（3）限制性内切核酸酶（限

制酶）和DNA连接酶（4）ABC（5）P3、P4（6）琼脂糖凝胶电泳技术仅

能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基

序列

解析（l）PCR反应进行的条件：引物、酶、4种脱氧核昔酸、模板和

缓冲液（其中需耍M/+）。分别进行PCR扩增片段Fl与片段F2时，配

制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物。扩增程

序中最主要的不同是延伸时间不同。（2）由图1可知，F2—F与F1-R

互补，因此选项中B一组，C、D一组，再由图1可知，F2—F与

F1片段（况用基因序列3'端）部分相同，与F2片段（而用基因序列5'

端）部分互补，即C项端ACGAG”与跖空基因的“5'-GACGAG-3'”

同,“5’一CTGCAG—3'”与基因序列的“一5'CTGCAG—3,”

互补，F1-R与F2片段（力〃引基因序列5'端）部分相同,与F1片段

（仇管基因序列3'端）部分互补，即D项符合。（3）传统重组质粒构建

需要使用限制性内切核酸酶（