分选肿瘤干细胞的技术探索

肿瘤干细胞的分选技术

引言

肿瘤干细胞是在近来的十年间成为癌症研究日勺热点领域日勺，然而它并非是一

种全新日勺概念，最早有关肿瘤干细胞的假设可以溯源至百年此前.虽然近来数十

年间也有对肿瘤中存在“干细胞”的推断，但长时间地停留在没有充足试验证据

支持的I假说阶段。直到上世纪九十年代，Dick和他的同事们分离纯化出

CD341D38-表型的白血病肿瘤细胞，才初次验证了肿瘤干细胞H勺理论。肿瘤干细

胞日勺发现是肿瘤和干细胞领域数年研究积累、汇集的I成果，而其中有一项试验技

术的奉献非常关键，也即本章所讨论的细胞分选技术。

众所周知I,肿瘤并非是一群混沌的细胞，而更像是一种畸形的器官，构成肿

瘤的细胞群体非常地多样和复杂，也即肿瘤异质性理论所表述的内容。然而，要

将肿瘤口勺各个细胞群体分离出来研究其特性，缺乏细胞分选技术的介入恐怕是非

常困难口勺。实际上，肿瘤干细胞的研究更好地诠释了肿瘤的异质性，并且也也许

是肿瘤领域将细胞分选技术运用得淋漓尽致的典范。细胞种类不一样，分选技术

的内容也是非常丰富，由于细胞分选就是基于细胞的多种特性。目前分选技术的

运用大体可以归入这样几类：一、针对细胞的物理特性，例如细胞口勺大小，密度，

粘附性，折光性，携带电荷等，包括密度梯度离心，荧光激活细胞分选和细泡电

泳等措施；二、针对细胞的表面抗原表型，一般可以采用荧光激活细胞分选、免

疫吸附和免疫磁珠分离法；三、针对细胞的功能特性，如染料外排，钙离子浓度，

pH,荧光蛋白体现，目前最常用日勺是依托荧光激活细胞分选。本章内容将简介常

规细胞分选日勺工作流程，重点简介目前应用较多日勺分选方略。

-/肿瘤样本取材和细胞分离

无论采用何种分选方式，分选之前H勺工作内容是相似的。流程H勺第一步是从

获得肿痛标本。绝大部分研究的样本都采集自外科手术，因此应获得伦理机构的

许可和患者日勺知情同意文献，并记录患者的详细资料和核算最终的病理诊断成果。

一般认为，从手术中获得的样本到细胞分选日勺时间越短越好，故取材时必须与手

术医生配合良好，获得标本后应尽早置于低温（4°C或冰上）。一般在肉眼下，

即可观测到肿瘤各部分组织具有一定异质性，取材应获取代表性H勺瘤块，并尽量

避开坏死的区域。样本可浸入RMP11640和M199等培养基或Hank's平衡盐溶液，

可参照所研究肿瘤的特性选用。一般状况下，低浓度可减少细胞损伤和细胞

间粘附，有助于下一步细胞分离；此外，HEPES缓冲体系多用来平衡体外环境日勺

pH,抗生素的加入可以抵御也许的污染。这样获得日勺样本一般可直接进入试验室

行下一步分选，亦有研究者采用先异种移植到免疫缺陷的NOD/SCID小鼠然后再

行细胞分选日勺方略。

细胞分选日勺必要条件是制备单细胞悬液并尽量地保留细胞日勺活力和功能状

态，这一点对血液肿瘤不是问题，而对实体肿瘤而言也许是重要障碍。不一样肿

瘤采用日勺分离手段都不尽相似，但一般采用机械分离加酶消化的措施。瘤块可以

置于低温Hank's液中充足洗涤并用锋利的器械切割成2〜4mm日勺小块，然后将

小瘤块至于37°C具有消化酶的培养基中并合适日勺振荡，同步保持稳定。2、C02

和pHo酶日勺使用至关重要，不恰当地使用也许导致细胞无法分离或是消化过度,

而后者日勺成果也许是细胞表面蛋白的I丢失和细胞7员伤。一般常用酶日勺消化能力由

强到弱的排序依次是胰蛋白酶(Trypsin),木瓜蛋白酶(Papain),弹性蛋白酶

(Elastase),透明质酸酶(Hyaluronidase),胶原酶(Collagenase)II、I、IV>

III,离散酶(Dispase)和脱氧核糖核酸酶(DNase)I。多种消化酶,各有优缺陷,

一般来说，效果较强的酶也许导致细胞损伤，效果较弱的酶对细胞损伤相对较小。

粗制的酶效果较强，选择性差，精制日勺酶效果较弱，特异性好，毒性小。从近年

的文献报道来看，组织分离中胰蛋白酶使用较少，而胶原酶使用较多，尤其对细

胞表面受体损伤较小的IV和III型胶原酶。此外胶原酶可以联合其他日勺酶使用

以发挥最佳口勺效果，如透明质酸酶可以增长结缔组织细胞间基质H勺解离，离敦酶

可以增进成纤维细胞的解离等。胶原酶口勺作用时间可以很长，可不小于48小时，

但近来文献多报道酶的作用时间在2-4小时，以肿瘤类型不一样而有所差异，在

肝癌组织中(IV型胶原酶lOOIU/ml)甚至有15分钟见效的报道。酶作用之后的组

织消化液一般需要通过40700um的筛网以除去未消化完全的团块，沉淀细胞，

除去上清，使细胞重悬于合适的培养基或平衡盐溶液。操作过程要注意动作轻柔,

沉淀细胞可以通过重力沉降或低速离心的措施，但需注意高速离心也许导致宛弱

的细胞破裂。搜集到的细胞可以做计数和做活性染色，可以得到细胞的得率和存

活率，这一般是必要的，有助于整个试验过程的质量控制。实际上，分离得到IKJ

细胞的得率和存活率一般是不可兼得，只能追求一种合适的平衡点。对于肿瘤干

细胞的研究而言，对细胞的活力的规定是相称苛刻的，由于这将直接影响成瘤试

验欧I成果。

-/荧光激活细胞分选

流式细胞仪的基木原理

流式细胞术(flowcytometry)是一种检测流体状态卜IKj细胞或颗粒特性/、J

技术，它可以在细胞流通过光电检测装置时实时地分析细胞口勺多种参数，包括细

胞大小，颗粒度，荧光染色，免疫荧光标识等。荧光激活细胞分选

(Fluorescence-activatedcellsorting,FACS)则是特殊『、J流式细胞术，需要

在专门口勺流式细胞仪上进行细胞分选的操作，流式细胞仪种类诸多，图1是其中

一种可用于细胞分选、分析口勺大型流式细胞仪。

图1BeckmanCoulter企业EpicsAltra型流式细胞分选分析系统

荧光激活细胞分选术是融合了光学，物理学，电子学和生物学多种学科知识

的产物，其研发历经二十余年，到目前还在不停地改善以适应生物医学研窕的需

要。流式细胞分选仪基本可以分为三大系统，即流体学系统(fluidics)、光学

系统(optics)和电子系统(electronics),其产生也是由这三部分的J技术并行

地发展而造就的。读者可以通过回忆流式细胞分选仪的发展历程来理解其系统的I

构造和细胞分选日勺原理。

流体系统H勺基本作用是带动单个细胞迅速地通过检测器并把对应日勺细胞从

中分离出来，该系统的发明和目前仍广为使用的Coulter血球计数仪亲密有关。

Coulter机器体现了现代流式细胞仪的几种基本思想：把细胞FI勺特性（通过

Coulter裂孔测得口勺电阻代表细胞体积）转化为电信号，迅速并逐一检测单个细

胞，并自动化地处理大量的细胞信号。有趣的是，当时Coulter机器上检测到血

液中存在两群体积大小不一样的红细胞，Fulwyler等为了研究红细胞与否大小

均一的问题时想到了初次采用了分选红细胞啊措施，并造就了第一台流式细胞仪

的原型（同步证明了红细胞双峰现象是伪象）。他在Coulter计数仪上引入了喷墨

打印机口勺喷墨技术，其基本原理仍然沿用至今：高频振荡的喷嘴，将流动室流出

的水柱断裂成均匀的水滴（drop）,根据Coulter机器所检测的细胞大小的信号

来使包括特定细胞的水滴带电，再运用偏转板形成口勺高压电场使其下落方向发生

偏转，并落入对应口勺搜集管中。此外，Crosland-Taylor运用层流原理，让微小

的细胞流束包裹在大量鞘液流中，从而使其“聚焦”于整个流体口勺中央，使细胞

迅速、单个地流动，处理了多种细胞同步通过检测口带来错误信号的问题。至此，

这两个发现奠定/流体细胞分选H勺基石°

然而，Coulter机器并没有真正日勺发展成为实用H勺流式细胞分选仪，也许的

原因也许是它仅仅只能获得细胞体积H勺信号，应用的范围受到了限制。在生物医

学研究中，用显微镜来仔细观测细胞的形态特性并获得非常精细的图像显然是最

经典的措施，不过要用这种方式来分析记录大量的细胞H勺特性则耗时镀力。实际

上，早在Coulter机器之前，诸多学者就在考虑用一种“流式系统”来弥补光学

显微镜动态能力上的I局限性，并且伴随荧光染料和单克隆抗体研究的I发展，这种

需求终于促成了现代流式细胞仪日勺诞生。上世纪六十年代后来，洛斯阿拉莫斯试

验室的JMarvinVanDilla和斯坦福大学F、JHcrzcnbcrg专家各自引入了光学及

电子系统的设计发明了用荧光来检测分选细胞的措施，荧光激活细胞分选这个术

语即是由Hcrzcnbcrg专家发明，而他也因在这个领域的重要奉献获得2023年

京都奖。概况的说，流式细胞仪的光学和电子系统的工作方式就是将激光束持续

入射到液流中，当细胞或颗粒迅速通过激光束时，会产生前向散射光（Forward

scatter）、侧向散射光（Sidescatter）和多种波长尼）荧光，这些光信号通过透

镜和滤镜组之后被光电倍增管等电子系统分别接受并转换为电子脉冲。而分选系

统再根据这些信号和操作时口勺设定参数（门的设置）决定给特定细胞口勺液滴带上

不一样的电荷使其被分选出来（图2）。

样品流

鞘液系统

鞘液流

附

於

DI但P

里

网

胞

状

米

第

充电控制

图2流式分析原理图

荧光激活细胞分选日勺应用是非常广泛，由于细胞流式术可以检测的细胞日勺多

种参数，如细胞的大小（前向散射光）、细胞日勺颗粒度（侧向散射光）、荧光染料的J

染色深浅、免疫荧光的抗体标识和细胞内的荧光蛋白量等。从分选日勺方式上来讲，

可以正性选择（阳性标只的细胞），可以负向选择（阴性标识的细胞），亦可以同步

选择两个甚至多种细胞群体（视详细机器功能）。再肿瘤干细胞的分选中，应用较

为广泛日勺是运用免疫表型的分选和运用Hoechst33342拒染特性的侧群细胞分选。

免疫表型的荧光染色

免疫表型检测是从血液学和免疫学研究中发展起来，原理就是用荧光染料偶

联日勺抗体标识细胞膜表面的分化抗原。一•般免疫荧光标识的方式包括直接标识和

间接标识，一般流程如图3所示.详细的细节由分选的I细胞和操作者的习惯有所

不一样，本章中着重简介实际操作中的I某些体会与经验，与同行交流、供读者参

照。

分离得到的单细胞悬液

洗深（离心、重悬1~2次）

冰上封闭10~20分钟

J荧忙抗冰上■

孵育15~2。分钟

图3免疫表型的荧光染色流程

首先，一般来说，整个抗体标识反应必需在冰浴上进行，洗涤、离心等环节

也要保持低温。这样有助于增长细胞的存活率，尹且低温下细胞膜日勺内吞活动大

大减少，有助于抗原表位日勺检测。细胞一直处在合适的平衡盐缓冲液如Hank's

液，磷酸盐缓冲液等，其中添加适度（2%）日勺血清可以减少细胞损伤和损失「承载

细胞悬液的容器宜选择聚丙烯材质欧I离心管，可以减少频繁离心洗涤过程中细胞

的损失。

另一方面，封闭液中要包括第二抗体宿主（动物）的免疫球蛋白，重要防止细

胞表面Fc段日勺受体非特异性日勺吸附抗体，这对血液中日勺单个核细胞尤其重要,

长期培养的实体瘤细胞系可以视详细状况而定。假如用间接法标识，第二抗体应

尽量选择F(ab'八段的抗体。

再次，一般状况下，直接标识法操作简朴，染色效果更佳，也更有助于保持

细胞活性，不过在多色标识的状况下，研究者务必先考虑好联合使用的方案(重

要是针对拟使用的流式细胞仪的激光器、荧光通道选择可以搭配使用的不一样荧

光素标识的抗体)再购置抗体。间接标识法使用灵活，可以搭配不一样的一抗，

有助于在研究初步检测和探索条件，需要注意两点：一是一抗、二抗之间的宿主

免疫球蛋白的交叉反应，而是不一样激发波长、发射波长的二抗标识荧光素。

此外，在分选过程中，免疫荧光标识必须有足够的辨别率，也即阳性细抱的

荧光强度高，而阴性细胞向背景荧光弱。这与抗体的质量和使用口勺浓度有关，抗

体浓度过高在背景荧光过强，浓度太低则阳性信号太弱。一般供应厂商会提供参

照的抗体工作浓度(抗体稀释度)，但实际上在使用时要自己探索最适条件。对直

接标识的荧光一抗，一种可靠的措施是设置阳性和阴性对照，倍L匕稀释抗体测定

不一样浓度下阳性细胞群(signal)和阴性细胞群(noise)的平均荧光强度的比值

(S/N),以S/N比值大为优ug/血的浓度下得到S/N>3的效果。一般状况下,

0.5ug的抗体(免疫球蛋白)即足够用于100悬液中的IX10,个细胞。

侧群细胞检测日勺Hoechst33342染色

侧群细胞(sidepopulation,SP)是一群具有外排染料特性的细胞群，在多

种正常组织、肿瘤组织及肿瘤细胞系中都可检测到，分选到的侧群细胞中富集了

正常干细胞或肿瘤干细胞。侧群细胞在组织或肿瘤中的含量极低，得名日勺来由是

在Hoechst3334染色的流式图上显示这一小群细胞出目前主群细胞的侧方(图

4)oHoechst33342是一种活细胞的荧光染料，结合于DNA小沟中富含AT日勺区

域，能透过正常的细胞膜进入细胞核使DNA染色。侧群细胞能拒染Hoechst33342

的原因是该群细胞能通过细胞膜上日勺ABC泵(ATPbindingcassettetransporter)

外排染料，有多种ABC家族组员和侧群细胞有关，研究的较清晰日勺是ABCG2和

ABCB1,其中ABCG2被认为对Hoechst染料的外挂能力最重要。目前对侧群细胞

和肿瘤干细胞关系还存在某些争议，已经有人认为肿瘤组织或肿瘤细胞系中SP

细胞并非肿瘤干细胞，至少有些肿瘤是这样I常规SP细胞分选流程如下：

【试剂和器具准备】

试剂准备：

1.含2%胎牛血清(Hyclone)的DMEM(Sigma)培养基;

2.Hank's平衡盐溶液(Invitrogen)

3.IMHEPES溶液(Sigma)；

4.200Ftg/mlPK100X)溶液(Sigma)；

5.1mg/mlHoechst33342(200X)溶液(MoleculeProbes,Invitrogen)；

6.5mMverapam：1(100X)溶液(Sigma)

仪器、器具：

配置351nm紫外激光光源和488nm激光光源I内流式细胞分选仪，450DF,

610DCLP和675ALp滤片

37c循环水浴,50n)l聚丙烯离心管(Corning),无菌流式管(BDBioscience),

细胞计数板和滤网等

【染色环节、上机分选】

1.细胞染色:

(1)培养日勺细胞用膜酶消化，用37℃含2%胎牛血清DMEM重悬后计数；调整

细胞悬液浓度约为IXIO'/inl,加入50nli离心管，分别设分选组和对照组。

(2)两组均加入荧光染料Hocchst33342,使终浓度为5Ng/ml,对照组还需

加入维拉帕米，使终浓度为50uM；37℃水浴避光孵育90min；孵育过程中要

间隔一定期间摇摆孵育管。

(3)孵育结束后，立即4℃离心细胞(或冰上急冷后离心)，用冰预冷Hank's

液重悬细胞；加入PI使终浓度为2Pig/ml,细胞悬液过滤网。

2.流式细胞仪检测：

Hoechst33342用紫外激光激发，450nm滤片接受Hoechst蓝光，675ALp接

受Hoechst红光。选用线性信号,做Hoechstred(X轴)和Hoechst受ue(Y轴)

二维散点图，将HoechstRed及HoechstBlue弱信号且verapamil对照组玦失

的区域设定为SP细胞的门，II算比例。分选出SP细胞及Non-SP细胞。仪器详

细操作按仪器使用阐明、在专业操作人员指导下进行。

①

-n

CD

sl

ou

o①

工

10231023

PMT5Lin

HoechstRed

图4人乳腺癌MCF-7细胞的SP分选

红色表达SP细胞，绿色表达non-SP细胞，克制剂Verapamil处理后SP细胞减

少

侧群(SP)细胞日勺染色措施是由Goodell等2建立的，其试验室日勺网络站点亦

提供详尽的技术方案。起初SP分选集中在骨髓中日勺造血干细胞，后来才引入肿

瘤细胞日勺研究，其中GoodelF,Kondo：'和Patrawala'等几种小组的研究汇报都可

供参照。SP的染色过程比免疫荧光标识操作环节少，概括地说就是将消化或分

离好的单细胞悬液在具有Hoechst33342的培养基中温育一定期间后上机检测，

不过整个染色欧I过程受到诸多原因日勺影响，因此并不简朴。根据文献的报道和笔

者日勺经验，值得注意如下几点：

1.严格控制染色H勺温育时间，温度和Hoechst33342的最终浓度。大多文

献报道温育时间是90分钟，温度是37°C(最佳是恒温循环水浴)，Hoechst33342

时终浓度是5ug/ml。温育结束后应迅速低温下离心，重悬于不含酚猷的JHank's

液或磷酸盐缓冲液并置于冰上。一般认为控制温育条件可以稳定Hoechst染料的

荧光强度和ABC泵外排日勺能力，而温育结束后迅速置于冰上可减少非特异的I染料

外泄。由于Hoechst的荧光信号强度可代表DNA含量，笔者判断染色和光路效果

很好的粗略原则是Hoechst33342蓝色荧光的直方图可清晰观测到主群细胞的

G1期、S期、G2/M期组分。

2.ABC泵H勺外排能力依赖ATP水解时释放的能量，温育时应选择合适的培

养基如DMEM或RMPI1640等,一般添加2-5机勺血清。此外，温育最佳在50nli以

上日勺聚丙烯离心管内进行，对照组和试验组细胞悬液的体积也最佳相似，细胞密

度应控制在10"个细胞/亳升。

3.流式分析图中SP的门设置根据ABC泵克制剂处理组中消失细胞日勺区域,

ABC泵克制剂一般可选择维拉帕米(verapamil),FumitremorginC(FTC)和利血

平(crystoserpinc),应当注意维拉帕米和FTC对SP的克制效率是不一样『'J,维

拉帕米重要针对ABCBL而FTC则是ABCG2特异性的克制剂。克制剂处理组的主

群细胞流式在图上的位置也会略有偏远，表达染色强度会稍有增长。

4.SP检测对光路的规定很高，操作者必须每次开机时用原则微球检测光路,

尤其是紫外激光的状态。由于流式细胞仪的机型差异，在不一样光源和滤片设置

下SP区域在流式图上口勺位置和形态也许会差异较大。Hoechst33342的最佳激发

波长在350nm左右，发射光最强在440nm左右。推荐的配置需要装备水冷的紫外

激光光源，功率调整到60T00mW间，但也有文献报道使用407nm口勺固态紫色激

光源。

5.对直接从组织中分离到的细胞进行SP分选的难度较大，因SP检测对细

胞活力口勺规定更高，目前文献中SP分选多在肿瘤细胞系中进行。如要深入进行

免疫表型标识，可在温育之后冰上进行。要注意的是假如紫外激发光很强，

Hoechst蓝光发射波段也许会干扰FTTC或EGFP日勺检测，因此要调整好荧光赔偿

或事先设计更好H勺光路方案。

流式分选的常见问题

一般研究者不需要详细掌握上机分选的细节，不过理解如下的某些问题助

于更好地进行前期准冬和分选后日勺功能研究。

1.在准备流式分选此前，需要理解所要标识的膜抗原日勺体现水平和实际组

织或细胞系中标识阳性细胞的大体比例，这对下一步的分选非常必要。一般可以

通过组织切片和细胞爬片的免疫组化来来确认，体现过于微弱的膜抗原也许是不

合适作为分选标识的。

2.整个分选过程的操作环节繁多，会不可防止地丢失细胞或损伤细胞，尤

其需要注意的是最终搜集到的细胞数一般会与理论的分选得率有较大差异，原因

在于接受细胞时细胞会附着于管壁丢失或死亡，并且由于分选纯度的设置，机器

会丢弃一部分包括阳性细胞的液滴。要分选到足够进行下一步试验的细胞，除了

需要综合考虑目的细胞的比例和总细胞口勺数量外，还要估计到细胞损失，一般搜

集到的存活细胞也许只有50%左右。在进行下一步试验前，对搜集到的细胞计数

是比较稳妥的措施，但要注意假如分选到的细胞数很少（＜10’数量级），手工计数

的误差会极大。

3.在样品细胞悬液中加入碘化丙咤（PT）或7-AAD有助于在分选时排除死细

胞，此外为了减少搜集时细胞的死亡，需要保证样本管中的pH和温度稳定，并

注意鞘液对分选细胞口勺影响，最佳在搜集管中加入多量口勺培养基（＞"3体积），

并培养基中加入20%的胎牛血清。分选一般都在低温下进行，搜集完之后要立虽

然细胞恢复到正常培养环境。

4.目的细胞群比例低于1%时，分选难度会匕较大，重要是减少分选的纯度

和延长分选H勺时间。目前主流的流式细胞分选仪H勺峰值速度都在每秒10'的数量

级，但计算上阳性细胞H勺比例后仍然是很低H勺，况且全速运行会减少分选细胞纯

度。肿痛干细胞的比例一般都比较低，有时也许需要采用磁式分选预先富集的方

略。

5.要确定分选到的细胞的纯度，可以简朴的将分选搜集到日勺细胞重新上机

分析，一般可以获得不小于95%的纯度。在目日勺细胞群比例极低的状况下，保证

纯度是比较困难，这种状况需要对目的细胞进行预先的富集。

三/免疫磁性细胞分选

免疫磁性分选法日勺原理是将某种抗原的特异性抗体偶联到特制H勺磁性微体

上，在细胞与磁体混合时，磁体通过抗体的作用结合到体现对应抗原的细胞H勺膜

表面，当磁体标识的细胞通过磁场时,细胞因磁性作用而被吸附，当磁场解除后，

标识的细胞就可被洗脱而分离出来。与流式分选技术相比较，磁性分选日勺措施不

需要昂贵的设备和专业日勺技术，儿乎所有试验室均有条件开展;操作也非常简朴,

并且分选的时间短有助于保持细胞活力；从分选的纯度上，磁性分选也只是稍稍

逊色。因此这项技术颇受研究者青睐，己经成为细胞分选中应用日勺主流技术。

免疫磁珠的标识措施可以分为直接标识和间接标识。直接标识就是厂商已直

接把单克隆抗体偶联到磁珠上，使用时只需把细胞和磁珠混合孵育后就可过柱分

选。不过一般直标的I磁珠种类有限，一般都是常用的抗体如CD34、CD133等等。

间接标识是把首先对细胞进行一般的一抗标识，然后再与偶联二抗的磁珠混合。

间接标识的措施愈加灵活，对部分体现微弱日勺抗原还能增长磁性吸附的作用。实

际上，由于依赖特殊的磁珠，磁性分离法日勺研发基本上依托厂商推进，技术方案

上研究者也只能亦步亦趋。有关详细的操作方案，各家厂商都在网站上都提供详

细日勺技术资料，本章只择其要点而不一一赘述。

从直观日勺操作方式给免疫磁性分选法分类，大体可分为依赖分离柱和非依赖

分离柱两类。依赖分离柱的I日勺磁性分选法欧I特点是使用磁性微珠和特制日勺分离柱,

经典代表是MACS系列产品，其注册商标MACS（Magnetic-activatedcellsorting,

磁性激活细胞分选）儿乎成为免疫磁珠分离法时代名词。MACS分离柱是类似注射

器针筒日勺塑料容器，不过填充有不一样规格铁珠，装置于配套日勺永磁体后柱体内

即能形成高强度日勺磁场。MACS的磁珠由多聚糖和氧化铁构成，直径约50nm,论

体积仅为细胞的百万分之一，但通过度离柱的磁场时细胞即可被小小的磁珠牵

附在分离柱上，未结合磁珠的细胞则流经分离柱而进入搜集管。将分离柱与破铁

分开，柱中的磁场消失，结合磁珠的细胞就能被洗脱卜来。由于有过柱和洗脱的

过程，操作相对复杂，新手需要一定口勺训练。非依赖分离柱的分选口勺特点是无需

分离柱，磁珠和细胞结合之后将细胞悬液管直接置于永磁体形成的强磁场中，标

识上的细胞便直接贴附在管壁上，除去上清，洗涤多次后留下口勺就是标识的细胞，

也直接受取_L清中的细胞。目前采用这种方式欢|产品有Dynabeads和EasySep®

等。由于过柱操作，分选流程上也愈加简化，同步防止了过柱的过程对细胞的影

响。不过没有分离柱增强磁场的作用，Dynabeads采用体积更大的I磁珠（与细胞

相仿的数量级）来增强磁性吸附作用，吸附到的细胞进行后续操作前需要将细胞

与磁珠解离"EasySep®虽然仍采用了较小H勺磁性微珠，但宣称能保证吸附的效

果。

从分选方略上来分类，免疫磁性分选措施有可分为阳性分选（positive

selectionstrategy）।清除分选（depletionstrategy）和联合方略（combined

strategy）等。简朴日勺说，阳性分选就是磁性标识目的细胞群而富集这些细泡,

而清除分选是磁性标识那些不需要欧I细胞而清除之。联合方略顾名思义就是将前

两者综合使用，如在清除分选去掉不需要的I细胞之后采用阳性分选获得目的细胞

群，或是联合两次针市不一样抗原阳性分选的多重分选(MultiSort)。

虽然具有诸多长处，磁性分选的也有某些比较明显日勺缺陷，首先是死细胞的

非特异性吸附问题，这个问题需要通过度选前预处理来处理。另一方而分选过程

是一种“黑箱”，无法在分选时实时地理解到目H勺细胞群在总细胞群中日勺比例，

也无从知晓分选后目的细胞在搜集到的细胞中的纯度。为了克服这个问题，一般

研究者需要对搜集到的细胞再做流式检测，也即是用相似抗原荧光抗体去标识搜

集到的细胞。

在产品口勺选择上，显然各厂家都宣扬自身的长处，研究者也很难对分选的效

率和纯度进行绝对的比较。既往来看，MACS应用比较广泛，尤其肿瘤干细胞的

文献报道大多采用MACS,而其他的新产品和技术的应用也在不停的增长。客观

的讲，详细的措施各有所长，研究者需要对分选的方略(分选阳性细胞或清除阳

性细胞)，与否兼容流式检测和减少对细胞影响等原因进行综合考虑。

结语

细胞分选技术相称丰富，除了在本章中详细简介的荧光激活细胞分选和免疫

磁性细胞分选措施之外，尚有诸多技术例如密度梯度分离法，免疫淘洗法，亲和

层析法和细胞电泳法。伴随技术的不停发展，诸多措施的使用逐渐地减少了，或

者成为其他措施H勺辅助和补充。在肿瘤干细胞的研究中，流式分选和免疫磁性法

占据了重要H勺位置，这两者措施可以互相裨益，也是目前应用前景最为广阔日勺分

选措施。

对比流式细胞分选和免疫磁性分选，毫无疑问后者更经济实用，不过应用欧I

限制也显而易见，也就是每次分选只能依赖于单个膜抗原，而实体瘤干细胞日勺研

究却常常为缺乏膜抗原日勺体现而苦恼不堪。从这个方面来看，擅长多参数分选的

流式细胞仪凸显出它的优势。流式可以检测日勺细胞特性不仅仅局限于表观的特性,

例如细胞大小，某抗原时体现；还可以深入的发掘功能方面欧I特性，根据染料拒

染能力而建立的侧群细胞分选就是最佳日勺例证。伴随研究