生物制药纯化层析技师考试试卷及答案

生物制药纯化层析技师考试试卷及答案填空题（每题1分，共10分）1.层析法根据分离原理可分为吸附层析、分配层析、______、亲和层析等。2.离子交换层析中，带负电的蛋白质在阴离子交换柱上的保留能力随pH升高而______（增强/减弱）。3.亲和层析的核心是利用配体与目标分子的______相互作用。4.凝胶过滤层析（分子筛）中，分子量越大的分子洗脱体积越______。5.层析柱的柱效常用______数表示。6.疏水相互作用层析（HIC）通常在______盐浓度下上样（高/低）。7.蛋白A亲和层析常用于纯化______类抗体。8.层析系统中，检测蛋白浓度常用的波长是______nm。9.反向层析（RPC）中，流动相常用的有机溶剂是______。10.层析柱装填后，需进行______验证柱效和分离度。答案1.离子交换层析2.增强3.特异性4.小5.理论塔板6.高7.IgG8.2809.乙腈（或甲醇）10.柱效测试单项选择题（每题2分，共20分）1.下列哪种层析最适合纯化重组蛋白中的内毒素？A.离子交换层析B.亲和层析C.疏水相互作用层析D.凝胶过滤层析2.离子交换层析中，缓冲液pH与蛋白pI的关系是：A.pH=pI时蛋白带负电B.pH>pI时蛋白带负电C.pH<pI时蛋白带负电D.无关3.凝胶过滤层析中，不能用于分离的是：A.蛋白单体与二聚体B.不同分子量的多肽C.相同分子量的蛋白D.蛋白与核酸4.亲和层析中，洗脱目标蛋白常用的温和方法是：A.高盐B.改变pHC.变性剂D.有机溶剂5.疏水相互作用层析中，常用的高盐缓冲液是：A.NaClB.(NH₄)₂SO₄C.KClD.Na₂SO₄6.下列哪种层析属于分配层析？A.反向层析B.离子交换C.凝胶过滤D.亲和7.层析柱的保留时间（tR）与死时间（t₀）的关系是：A.tR=t₀B.tR>t₀C.tR<t₀D.不确定8.蛋白A亲和层析的配体是：A.蛋白AB.IgGC.抗原D.抗体9.下列哪种方法可提高层析分离度？A.增加柱长B.提高流速C.降低温度D.减少进样量10.离子交换层析中，阳离子交换树脂的功能基团是：A.-SO₃⁻B.-COO⁻C.-NH₂D.-OH答案1.A2.B3.C4.B5.B6.A7.B8.A9.A10.A多项选择题（每题2分，共20分）1.层析分离的基本要素包括：A.固定相B.流动相C.目标分子D.检测系统2.离子交换层析的影响因素有：A.缓冲液pHB.盐浓度C.流速D.温度3.亲和层析的配体类型包括：A.抗原B.抗体C.辅酶D.金属离子4.凝胶过滤层析的应用包括：A.脱盐B.分子量测定C.蛋白复性D.纯度分析5.疏水相互作用层析的洗脱条件是：A.降低盐浓度B.提高pHC.加入有机溶剂D.改变温度6.层析系统中常用的检测方法有：A.UV280检测B.电导率检测C.pH检测D.荧光检测7.蛋白纯化中常用的层析组合有：A.亲和+离子交换B.离子交换+凝胶过滤C.疏水+反向D.凝胶过滤+亲和8.反向层析的特点是：A.固定相为非极性B.流动相为极性C.适合分离疏水性分子D.洗脱顺序与分子量有关9.层析柱装填的关键要求是：A.均匀无气泡B.柱床稳定C.柱效高D.流速快10.影响层析分离度的因素有：A.理论塔板数B.选择性因子C.峰宽D.进样量答案1.ABC2.ABCD3.ABCD4.ABD5.AC6.ABCD7.ABD8.ABC9.ABC10.ABCD判断题（每题2分，共20分）1.凝胶过滤层析中，分子越大洗脱越早。（）2.离子交换层析中，高盐浓度可增强蛋白与树脂的结合。（）3.亲和层析的配体与目标分子结合是可逆的。（）4.疏水相互作用层析中，疏水性越强的蛋白洗脱越晚。（）5.反向层析中，流动相极性越强，洗脱能力越弱。（）6.蛋白A亲和层析可纯化所有类型的抗体。（）7.柱效测试常用的物质是丙酮。（）8.层析过程中，流速越快分离效果越好。（）9.离子交换层析的缓冲液离子强度应高于目标蛋白溶液。（）10.凝胶过滤层析可用于去除蛋白中的聚集体。（）答案1.√2.×3.√4.√5.×6.×7.√8.×9.√10.√简答题（每题5分，共20分）1.简述离子交换层析的原理及主要应用。答案：离子交换层析利用固定相（树脂）上的离子基团与流动相中带相反电荷的蛋白发生可逆结合，通过改变缓冲液pH或盐浓度实现分离。当缓冲液pH≠蛋白pI时，蛋白带电荷，与树脂反离子交换结合；提高盐浓度时，盐离子竞争结合位点将蛋白洗脱。主要应用：①纯化重组蛋白（如单抗、酶）；②去除内毒素（内毒素带负电，经阴离子交换层析吸附）；③分离蛋白异构体；④脱盐（低浓度盐下蛋白结合，高盐洗脱盐离子）。2.亲和层析中配体选择的原则是什么？答案：配体选择需遵循：①特异性：与目标分子高亲和、特异性结合，无明显非特异性吸附；②稳定性：在层析条件（pH、盐浓度、温度）下保持活性，可重复使用；③偶联性：能与固定相稳定偶联，不脱落；④洗脱性：目标分子可通过温和条件（改变pH、盐浓度）洗脱，不破坏蛋白活性；⑤经济性：若大量使用，需考虑成本（如蛋白A用于IgG纯化，Ni²⁺用于His-tag蛋白纯化）。3.凝胶过滤层析的分子量测定原理是什么？答案：凝胶过滤利用凝胶多孔结构，分子尺寸不同的物质迁移速率不同。分子量越大的分子无法进入凝胶孔，随流动相在颗粒间隙快速洗脱；分子量越小的分子可进入部分凝胶孔，迁移路径长，洗脱晚。通过比较未知蛋白的洗脱体积（Ve）与已知分子量标准蛋白的Ve，绘制logMW-Ve标准曲线，即可计算未知蛋白分子量（仅适用于球形分子，非球形分子结果有偏差）。4.简述疏水相互作用层析（HIC）的原理及洗脱策略。答案：HIC利用蛋白表面疏水区与疏水树脂的疏水基团可逆结合，高盐浓度（如(NH₄)₂SO₄）增强疏水作用促进结合；降低盐浓度或加入有机溶剂（如乙二醇）减弱疏水作用实现洗脱。洗脱策略：①线性梯度洗脱：逐渐降低盐浓度（1.5M→0）分离疏水性不同的蛋白；②分步洗脱：用不同盐浓度缓冲液依次洗脱（适用于组分少的样品）；③加入极性调节剂（10%-30%乙二醇）温和洗脱疏水性强的蛋白，避免变性。讨论题（每题5分，共10分）1.如何优化蛋白纯化层析过程中的分离度？答案：优化分离度需从多方面入手：①固定相选择：根据蛋白性质（电荷、疏水性、分子量）选合适层析类型（如亲和+离子交换组合），调整树脂孔径和配体密度；②流动相优化：调整缓冲液pH（接近pI±1）、盐浓度（控制结合强度）、添加剂（甘油稳定蛋白）；③柱参数：增加柱长（提高理论塔板数）、确保柱床均匀无气泡；④流速与进样：降低流速（增加传质时间），进样量不超柱容量10%；⑤检测收集：用UV280+电导率检测，准确收集目标峰。例如单抗纯化中，蛋白A亲和后用阳离子交换层析，调整pH5.0-6.0分离聚集体和片段。2.层析过程中出现峰拖尾的常见原因及解决方法？答案：峰拖尾常见原因及解决：①固定相过载：减少进样量（如10mg→5mg）；②非特异性吸