《吉林省食品安全地方标准-酒精饮料中氨基甲酸乙酯的测定-气相色谱-质谱法》标准说明

PAGE7-吉林省食品安全地方标准《酒精饮料中氨基甲酸乙酯的测定气相色谱-质谱法》编制说明（征求意见稿）吉林省疾病预防控制中心二〇一二年四月目录一、研究背景…………二、任务来源………三、制定标准的必要性和意义………四、标准化过程………五、制标原则…………六、标准主要条款的说明……………1、标准的名称………2、标准的范围………3、方法原理………4、前处理条件………5、仪器分析条件……………………6、检出限………7、线性范围……………………8、准确度、精密度……………七、标准验证情况说明……………八、验证结论……………九、本标准作为强制性地方标准的建议…………………十、贯彻标准要求和措施建议…………………十一、参考文献……………………研究背景氨基甲酸乙酯是一种具有遗传毒性及致癌性的物质,存在于许多发酵食品(如酱油、酵母、奶酪等)和酒精饮料(如黄酒、白酒、葡萄酒等)中，可引起肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等，因此在2002年就已成为FAO重点监控物质。北美等国家法规规定了不同酒精饮料中所含氨基甲酸乙酯的数量及水平。目前,我国随着人们生活水平的提高,酒精饮料的消费量也逐年上升，但是对酒精饮料（包括黄酒、葡萄酒、白酒和啤酒）尚未制定氨基甲酸乙酯限量标准和检测方法，对氨基甲酸乙酯污染评估也尚未广泛开展。2011年卫生部食品安全风险监测中检测白酒和黄酒中氨基甲酸乙酯，2012年检测葡萄酒中氨基甲酸乙酯，但是没有给出国家标准检验方法。因此尽快制定相应的检测标准，严格控制酒精饮料中氨基甲酸乙酯的含量势在必行。任务来源任务来源：吉林省卫生厅任务编号：DBS22/016-2012归口单位：吉林省卫生厅起草单位：吉林省疾病预防控制中心制定标准的必要性和意义加拿大的卫生与预防部门规定佐餐葡萄酒中氨基甲酸乙酯质量浓度不得超过30μg/L。美国食品和药品管理局规定1988年以后生产的佐餐葡萄酒（酒精度14%V/V）氨基甲酸乙酯质量浓度不得超过15μg/L。日本清酒规定其含量不得超过100μg/L。目前中国尚未制定酒中氨基甲酸乙酯的限量标准，暂时参考国际标准规定氨基甲酸乙酯的含量不得超过20μg/L。随着我国居民生活水平日益提高，酒类饮品的消费量也呈现出快速增长的趋势，但酒类饮品中氨基甲酸乙酯污染对人体健康具有的潜在危害还未引起公众的注意。从近三年的食品安全风险监测结果来看，黄酒中的氨基甲酸乙酯污染很普遍，检出率达到100%，含量较其他酒类偏高，某些样品甚至超过1000µg/kg，如果长期饮用极易对人体健康造成较大危害。目前尚无对酒精饮料中氨基甲酸乙酯的国家标准检验方法。我国进出口商品检验行业标准SN0285-1993出口酒类中氨基甲酸乙酯残留量检测采用二氯甲烷提取,然后进行GC/MS分析,方法为19年前制定，在实际检测时发现该方法回收率低,色素等杂质干扰大，只适于白酒和黄酒，并且存在定量限达不到当前国际限量的标准，准确度也不能满足微量分析要求等不足。标准制定的主要过程1、前期工作实验室在2011年，通过查阅最新的资料和技术文献[1-4]，确定了测定酒精饮料中氨基甲酸乙酯的技术路线，对方法的检出限、回收率、精密度进行了系统研究，建立了一个操作简便、灵敏度高、选择性好、能为我省大多数的检测机构所使用的方法，为酒精饮料中氨基甲酸乙酯的检测提供了技术依据。由于目前国家标准和地方标准中没有测定食品中酒类饮品中氨基甲酸乙酯的方法，据此向吉林省卫生厅提出食品安全地方标准制定申请。2、实验室间的验证工作2012年5月，进行了实验室间的验证工作。通过统计分析各个实验室的检测数据，验证了方法的准确度和精密度、检出限等。参加验证的实验室一致认为：该方法适用于测定酒精饮料中氨基甲酸乙酯的含量，具有测定结果准确可靠、操作简单、快速等特点。制定标准的原则和依据本标准编制遵循“先进性、实用性、统一性、规范性”的原则，尽可能与国际通行标准接轨，注重标准的可操作性，严格按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》和GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分：化学分析方法》的要求进行编写。标准主要条款的说明标准的名称《酒精饮料中氨基甲酸乙酯的测定气相色谱-质谱法》标准的范围本标准规定了酒精饮料中氨基甲酸乙酯的气相色谱-质谱测定方法，适用于白酒、啤酒、黄酒、葡萄酒等酒精饮料中氨基甲酸乙酯的测定。方法原理酒精饮料加氨基甲酸乙酯同位素内标后，经过硅藻土固相萃取柱净化、洗脱，洗脱液浓缩后，用气相色谱—质谱仪测定，内标法定量。4、前处理条件称取称取2.0g（准确到0.01g）的酒样，加100μLD5-氨基甲酸乙酯内标使用液，混匀。加样到硅藻土固相萃取柱上，抽真空，让试样慢慢渗入到固相萃取柱中，静置约10min，用10mL5%乙酸乙酯/乙醚溶液洗脱收集于具塞刻度试管中（需要抽真空），洗脱液经过无水硫酸钠脱水，在30℃下用氮气缓缓吹至近干，用甲醇定容至1.0mL制成测定液供GC/MS5、仪器分析条件色谱参考条件色谱柱：DB-INNOWAX毛细管色谱柱:30m×0.25mm（内径）×0.25μm（膜厚）或相当色谱柱。进样口温度:200℃;柱温：初温50℃,保持1min,以8℃／min升至180℃。程序运行完成后240℃postrun5min；载气:质谱条件电离方式：EI源,70eV;离子源温度：230℃；进样方式：无分流进样。氨基甲酸乙酯选择监测离子（m/z）：44、62、89；定量离子62；D5-氨基甲酸乙酯选择监测离子（m/z）44、64、76；定量离子64。氨基甲酸乙酯分子式：C2H5NO2，分子量为89.09，从实际样品检测发现：89为氨基甲酸乙酯分子离子峰，选择m/z62、m/z64作为氨基甲酸乙酯及其同位素内标的定量离子灵敏度高且选择性好，另外，本方法选择44，62，89三个离子碎片作为氨基甲酸乙酯的监测离子，44，64，76作为氘代氨基甲酸乙酯的监测离子。我国早在1993年就制定了“出口酒类中氨基甲酸乙酯残留量检验方法”标准检验方法[5]，但该方法存在定量限达不到当前国际限量标准，且准确度不能满足微量分析要求等不足。食品中氨基甲酸乙酯的提取净化主要采取液/液萃取、固/液萃取、基质固相分散萃取、固相微萃取、顶空固相微萃取及固相萃取柱萃取等前处理方法[6-8]，其中固相萃取法提取效果较好且适用范围较广。仪器检测手段除了常用的气相色谱-质谱联用法（GC-MS），还有气相色谱-热离子检测器法（GC-TCD）、高效液相-荧光检测器法（HPLC-FLD）、串联质谱法（MRM）等多种仪器方法[9-14]。参照相关文献并进行了优化和创新，建立了稳定d5-EC同位素稀释气相色谱-质谱联用法，优化各项色谱和质谱参数，使灵敏度大大提高。检出限按信噪比S/N≥3计算，可得氨基甲酸乙酯的检出限，最低检出浓度为4μg/L，取样量为2.00g时，方法的检出限为线性范围分别取不同浓度氨基甲酸乙酯的标准使用液进样1μL，进样分析，绘制标准曲线，相关系数r为0.9996，线性方程为Y=0.0238x-0.0596。结果表明氨基甲酸乙酯在10μg/L－160μg/L浓度范围内线性关系良好。准确度、精密度取浓度为80.6ng/mL的标准工作溶液，进样1μL进行仪器分析，重复测定6次，RSD为0.56%。取不同酒样分别加入20.5ng/mL、80.6ng/mL、100.3ng/mL的氨基甲酸乙酯的标准溶液1mL，按上述方法进行样品处理及测定，本方法添加浓度为20.5μg/kg～100.3μg/kg时，加标回收率为89.1%～106.6%,相对标准偏差范围为1.13%～5.75%。结果表明方法的精密度及准确度均符合分析要求。详细结果见表1至表4。表1氨基甲酸乙酯准确度与精密度试验（n=6）（白酒）样品本底值（μg/kg）添加量（μg/kg）测定值（μg/kg）回收率%RSD(%)125.625.625.625.625.625.620.520.520.520.520.520.544.948.743.644.045.246.897.4105.694.695.498.0101.54.19225.625.625.625.625.625.680.680.680.680.680.680.6108.9104.6108.7105.4103.9104.8102.598.5102.499.297.898.72.06325.625.625.625.625.625.6100.3100.3100.3100.3100.3100.3126.3124.5122.9125.8125.7126.8100.398.997.699.999.8100.71.13表2氨基甲酸乙酯准确度与精密度试验（n=6）（啤酒）样品本底值（μg/kg）添加量（μg/kg）测定值（μg/kg）回收率%RSD(%)20.520.520.520.520.520.528.427.228.328.928.631.492.588.692.294.193.2102.34.8680.680.680.680.680.680.685.288.996.882.287.785.293.899.3106.690.596.693.85.753100.3100.3100.3100.3100.3100.3113.4103.9115.7104.6104.8105.2102.694.0104.794.794.895.24.81表3氨基甲酸乙酯准确度与精密度试验（n=6）（黄酒）样品本底值（μg/kg）添加量（μg/kg）测定值（μg/kg）回收率%RSD(%)119.819.819.819.819.819.820.520.520.520.520.520.535.937.438.034.936.637.489.192.894.386.690.892.83.12219.819.819.819.819.819.880.680.680.680.680.680.6102.698.697.996.497.199.2102.298.297.596.096.798.82.22319.819.819.819.819.819.8100.3100.3100.3100.3100.3100.3116.6123.1118.3117.5115.9118.897.1102.598.597.896.598.92.16表4氨基甲酸乙酯准确度与精密度试验（n=6）（葡萄酒）样品本底值（μg/kg）添加量（μg/kg）测定值（μg/kg）回收率%RSD(%)115.815.815.815.815.815.820.520.520.520.520.520.534.235.037.434.996.4103.096.194.296.73.36215.815.815.815.815.815.880.680.680.680.680.680.693.892.790.695.1100.394.097.396.294.098.6104.097.53.45315.815.815.815.815.815.8100.3100.3100.3100.3100.3100.3113.5110.8116.9111.2112.6117.397.895.4100.795.897.0101.02.46方法验证该方法经三个实验室的技术人员进行了方法验证试验，验证试验采用了添加法，分别对具有代表性的样品进行了10μg/kg、20μg/kg、30μg/kg等3个不同水平的添加回收实验，每个水平独立测定6次。其结果见验证报告。验证结论经验证该检测方法在精密度、准确度、检出限等方面完全达到了测定酒精饮料中氨基甲酸乙酯的检测要求，其方法方便、快捷，应推广应用。九、本标准作为强制性地方标准的建议通过以上一系列的实验研究，建立了酒精饮料中氨基甲酸乙酯的检测方法。该方法准确可靠。为制定酒精饮料中氨基甲酸乙酯的卫生标准限值提供技术支持，建议把《酒精饮料中氨基甲酸乙酯的测定气相色谱-质谱法》作为强制性地方标准批准发布。贯彻标准要求和措施建议1、技术措施要求熟练掌握前处理技术，了解仪器性能、原理，且能熟练操作，能对检测结果进行分析。2、管理措施本技术标准在实施过程，严格执行检验规范，熟悉检验方法和有关的法规，做到科学、公正、准确、不受其他因素干扰，确保检验结果的准确可靠。3、实施方案3.1本标准由吉林省卫生厅发布，计划于xxxx年xx月xx日发布实施，由xxxx行政主管部门负责监督实施。3.2该标准被批准后，组织力量，进行宣贯实施，通过该标准的贯彻实施，确保食品安全和保障人体健康等方面将产生巨大的经济效益和社会效益。十一、参考文献[1]李华,梁新红,郭安鹊等.葡萄酒苹果酸－乳酸菌精氨酸代谢研究概况[J].微生物学报,2006,46(4):663-667[2]宋钢.酒类的安全性调查—氨基甲酸乙酯的分析[J].中国酿造,2008(3):99-102[3]高年发,宝菊花.氨基甲酸乙酯的研究进展[J].中国酿造,2006(9):1-4[4]周萍萍,周蕊,赵云峰等.葡萄酒中氨基甲酸乙酯污染评估[J].中国食品卫生杂志,2008,20(3):802[5]SN0285-1993.出口酒类中氨基甲酸乙酯残留量检验方法[S].[6]DirkW.L,UtaN,ThomasK.Automateddeterminationofethylcarbamateinstone-fruitspiritsusingheadspacesolid-phasemicroextractionandgaschromatography–tandemmassspectrometry.J.ofChromatogr.A,2006,1108:116–120.[7]I-SWoo,I-HKim,U-JYun,etal.AnimprovedmethodfordeterminationofethylcarbamateinKoreantraditionalricewine.JournalofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology,2001,26:363–368.[8]DirkW.L,WilliFandThomasK.Applicationoftandemmassspectrometrycombinedwithgaschromatographytotheroutineanalysisofethylcarbamateinstone-fruitspirits.RapidComm