基因工程资料

第一章

1、基因工程：是通过对基因的操作来定向改变或修饰生物体或人类自身，并具

有明确应用目的的活动。被操作的对象一般会发生遗传信息或遗传改善的变化，

并具有稳定的遗传性。

2、供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。

3、基因工程的工具有哪些？P7

（1）基因操作的车间---大肠杆菌Escherichiacoli和病毒

（2）获得基因片段的工具一限制性核酸内切酶

（3）连接基因片段的工具一连接酶

（4）基因操作的载体——质粒和病毒

第二章

连接酶只能封闭缺口（nick）,不能连接裂口（gap）o

限制性内切酶造成粘性末端，有利于重组DNA分子的构建

4、限制性内切酶的概念：

是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核甘酸序列，并由此切割DNA双

链结构的核甘酸内切酶。

分子克隆工具酶：限制性内切酶、甲基化酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、连接

酶、磷酸激酶和磷酸酶

5、命名方法：限制性内切酶的命名

属名种名株名

Haemophilusinfluenzaed嗜血流感杆菌d株

HindIIIHindIII

同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶

EscherichiaColiRy13

EcoRI

/丁w

工名种名株系缢号

若种名头2个字母相同

则其中一个可用种名的组一和第三个字母.

6、限制与修饰系统的种类：根据酣的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要

辅助因子，限制与修饰系统可分为三类（i,n,in）,也可分为四类（多了一个i【s,即

n亚类）。一般所说的限制随，特指U型限制酶，因为只有这一类具有使用价值。

7、各种限制与修饰系统的比较

II1III

酶蛋白结构同源二聚体异源三聚体异源二最体

识别位点4〜6bp,二分非对称5-7bp,非对称

大多为回文对称TGANaJGCTGAGCC

AACN6GTGCCAGCAG

切割位点识别序列内或附近识别序列IKB识别序列下游

特异切割处，随即切割24~26bp

限制修饰分开的反应互斥同时克争

22

辅助因子Mg2"ATP/Mg*/ATP/Mg"/SAM

SAM

型限制与修饰系统所占比例最大，达93%

限制酶产生的末端

1.产生匹配的黏末端-回文对称序列，内部切割，产生的末端相同且互补

2.产生非对称突出末端-切割序列为非对称序列，产生非对称的突出末端

3.平末端一切割回文对称序列，产生平末端-5'黏末端和3'黏末端

8、同尾酶、同裂酶和归位内切酶的末端判断

同裂酶一一来源不同，识别相同的序列

（1）同序同切醐一一识别序列和切割位置都相同

・HindII与HineII识别切割位点为GTYIRAC

・HpaH与HapII识别切割位点为ClCGG

•MobI与Sau3AI识别切割位点为IGATC

•有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同

（2）同序异切酶一一识别序列相同，切割位置不同

•KpnI：GGTACIC

•Acc65I：GIGTACC

・Asp718I：GIGTACC

（3）同功多位一一识别简并序列的限制酶包含

了另一种限制酶的功能

・EcoRI：GIAATTC

•ApoI：RIAATTY

•HpaI：GTTIAAC

・HineII：GTYIRAC

（4）其他一一限制酶识别序列相互交叉

•SalI：GITCGAC

•AccI：GTIMKAC

・HineII：GTY>RAC*5.同尾酶——来源不同，识别序列不同，但

产生黏末端相同

5,-GGATCC-3,

3'-CCTAGG-5'

BamHI

5,-TGATCA-3,

3,-ACTAGT-5,

BelI

5,-AGATCT-3,

3'-TCTAGA-5'

Bglll

产生相同的5'GATC粘性末端・杂种位点(hybridsite)------由一对同尾酶

分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。

­一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。

•BamHI：GGATCCBelI：TGATCA

・CCTAGGACTAGT

・杂种位点：GATCC(BamHI)

•CTAGT(BelI)经同尾酶消化的DNA末端连接示意图省略

BamHIBglII*6.归位内切酶----1-prefix和pl-prefix系列酶

-有些线粒体、叶绿体、核DNA、T偶数噬菌体

含有一些编码内切酶的内含子，有些intein

(proteinsplicingelement)也TT内切酶的活性，这两类内切核酸酶称为I

prefix和pl-prefix系列内切酶，它们识别的序列很长。

-I-prefix是由在RNA水平上剪切和编码的

-pl-prefix在蛋白质水平上剪切的产物。

9、位点偏爱：某些限制酶对同一底物中的有些位点表现出偏爱性切割，即

对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。

某些噬菌体DNA中的某些相同的酶切位点对酶的敏感性是不同

EcoRI：5个位点，并不是随机切割，靠近右端的位点比分子中间的位

点切割快10倍

SacII：三个在中央，一个在右臂，对中央三个位点的酶切速度快50倍

原因：

-切割DNA之前需要同时与两个识别位点作用・Nar1,NaeI和SacII

-切割DNA要求作用的DNA序列上有两个明显不同的结合位点，其中一个

是为DNA切割激活另一个的变构位点(allosteric)*BspMI、EcoRII和Hpa

II

10、酶切反应条件

1.缓冲液

-常规缓冲液一般包括提供稳定pH值的缓冲剂、Mg++、DTT(二硫苏糖

醇)以及BSA(小牛血请白蛋白)。

2.反应温度-大多数为37℃,一部分为50-65℃,少数25-30C

-高温作用酶在37℃下的活性会下降，多数仅为最适条件下的1()-50%

3.反应时间

-反应时间通常为1小时或更多，许多酶延长反应时间可减少酶的用量

-EcoRI若反应16小时，所需酶量为正常酶切时间的1/8

-HindHI为1/8；KpnI为1/4：BamHI为1/2

终止酶切的方法

-EDTA可整合镁离子，从而可终止酶切反应，终止浓度为10mM

(3)；「□I□□□□「：，(a)双链的DNA分子

5r।34

(b)/"FTII□□□IT>(b)DNaseI产生带有3：0H末端

i的单链缺口

>1

(C)5"-口।।।।।।「3(C)爽合酶I从5p移去一个核昔酸

,I5，

(d)5,————————3'(d)聚合醉I将32P标记的核甘酸

3'III1IIII1III5'插入,取代被移去的核昔酸

(e)重复(c)(d)的步骤，切口沿5'―3'

⑹.□□□|口|T7~”方向移动，形成32P标记的核

昔酸合成的DNA链

二、KlenowDNA聚合酶

Klenow片段是大肠杆菌聚合酶I全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片

段肽段，分子量为76kD。活性;5'-3，的聚合酶活性、3，-5，的核

酸外切酶活性

1.补平DNA的3'凹端2.抹平DNA的3'凸端3.通过置换反应对DNA

进行末端标记4.随机引物标记5.在cDNA克隆中合成第二链；在体外诱

变中，用于从单链模板合成双链DNA

三、反转录醐

反转录酶即依赖于RNA的DNA聚合酶。它来自AMV(禽成髓

细胞瘤病毒)或Mo-MLV(Moloney鼠白血病病毒，又称M-MuLV)。

活性：

依赖于RNA的DNA聚合酶活性：可以有效地将mRNA反转录成DNA,其

产物称为cDNA(complementaryDNA)；RNaseH活性：水解DNA-RNA杂合

链中的RNA分子；

依赖于DNA的DNA聚合酶活性。主要用途是将mRNA转录成cDNA以制

备基因片段。

,14、限制性内切酶切割DNA后产生的末端有哪些类型？

限制酶在识别序列内部切割DNA分子，可产生3种不同的末端：平末端，5'・

突出末端，3'•突出末端。(一)平末端Haem(GG1CC)EcoRV(GAT1ATC)(二)

毡鳏端大多数限制酶交错切割DNA双链产生5'.突出末端或3'-突出末端。

15、连接酶的功能：

⑴能封闭DNA双链或RNA/DNA杂种双链中的单链缺口，而不能封闭双链RNA

中的单链缺口⑵能封闭粘性末端退火后出现的缺口；

用途：

⑴通过粘端连接DNA分子；(2)连接平端双链DNA分子或平端DNA与人工接

头的连接。

T4连接酶反应底物为粘端、切口、平末端的RNA(效率低)或DNA

T4DNA连接酶包括分子间连接和分子内连接

由T4噬菌体产生，以ATP作为辅助因子。可修复双链DNA上的单链缺口；连

接RNA-DNA杂交双链上的DNA链缺口或RNA链缺口；连接完全断开的两个

平头末端DNA分子。是基因工程中最常用的连接酶，可以从厂家直接购买。

连接反应最佳温度为37C,但是此时粘性末端间氢键结合不够稳定，而且酶活

性也会迅速降低。比如，EcoRI粘性末端连接部位只有4个碱基对，很容易断开。

所以通常在4~16℃连接。

影响连接效率的因素有：A.温度B.ATP的浓度C.连接酶浓度(平末端较粘性末

端要求高)D.反应时间(通常连接过夜)E.插入片段和载体片段的摩尔比

平末端DNA之间的连接。平末端DNA之间也可用T4DNA连接酶连接，但反

应速度要慢得多。加大酶和底物的浓度，或者加入适量的一价阳离子(Na+)和低

浓度的PEG,从而提高T4DNA连接酶的连接效率。

大肠杆菌DNA连接酶所连接的是粘性末端，平末端效率低P34

16、碱性磷酸酶的用途：防止载体。自连其主要用途有：⑴在用32P标记DNA5'

端之前，去除5'端的磷酸；⑵在DNA重组技术中，去除DNA片段的5'磷酸,

防止载体的自身环化，提高重组子比例。

第三章

供体、受体、载体是重组DNA技术的二大基本元件。质粒(Plasmid)是染色体外

的遗传因子，能进行自我复制，多为超螺旋共价、闭合、环状双链DNA(cccDNA),

少数线状。大小1〜200kb携带多种特殊功能基因。

17、质粒的特性

质粒(plasmid):独立于染色体外的裸露的双链环DNA分子。常有1〜3个抗药

性基因，以利于筛选。

根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异,可以分

离纯化质粒。

最常用的方法是碱裂解法：在碱性条件(pH12.5)下，线性染色体DNA的双

螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，

紧密结合在一起。

当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子

很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则

留在上清液中。用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA,实

验室使用的质粒提取试剂盒一般也是根据碱裂解法来提取质粒。

1.质粒的复制

质粒DNA含有自己的复制起始位点(Origin,简称ori)以及控制复制频率

的调控基因，有些质粒还携带特定的复制因子编码基因，形成一个独立的复

制子(Replicon)。

在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制的方

式，如滚环复制和复制。在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源

于pMBl质粒或ColEl质粒的复制起始位点。

2.质粒的拷贝数

a八质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。b严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，

大约1〜几个；c松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。

3.质粒的不相容性

两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。它是指在第二个

质粒导入后，在不涉及DNA限制系统时出现的现象。不相容的质粒一般都利用

同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。两个不相容性质粒在同一个细

胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放

大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。而不相容群指那些具有不相容性

的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子。在大肠杆菌中现已发现30多

个不相容群,如ColEl和pMBl,pSClOl和pl5Ao

4.转移性。质粒具转移性。它是指在自然条件下，很多质粒可以通过细菌接

合作用转移到新宿主内。它需要移动基因mob,转移基因tra，顺式因子bom及

其内部的转移缺口位点nico

18、标记基因按其用途可将标记基因分为选择标记基因和筛选标记基因。

选择标记用于鉴别目标DNA(载体)的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来

筛选标记可用于将特殊表型的重组子挑选出来

选择标记基因

(1)氨苇青霉素抗性基因

青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转肽反

应。氨节青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌进入细菌的周质区，抑制转肽

反应并催化-内酰胺环水解，从而解除了氨苇青霉素的毒性。

⑵四环素抗性基因

四环素可与核糖体30s亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。四环素

抗性基因编码一个由399个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。

PBR322质粒除了带有氨苦青霉素抗性基因外，还带有四环素抗性基因。

⑶氯霉素抗性基因

氯霉素可与核糖体50s亚基结合并抑制蛋白质合成。目前使用的氯霉素抗性基因

来源于转导性P1噬菌体(也携带Tn9)ocat基因编码氯霉素乙酰转移酣，一个

四聚体细胞质蛋白(每个亚基23kDa)o在乙酰辅酶A存在的条件下，该蛋白催

化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与核糖体结合。

(4)卡那霉素和新霉素抗性基因(kanr,neor)

卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺氮基糖甘，都可与核糖体结合并抑制蛋白质

合成。卡那霉素和新霉素抗性基因实际就是一种编码氨基糖昔磷酸转移酶

[APH(3')-H,25kDa]的基因。氨基糖昔磷酸转多酶可使这两种抗生素磷酸化，

从而干扰了它们向细胞内的主动转移。在细胞中合成的这种酹可以分泌至外周质

腔，保护宿主不受这些抗生素的影响。

2、筛选标记基因

(1)a-互补(Q-complementation)a-互补是指lacZ基因上缺失近操纵基因

区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的一半乳糖甘酶(

galactosidase,由1024个氨基酸组成)阴性的突变体之间实现互补。a-2补

是基于在两个不同的缺陷一半乳糖甘酶之间可实现功能互补而建立的。

(2).插入失活。通过插入失活进行筛选的质粒主要有pBR322该质粒具有四环

素抗性基因(tetr)和氨苇青霉素抗性基因(ampr)两种抗性标记。当外源DNA片段

插入tetr基因后，导致tetr基因失活，变成只对氨茉青霉素有抗性。这样就可通

过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。

19、质粒载体的种类：克隆载体与表达载体

1.克隆载体克隆载体主要用于扩增或保存DNA片段，是最简单的载体。

⑴pBR322质粒(2)pUC18和pUC19(3)pUC118和pUC119质粒或体

(4)pGEM-3Z/4Z质粒载体注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA

编码的RNA聚合醯所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶,

如：E.coliBL21(DE3)等

2.表达载体

该类载体是在常规克隆载体的基础上衍生而来的，主要增添了强启动子，以及有

利于表达产物分泌、分离或纯化的元件。

一个理想的载体，应具备以下条件：

(1)能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制子和启动子，使插入基因

复制和表达；

(2)具有多种限制性内切酶的切点，且切点是单一的，这样可将多个外源DNA

片段插入其中；

(3)具有容易检测的筛选标记；

(4)载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段，又可在受体细胞

内扩增较多的拷贝；

(5)在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而不易丢失。

20、表达载体的特征：在宿主细胞内必须能够自主复制(具备复制原点)；必须

具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，同时不影响其复制；有一定的选

择标记，用于筛选。另外有一定的拷贝数，便于制备。有时还有其他附加因素，

如MSC、lacZ，(a_互补)、单链噬菌体的复制起始和终止位点、启动子和入噬菌体

的cos位点等。

21、代表性噬菌体载体：插入型载体与取代型载体

噬菌体只有进入裂解循环，才能大量扩增。因此，入噬菌体只有在特定的大扬杆

菌菌株中进入裂解周期，才能用作载体。入噬菌体载体必须含有裂解生长所必需

的基因或DNA片段。根据切除入噬菌体DNA的多少，可将入-DNA分成两大类

载体：通过特定的酶切位点允许外源DNA插入的载体称为插入型载体；允许外

源DNA片段替换非必需DNA片段的载体称为取代型载体。

四、噬菌体载体的克隆原理及步骤

噬菌体载体属于克隆载体，主要用于克隆DNA片段。构建cDNA文库和基因组

文库，并从中筛选目的基因是入噬菌体载体的一般用途，也可用于亚克隆在大容

量载体中增殖的外源DNA片段。注意：入噬菌体载体作为载体，只有DNA处

于36.4-50.9kb范围内才可被包装。

体外包装：入噬菌载体+尾部蛋白+头部蛋白

入-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因

22、M13噬菌体P60——61M13噬菌体属丝状噬菌体，其基因组为闭合环状正

链ssDNA,6407bp,其中90%的DNA都编码蛋白质，有11个基因，有两个

较长的间隔区，是外源基因插入的部位。M13噬菌体颗粒是丝状的，只感染具

有F因子的大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出

噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。M13噬菌体载体①M13噬菌体的

感染与释放不会杀死宿主菌，仅导致宿主菌生长缓慢；②M13噬菌体DNA在宿

主菌内既可以是单链也可以是双链，通过感染或转化的方法能将M13噬菌体

DNA导入宿主菌中；③M13噬菌体的包装不受DNA大小的限制，其噬菌体颗

粒的大小可随DNA的大小而改变，即使DNA的大小比本身DNA的大小超出6

倍，仍能进行包装。粘粒载体P75

23、噬菌粒P67噬菌粒是一类人工构建的含有丝状噬菌体大间隔区以及质粒复制

子、克隆位点、标记基因的特殊类型的质粒载体。间隔区含有噬菌体DNA合成

的起始与终止及噬菌体颗粒形态发生所必需的全部顺式作用元件。含噬菌粒的细

菌被噬菌体感染后，基因II蛋白可作用于噬菌粒的间隔区，启动滚环复制，产

生单链DNA并包装。

噬菌粒载体的特点：①双链DNA既稳定，又高产，具有常规质粒的特征。②免

除了将外源DNA片段从质粒亚克隆于噬菌体这一繁琐的步骤。③由于载体足够

小，故可得到长达10kb的外源DNA区段的单链。能像M13-DNA那样体外包

装，并高效转染受体细胞能像质粒那样在受体细胞中自主复制装载量比常规的

M13mp系列要大很多(10kb)

通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA重组操作简便,筛选容

易

四种常用载体的比较

单住理前

质粒入联豳体柯斯质粒

体

克隆D、A大片段++-

构建基因组文库-++-

构建文库+---

常规的亚克隆化+---

构建新型的结构+---

月5列分析+一一+

明探针一一+

外源基因在大曲杆葡中的+--一

我达

*外源DNA如超过10kb,则重组质粒的转化率和DNA得率都非常低**已

有个别材料可用于此目的

24粘粒的概念：质粒的衍生物，是带有Cos序列(也称cos位点)的质粒。

Cos序列是入噬菌体DNA中将DNA包装到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。

黏粒含1tTffii粒复制起点(ColE)、抗生素抗性标记基因(ampr)、cos位点，可

像质粒一样转化和增殖。黏粒大小一般为5~7kb,可克隆大片段DNA,克

隆的最大片段可达45kbo

25、酵母人工染色体载体酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)

是一类酵母穿梭载体，具有酵母的复制元件(ARS,CEN,TEL)、克隆位点以及

可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。此外，YAC还具有酵母菌染色体的一

些特点。可以接受l()()-l()()()kb的外源DNA片段。

一、YAC载体的复制元件和标记基因：YAC载体应含有下列元件1、酵母

染色体的端粒序列2、酵母染色体的复制子3、酵母染色体的着丝粒序列4、

酵母系统的选择标记

5、大肠杆菌的复制子标记6、AC载体的装载量为250-400Kb

人工染色体必须具备哪几个元件？

三个元件：DNA着丝点、端粒和复制起始位点

第五章

表达系统一般包括表达载体及相应的宿主菌株。

表达载体除了提供复制属性(无论是自主复制还是整合到基因组中)外，主要

是形成一种表达所必需的环境，包括启动子、终止子、核糖体结合位点，以

及增强子和剪切信号等，此外还有一些与表达产物的分离纯化有关的遗传信

号。

26、大肠杆菌表达载体都是质粒载体，首先具有克隆载体的特征，在此基础

上增加表达元件即得表达载体。

一个表达载体含有启动子、RBS、终止子、克隆位点、大肠杆菌复制起始位

点、标记基因等元件。

常用的启动子分三类，即lac启动子、trp启动子和它们的杂合启动子tac或

trc,都受IPTG诱导。

T7噬菌体启动子、入噬菌体的PL启动子。P87具体

噬菌休启动子PL的可控性：噬菌休启动子PL受CI阻遏蛋白阻遏，很难

直接诱导控制。在基因工程中常使用温度敏感型的cl突变基因CI857控制

PLoCI857阻遏蛋白在42c时失活脱落，PL便可介导目的基因的表达，但

在大型细菌培养罐中迅速升温非常困难，因此常使用一个双质粒控制系统，

用色氨酸间接控制目的基因表达。

阻遏作用

控性:

目的基因

P,

重点看图P89

1、T7噬菌体启动子只能由T7噬菌体的RNA聚合酶识别，大肠杆菌的RNA

聚合酶无法识别。将T7RNA聚合酶基因(T7gene1)置于lacUV5启动子之后，

构建噬菌体，再将此噬菌体整合到大肠杆菌基因组，得到大肠杆菌

BL21(DE3)O将pET表达载体导入大肠杆菌后，因为大肠杆菌的lacl基因产

生阻遏蛋白，lacUV5启动子无法启动T7RNA聚合酶转录，T7启动子也就

无法启动。如果在大肠杆菌中再引入一个带有T7噬菌体的溶菌酶编码基因

的质粒，如pLysS或pLysE,它们表达的T7溶菌酶可抑制T7RNA聚合酶

的活性，进一步防止在未添加IPTG时T7启动子激活。

2、通过宿主控制T7RNA聚合酶的量来实现的，即在宿主细胞中引入一个

带有T7噬菌体的溶菌酶编码基因的质粒，如pLysS或pLysE,它们分别低

量和高量表达T7噬菌体的溶菌酶。该溶菌酶可抑制T7RNA聚合酶的活性,

从而减少在未诱导情况下外源基因的表达。使启动子的控制效应更严谨。在

pET载体上装载lacI基因，提高阻抑物的浓度。也可利用T7-lac启动子(在

T7启动子序列下游装入一个由25bp组成的lacO操纵子序列)，当阻抑物结

合在lacO位点时，即使存在T7RNA聚合酶，外源基因也无法表达。只有

当诱导物存在时，才能解开T7RNA聚合酶基因和外源基因表达的双重阻遏。

图3-33,大胸杆菌中T7启社子秘调控模趣心

27、穿梭载体的概念：

穿梭载体(shuttlevector)是能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体，

如有些载体既能在原核细胞中复制又能在真核细胞中复制，或能在E.coli中

复制又能在革兰氏阳性细菌中复制。这类载体主要是质粒载体。

整合载体的概念：

整合载体是一类缺乏特定宿主复制起始序列的载体，此类载体导入特定宿

主后不能自主复制，只有在整合到宿主染色体中的情况下载体上的基因才能

遗传给子代。

第六章

碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA是最常用的方法。原理见P100

原理：

在pH高达12.5的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开

而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互

补链不会完全分离。

当以pH4.6的KAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢

复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状

结构。通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质

粒DNA尚在上清中，再用酚/氯仿抽提进一步纯化质粒DNAo

28、

二、DNA的琼脂糖凝胶电泳：

凝胶电泳的基本原理：一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向

适当的电极。它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。就是

说，电场强度越大，

电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度越快，反之则较慢。

琼脂糖凝胶特点：

天然琼脂(Agar)是一种多聚糖，主要由琼脂糖(Agarose,约占80%)及琼

脂胶(Agaropectin)组成。

琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。

琼脂胶是•种含硫酸根和竣基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在

电场作

用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速

度及

分离效果。

琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电

泳。

注：片段越大，凝胶的浓度越小

核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系：不同构型DNA的移动速度依次为：

共价闭环超螺旋DNA(cccDNA)>直线DNA(L-DNA,2条链发生断裂)〉开环

的双链环状DNA(ocDNA,1条链发生断裂)。

三、聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N,N'■亚甲双丙烯酰胺聚合而成的高分子聚

合物。一般在变性条件下使用，主要用来检测小分子核酸的大小，或在同位素标

记的情况下分析单链核酸。

特点：

分辨率高、适于寡聚核昔酸及DNA序列分析，DNA<500bp.载样量大、回收

DNA纯度高四、脉冲场凝胶电泳

在一定范围内DNA电泳速率与其相对分子质量的对数成反比关系；当DNA片

段超过40kb后，在常规凝胶电泳中的泳动速率主要与电场强度有关，而与相对

分子质量的关系不显著。因此，常规凝胶电泳无法将大片段DNA按相对分子质

量区分开。脉冲场凝胶电泳(PFGE)可有效地分离天片段DNA,如5()kb或10()kb

以上，甚至Mb级的人片段DNA,广泛应用于染色体分析和作图。

29、

一、控制潜在RNA酶的活性的方法

1.溶液和用具的去RNA酶处理：RNA酶无处不在，且耐热性极强，即使

高温灭菌也无法完全使其失活。用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水浸

泡后再灭菌，或购买无RNA酶污染的用具。时于电泳用具最好使用专用的，

不要用于其它分析•，在使用之前用洗涤剂洗涮干净，再用3%H2O2和().1%

DEPC处理的水浸泡，清洗干净。

2.RNA酶抑制剂的使用

为了进一步防范RNA降解，一般在RNA样品和RNA反应中加入RNA

酶抑制剂，现在应用较多的是蛋白类抑制剂，如人胎盘RNase抑制剂，除

此之外，还有氧铜核糖核昔复合物(完全抑制剂，且抑制体外翻译)和硅藻土

(吸附

RNase吸附剂)。

1.琼脂糖凝胶电泳

通过琼脂糖凝胶电泳进行RNA分析和DNA分析的原理是类似的。不同

的是，RNA分析是在变性的条件下进行的。常用的变性剂为甲醛，也可使

用氢氧化甲基汞和乙二醛-二甲基亚飒(DMSO)。

2.聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用来分析小分子量的单链核酸，如小分子量

RNA寡核甘酸、

DNA序列分析等。其变性条件可用加热方式，或使用尿素等变性剂。

29、分子杂交是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用已知标

记的核酸分子或蛋白质分子检测混合样品中大知核酸分子或蛋白质分子，以

及其相对分子量大小。

(1)根据其检测对象的不同可分为Southern杂交、Northern杂交和

Western杂交，及由此简化的斑点杂交，狭线杂交和菌落杂交。

3()、Southem杂交DNA、northern杂交RNA、western杂交蛋白质Pl()7

31、探针的概念：当用一个标记的核酸分子与核酸样品杂交，便可查明该样

品中是否存在于该标记核酸分子具有同源性的核酸分子。这个标记的核酸分

子称为探针。

感受态概念：

感受态(competence):细胞处于能够吸收DNA的状态，称为感受态。

感受态细胞(competentcell)是处于能够吸收DNA状态的细胞。

32、氯化钙转化法的实验步骤：P115电转化法P115

1、CaC12转化法

大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，自然条件下很难进行转化，其主要原因

是转化因子的吸收较为困难。在基因工程研究和应用中，转化受体菌细胞

的是根据人们需要构建的外源重组质粒DNA分子，而非来自供体菌的游离

DNA片段(转化因子)。

因此在大肠杆菌的转化实验中，很少采取自然转化的方法，通常的做法

是首先采用人工的方法制备感受态细胞，然后进行转化处理，其中最有代

表性的方法是Ca2+诱导的大肠杆菌转化法。

2、电穿孔法(electroporation):通过仪器产生一个较大的电脉冲，短暂破坏细

胞膜的脂质双层，从而允许DNA等分子通过细胞膜进入细胞，而后细胞膜

快速复原，保持细胞的完整。这种方法称为电穿孔法。用于电穿孔的受体细

胞也必须处于“感受态”，受体并不是处于一种特殊的生理状态，而是指清

洗处理，即在低温下使细胞处于无离子且有甘油或蔗糖等保护剂的悬液中。

无离子使细胞悬液的电阻最大化，保证在电击过程中细胞不被击穿死亡。甘

油或蔗糖可维持细胞的渗透压，保护细胞使之不易裂解。

大肠杆菌感受态细胞的氯化钙法制备原理。

(感受态(competence):细胞处于能够吸收DNA的状态，称为感受态。感受

态细胞(competentcell)是处于能够吸收DNA状态的细胞。)细菌处于0℃和低

渗氯化钙溶液中，菌细胞壁和膜通透性增加，菌体膨胀成球形，此时转化混合物

中DNA形成抗DNase羟基-磷酸钙复合物粘附于用胞表面，经短暂热休克(42℃)

后，细胞膜形成许多间隙，DNA便趁机进入细胞内。

第7章

凝胶阻滞实验ElectrophoreticMobilityShiftAssays(EMSA)

研究DNA与特异性蛋白的相互作用：将放射性标记的DNA片段与纯化蛋白(或

提取物中的蛋白混合物)相结合，然后在非变性凝胶中分析该产物。与游离DNA

相比，蛋白-DNA复合物的迁移率将降低。与游离DNA相对应，结合的DNA泳

动受到“阻滞”

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是由双链RNA分子在mRNA水平关闭相应

序列基因表达或使其沉默的过程。

RNAi技术又被称为基因敲除或基因沉默或转录后基因沉默(PTGS)。

RNAi作用的机制：

长链dsRNA被切割成2()〜25个核甘酸⑵)〜25nt)长短的片段，即小干扰

RNA(smallinterferenceRNA,siRNA)。siRNA与核酸诱导的沉默复合物(RNA

inducedsilencingcomplex,RISC)结合，作为模板识别目的mRNA。通过碱基互

补配对原则，mRNA与siRNA中的反义链结合，置换出正义链。双链mRNA被

相关酶切割产生22nt左右的siRNA,后者与RISC结合，继续反复切割mRNA,

从而使基因沉默。

第8章

PCR的原理与反应体系组分。

首先待扩增DNN模板加热94摄氏度变性解链，随之将反应混合物冷却至55

摄氏度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高至72摄氏度

使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性•复性•延伸的过程就是一

个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。

反应体系组分：(-)模板；模板是包含待扩增序列的核酸分子，DNA或RNA均

可。(二)引物；引物是与模板中待扩增DNA的3'5'端特异性结合的寡核昔酸

片段。(三)热稳定DNA聚合酶：TaqDNA聚合酶TthDNA聚合酶PfuDNA聚合

酶商用混合酶(四)脱氧核昔三磷酸：脱氧核昔三磷酸是DNA合成的底物(五)

缓冲系统(六)一价阳离子(七)二价阳离子(八)PCR促溶剂

PCR扩增的步骤：P134变性——退火——延伸。DNA聚合酶的保真性高低的

比较P136——P137

反向PCR：是用反向的互补引物来扩增两引物以外的D