现代分子生物学笔记第三版朱玉贤

第一章绪论

1、两个经典实验证明遗传物质是DNA而不是蛋白质

(1)肺炎球菌在小鼠体内的毒性实验：先将光滑的致病菌S菌烧煮杀灭活性后，以及活的粗糙型细菌R

菌分别侵染小鼠，发现这些细菌自然丧失了致病能力。当他们将烧煮杀死的S菌和活的R菌混合在感染

小鼠时，实验小鼠每次都死亡了。解剖死鼠，发现有大量活的S型细菌，实验说明，死细菌的DNA进行

了可遗传的转化，从而导致小鼠死亡。

〔2〕T2噬菌体感染大肠杆菌：当细菌培养基中分别带有35s或32P标记的氨基酸或核甘酸，子代噬菌

体就相应有s标记的蛋白质或p标记的核酸。分别用这些噬菌体感染没有放射性标记的细菌，经过广2

个噬菌体DNA复制周期后进行检测，子代噬菌体中几乎不含带s标记的蛋白质，但含有30席以上的p标

记。说明在噬菌体传代过程中发挥作用的可能是DNA,而不是蛋白质。

第二章染色体与DNA

构成DNA和RNA分子的五种含氮碱基的结构式：

第一节染色体

h真核细胞的染色体具有如下性质：分子结构相对稳定；能够自我复制，使亲子代保持连续性；能指

导蛋白质的合成，从而控制生命过程；能产生可遗传的变异。

2、染色体上的蛋白质包括组蛋白和非组蛋白。组蛋白是染色体的结构蛋白，它与DNA组成核小体。组

蛋白分为％、MA、H2BX出、乩°

组蛋白：histones真和生物体细胞染色质中的碱性蛋白质含精氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸特别多，二者

加起来约为所有氨基酸残基的匹分之一。

3、组蛋白的一般特性：

①进化上的极端保守：不同种生物组蛋白的氨基酸组成是十分相似的，特别是出、

可能对稳定真核生物的染色体结构起重要作用。

②无组织特异性

③肽链上氨基酸分布的不对称性

@存在较普遍的修饰作用

。富含赖氨酸的组蛋白也

4,非组蛋白：主要包括与复制和转录有关的酶类、与细胞分裂有关的蛋白等。

5,真核生物基因组DNA：

真核细胞基因组的最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能

DNA所隔开。人们把一种生物单倍体基因组DNA的总值称为C道。在真核生物中C值一般是随生物进化

而增加的，高等生物的C值一般大于低等生物，但某些两栖类的C值甚至比哺乳类还大，这就是著名的

“C值反常现象”。

6、真核细胞DNA序列可分为三类：

①不重复序列：在单倍体基因组里，一般只有一个或几个拷贝，占DNA总量的40g80%。结构基因根本

上属于不重复序列。

②中度重复序列：重复次数在10ro4之间，占DNA总量的10/403各种rRNA、tRNA以及某些结构基

因〔如组蛋白基因〕都属于此类。

③高度重复序列：如卫星DNA。只在真核生物中出现占基因组的10%~60$,由10~60个碱基组成，在DNA

链上串联重复高达数百万次，这类DNA高度浓缩，是异染色质的组成局部，可能与染色体的稳定性有关。

7、染色质与核小体：染色质纤维细丝是由DNA和组蛋白构成，DNA和组蛋白构成核小体，核小体连成念

珠状构成染色质。

①核小体的装配过程：

两分子的H3和两分子的H4先形成四聚体，然后由H2A和H?B构成的异二聚体在该四聚体的两侧分别结

合而形成八聚体。长146bp的DNA按左手螺旋盘绕在八聚体上1.8圈，形成核小体的核心颗粒，每圈约

80bpo核心颗粒两端的DNA各有11bp与H1结合，形成完整的核小体。核小体的形成是染色体压缩的第

一个阶段。

②染色体的压缩：

DNA双链以左手螺旋盘绕在组蛋白形成的八聚体核心上即核小体念珠状结构——核小体结构进

一步盘绕折叠形成染色质丝一一组成突环一一玫瑰花结螺线圈——由螺线圈组成染色单体。

8,真核生物基因组的特点：

。真核基因组庞大，一般都远大于原核生物的基因组

②真核基因组存在大量的重复序列

③真核基因组的大局部为非编码序列，占整个基因组序列的90%以上，该特点是真核生物与细菌和病毒

之间最主要的区别

。真核基因组的转录产物为单顺反子。

⑥真核基因是断裂基因，有内含子结构。

。真核基因组存在大量的顺式作用元件。包括启动子、增强子、沉默子等

。真核基因组中存在大量的DNA多态性。单核昔酸多态性和串联重复序列多态性。

⑧真核基因组具有端粒结构。

单顺反子：真核基因转录产物为单顺反子，即一条mRNA模板只含有一个翻译起始点和终止点，因而一

个基因编码一条多肽链或RNA。

在原核生物中，通常是几种不卮的mRNA连在一起，相互之间由一条短的不编码蛋白质的间隔序列所隔

开，这种mRNA叫做多顺反子mRNA。这样的一条mRNA链含有指导合成几种蛋白质的遗传信息。

9,原核生物基因组：

原核生物基囚组很小，大多只有一条染色体，只有很少基囚是以拷贝形式存在，且DNA含量很少。

10、原核生物基因组特点：

。结构简练：原核DNA分子的绝大局部是用来编码蛋白质的只有很少的一局部不转录

②存在转录单元：原核生物DNA序列中功能相关的RNA和蛋白质基因，往往丛集在基因组的一个或几个

特定部位，形成功能单元或转录单元，它们可被一起转录为含多个mRNA的分子，称为多顺反子mRNA。

③有重叠基因：同一段DNA携带两种或两种以上不同蛋白质的编码基因。

第二节DNA的结构

3DNA的一级结构：指DNA分子中核昔酸的排列顺序。

DNA一级结构特征：

DNA分子是由两条互相平行的脱氧核昔酸链盘绕而成；

DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成根本骨架，碱基排在内侧；

两条链上的碱基互补配对

2,DNA的二级结构：指两条多核甘酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。通常情况下分为两大类：右

手螺旋A-DNA、B-DNA和左手螺旋Z-DNA

DNA双螺旋结构：两条DNA链之间形成氢键；双螺旋内部形成的疏水区，消除了介质中水分子对碱基之

间氢键的影响；介质中的阳离子中和了磷酸基团的负电荷，降低了DNA链之间的排斥力、范德华力。

Z-DNA指左手螺旋DNA。在邻近调控系统中，与调节区相邻的转录区被ZDNA抑制，只有当ZDNA转变为

BDAN后转录才能活化，而在远距离调控中，ZDNA可通过改变负超螺旋水平，决定聚合酶能否与模板链

结合而调节转录起始的。

3,DNA的高级结构：指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。

负超螺旋〔拓扑异构酶或溪乙喷〕松弛DNA〔拓扑异构酶或装乙咤〕正超螺旋

L=T+W连接数二双螺旋的盘绕数+超螺旋数

拓扑异构酶I催化的反响结果是：超螺旋DNA在每一个切断结合反响中，使L数发生一种变化，增加一

个连接数，减少一个负超螺旋。

第三节DNA的复制

3半保存复制：DNA在复制过程中，碱基间的氢键首先断裂，双螺旋被分开，每条分子分别做模版合成

新链，产生互补的两条链。每个子代DNA分子的一条链来自亲代DNA,另一条是新合成的。

2,半不连续复制：DNA在复制时，在一个复制叉上同时进行两个方向的DNA复制，一条链的合成是连续

的，另一条是不连续的先合成一系列的5,的短片段，然后在DNA连接酶作用下连接成完整的DNA

链

3,复制的起点、方向和速度

复制时，双链DNA要解开成两股链分别进行；所以这个复制起点成叉子形式，被称为复制叉。DNA复制

是从固定起点开始的。一般把生物的复制单位称为复制子。一个复制子只含有一个复制起点。通常细菌、

病毒和线粒体DNA分子都是作为单个复制子完成复制的。而真核生物的基因组可以同时在多个复制起点

上进行双向复制，即基因组中包含多个复制子。原核生物和真核生物的DNA复制主要是从固定起点双向

等速复制方式进行。

4,几种主要的复制方式：

⑴线性DNA双链的复制

DNA聚合酶和RNA聚合酶都只能从5'端向3'端移动，线性DNA在复制中，当RNA引物被切除后，留下

5'端的局部单链DNA,不能为DNA聚合酶所作用，使子链短于母链，因此，线性DNA复制子末端的复制

需要以下特殊的机制：

将线性复制子转变为环状或多聚分子；

在DNA末端形成发夹结构；

在末端蛋白的作用下启动复制

⑵环状DNA双链的复制：9型、滚环型、D型

第四节原核生物和真核生物DNA复制的特点

h原核生物DNA复制的特点：

所有的DNA复制都是从一个固定的起点开始的，而目前所知的DNA聚合酶都只能延长DNA链而不能从头

合成DNA链。DNA复制时，往往先由RNA聚合酶在DNA模版上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶从RNA

引物3'末端开始合成新的DNA链。对于前导链，这个引发过程比拟简单只要有一段RNA引物，DNA聚

合酶就能以此为起点一直合成下去，但对于滞后链，这个引发过程就非常复杂，需要多种蛋白质和酶的

协同作用还涉及到岗崎片段的形成和连接。滞后链的引发由引发体来完成。

DNA解链酶：DNA解链酶能水解ATP获得能量来解开双链DNA。

单链结合蛋白SSB：作用是保证被解链酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构，它以四聚体形式存

在于复制叉处，待单链复制完成后才离开。

2,真核生物DNA复制的特点

真核生物每条染色体上可以有多个复制起点，而原核生物只有一个复制起点；真核生物的染色体在全部

完成复制前，各个起点上的DNA不能再开始，而在快速生长的原核生物中，复制起点可以连续开始新的

DNA复制，表现为虽有一个复制单元，但却可有多个复制叉。

3、DNA复制的调控

原核细胞中DNA链延伸的速度几乎是恒定的，只是复制叉的数量不同。细胞内复制叉的多少决定了复制

起始频率的上下。

真核细胞DNA的生活周期可分为四个时期：GixS、G?和M期。DNA复制只发生在S期。真核细胞中DNA

复制有三个水平调控：

①细胞生活周期水平调控：也称限制点调控，即决定细胞停留在G期还是进入S期。

②染色体水平调控：决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定顺序在S期起始复制

③复制子水平调控：决定复制的起始与否。

第五节DNA的修复

晨错配修复：一旦复制叉通过复制起点，母链就会在开始DNA合成前的几秒至几分钟内被甲基化。此

后只要两条DNA链上碱基配对出现错误错配修复系统就会根据“保存母链，修复子链”的原则，找出

错误碱基所在的DNA链，并在对应于母链甲基化腺甘酸上游鸟甘酸的5'位置切开自恋，再根据错配碱

基相对于DNA切口的方位启动修复途径，合成子链。

2,切除修复：包括碱基切除修复和核昔酸切除修复。步骤：①首先由核酸内切酶识别DNA的损伤位点，

在损伤部位的5'侧切开磷酸二酯键②由DNA解链酶将有损伤的DNA片段解离③在DNA聚合酶的催化下，

以完整的互补链为模板，按5'~3'方向合成DNA链，填补已切除的空隙④由DNA链连接酶新合成的DNA

片段与原来的DNA断链连接起来。

3,重组修复〔复制后修复〕：

①受损伤的DNA链复制时，产生的子代DNA在损伤的对应部位出现缺口

②另一条母链DNA与有缺口的子链DNA进行重组交换，将母链DNA上相应片段填补母链DNA的缺口，而

母链DNA出现缺口

③以另一条子链DNA为模板经DNA聚合酶催化合成一新的DNA片段填补母链DNA的缺口，最后DNA连接

酶连接，完成修补。

4,DNA的直接修复

5,SOS反响；包括诱导DNA损伤修复、诱变效应、细胞分裂的抑制以及溶原性细菌释放噬菌体等。包括

两个方面DNA的修复和产生变异。

第六节DNA的转座

1、转座子：是存在于染色体DNA上可自主复制和移位的根本单位。插入序列是最简单的转座子，它不

含任何宿主基因，它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成成分。

2、转座作用的遗传效应：

①引起插入突变

②转座产生新的基因

③转座产生染色体畸变

④转座引起生物进化

练习题

3详述原核生物和真核生物DNA复制的异同。

相同点：①遗传方式相同，都是半保存复制②都需要多种酶和蛋白的参与，都涉及到拓扑异构酶、解旋

酣DNA聚合酶等③都是从固定的起始点以双向等速方式进行复制，多是在起始位点形成复制叉，向两个

等速前进④半不连续复制

不同点：①真核生物每条染色体上有多个复制起点，原核生物只有一个复制起点②真核生物的染色体在

全部完成复制前，各个起点上的DNA不能再开始，而在快速生长的原核生物中，复制起点可以连续开始

新的DNA复制，表现为虽有一个复制单元，但却可有多个复制叉。③真核生物DNA的复制只能在分裂期

遂行，原核生物在整个细胞周期都能进行④真核生物复制起点为自主复制序列⑤真核生物复制叉移动速

度慢

2,原核生物和真核生物存在哪些类型的转座子？转座机理有哪些？

原核生物的转座子包括：插入序列、类转座因子、复合转座子和TnA转座子家族。真核生物的转座子主

要是转座子和反转录转座子两类。转座子的转座机制分为三种类型：复制型、非复制型、保守型。其共

同特点是要涉及靶位点的交错切割和修复性复制。反转录转座子是由RNA介导的模板转换来实现的。

详解：（1）原核生物的转座子包含四类：

①插入序列IS：两端有IR,只编码转座酶

②类转座因子：结构同IS,但不能独立存在，只作为复合子的两端组件

③复合转座子：两端由IS或类IS构成，带有某些抗药性基因或其他宿主基因，一旦形成复合式转座子

IS序列就不能再单独移动，只能作为复合体移动。

OTnA转座子家族：两端为IR,可编码转座酶、解离酶和抗性物质

12〕真核生物的转座子主要是转座子和反转录转座子两大类：

①转座子：玉米内的可控因子、果蝇中的转座子

②反转录转座子：反转录病毒、病毒超家族、非病毒超家族

第三章生物信息的传递--从DNA到RNA

第一节RNA转录的根本过程

RNA链的合成都包括以下几个特点：RNA是按照5-3方向进行的；以DNA中的反义链为模版；在RNA

聚合酶催化下；以四种三磷酸核昔为原料，根据碱基配对原则，各个核昔酸之间通过形成磷酸二酯键

相连，不需要引物的参与，合成的RNA带有与DNA有意义链相同的序列。转录的根本过程包括：模版识

别、转录起始、通过启动子及转录的延伸和终止。

2、模版的识别：主要是RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。真核生物的RNA

聚合酶不能直接识别基因的启动子区，所以，需要一些被称为转录调控因子的辅助蛋白质按特定的顺序

结合在启动子上，RNA聚合酶才能与之结合并形成复杂的转录起始前复合物PIC,以保证有效的起始转

录。

3,起始转录：不需要引物。转录的起始就是RNA链上第一个核昔酸键的产生。转录起始后直到形成9

个核甘酸短链的过程是通过启动子阶段，此时RNA聚合酶一直处于启动子区，新生的RN链与DNA模版

链的结合不够牢固，很容易从dna链上掉下来并导致转录重新开始。一旦RNA聚合酶成功的合成了9个

以上核苔酸井离开启动子区，转录就进入正常的延伸阶段。一般来说，通过启动子的时间越短，该基因

转录起始的频率也越高。

4、转录的延伸：RNA聚合酶释放。因子离开启动子后，核心酶沿模版DNA链移动并使新生RNA链不断延

长的过程就是转录的延伸。

5,转录的终止：当RNA链延伸到转录终止位点时，RNA聚合酶不在形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合

物别离，转录泡瓦解，DNA恢复成双链状态，而RNA聚合酶和RNA链都被从模版上释放出来，这就是转

录的终止。

第二节转录机器主要成分

1、RNA聚合酶：

。原核生物RNA聚合醐：在细菌中，一种RNA聚合醐几乎负责所有的mRNA、rRNA、tRNA的合成。大多

数原核生物的RNA聚合酶的组成是相同的，大肠杆菌RNA聚合酶首先由2个a亚基、一个B亚基、一个

0'亚基和一个3亚基组成的核心酶，加上一个。亚基后那么成为聚合酶全酶。转录的起始过程需要全

酶，由。因子识别起始点，延长过程仅需要核心酶的催化。

大肠杆菌RNA聚合酶的组成分析

亚基相对分子质量亚基数组分功能

a3.65x1042核心酶核心酶组装，启动子识别

P1.51x10$1核心酶B和B'共同组成RNA合成

的活性中心

B'1.55x1051核心酶

311x10’1核心酶

07.0x1041a因子存在多种。因子，用于识别

不同的启动子

②真核生物的RNA聚合酶:

酶细胞内定位转录产物相对活性对a-鹅膏碱的

敏感程度

RNA聚合酶I核仁rRNA50%—70%不敏感

RNA聚合酶II核质hnRNA20%—40%敏感

RNA聚合酶III核质tRNA约10%存在物种特异性

RNA聚合酶I的转录产物是45SrRNA,经剪接修饰后生成除了5SrRNA外的各种rRNA0rRNA与蛋白质组

成的核糖体是蛋白质合成的场所。

RNA聚合酶II在核内转录生成hnRNA,经剪接加工后生成的mRNA被运送到细胞质中作为蛋白质合成的模

版。

RNA聚合酶III的转录产物是tRNA、5SrRNA、snRNA,其中snRNA参与RNA的剪切。

2、转录复合物：模版的识别阶段包括RNA聚合酶全酶对启动子的识别，聚合酶与启动子可逆性结合形

成封闭复合物，聚合酶全酶所结合的DNA序列中有一小段双链被解开。对强启动子来说，从封闭复合物

到开放复合物的转变是不可逆的，是快反响。开放复合物与最初的两个NTP相结合并在两个核普酸之间

形成磷酸二酯键后即转变成包括RNA聚合酶、DNA和新生RNA的三元复合物。

第三节启动子与转录起始

，启动子区的根本结构：

①启动子：是一段位于结构基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模版DNA链准确的

结合并具有转录起始的特异性。因为基因的特异性转录取决于酶与启动子能否有效的形成二元复合物。

启动子的结构影响了它与RNA聚合酶的亲和力，从而影响了基因的表达水平。

②转录单元：是一段从启动子开始至终止子结束的DNA序列，RNA聚合酶从转录起始位点开始沿着模版

前进，直至终止子为止，转录出一条RNA链。在细菌中，一个转录单元可以是一个基因也可以是几个基

因。转录起始位点是指与新生RNA链第一个核甘酸相对应的DNA链上的碱基，研究证实通常是一喋吟。

常把起点前面，即5'端的序列称为上游序列，而把其后面的3'序列称为下游序列。

③Pribnow区；是一个由5个核甘酸TATTA组成的保守序列，其中央大约位于起点上游10bp处，所以又

称TO区。

。-35区：在转录开始位点上游-35区域也有一段保守序列，共同序列是TTGACA

-10位的TATA区和-35位的TTGACA区是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与。因子相互识别而具有

很高的亲和力。

2、启动子的识别：RNA聚合酶并不直接识别碱基对本身，而是通过氢键互补的方式加以识别。

3.RNA聚合酶与启动子区的结合：RNA聚合酶首先与启动子区闭合双链DNA相结合，形成二元闭合复合

物，然后经过解链得到二元开链复合物。一旦开链区解链，酶分子能以正确的取向与解链后的有关单链

相互作用，形成开链复合物。

4,-10区与-35区的最正确间距：在原核生物中，-35区与T0区之间的距离大约是1619bp，小于15bp

或大于20bp都会降低启动子活性。

5,增强子及其功能：增强子是DNA上能提高转录起始效率的序列，可位于转录起始点的5'或3'端,

而且一般与所调控的靶基因的距离无关，其特点如下：

①远距离效应：一般位于上游-200bp处，但可增强远处启动子的转录，即使相距大于10kb也能发挥作

用。

②无方向性：无论位于靶基因的上游还是位于靶基因的下游或内部都可发挥增强转录的作用，

③顺式调节：只调节位于同一染色体上的靶基因，而对其他染色体上的基因没有作用。

。无物种和基因的特异性：可以连接到异源基因上发挥作用。

⑤具有组织特异性：增强子的作用需要特定的蛋白质因子参与。

。有相位性：其作用和DNA的构象有关

⑦有的增强子可以对外部信号产生反响

6,真核生物启动子对转录的影响：

7、转录的抑制：分为两类：第一类是DNA模版功能抑制剂，通过与DNA结合而改变模版的功能；第二

类是RNA聚合酶的抑制物，它仅与RNA聚合酶结合而抑制其活力。

抑制剂靶酶抑制作用

利福霉素细菌全酶和B亚基结合，抑制开始

利迪链霉素细菌核心酶和。亚基结合，抑制开始

放射线素D真核RNA聚合酶I与DNA结合，阻止延伸

a-鹅膏碱真核RNA聚合酶II与RNA聚合酶II结合

第四节原核与真核生物mRNA的特征比拟

1、原核生物mRNA的特征：

①原核生物mRNA半衰期短

②许多原核生物mRNA以多顺贩子的形式存在

③原核生物mRNA5'端没有帽子结构，3'端也没有多聚A尾巴或者很短

2、真核生物mRNA的特征

①直核牛物mRNA5”端有帽子结构

②绝大多数真核生物3"端有polyA尾巴

③但凡编码功能的直核基因都能通过RNA黑合酶II进行转录，真核基因几乎都是单顺反子mRNA,只包含

一个蛋白质信息。

第五节终止和抗终止

(D依赖于P因子的终止：

P因子能水解各种核昔三磷酸，实际是一种NTP酶，通过催化NTP的水解促使新生RNA链从三元转录复

合物中解离出来，从而终止转录。

(2)不依赖于p因子的终止：

模板上存在终止转录信号一终止子，每个基因或操纵子都有一个启动子和一个终止子。终止位点上游一

般存在一个富含GC碱基的二重对称区，由这段DNA转录产生的RNA容易形成发卡式结构。在终止位点

前面有一段4-8个A组成的序列，因此转录产物的3'端为寡聚U,这种结构特征的存在决定了转录的

终止

⑶抗终止：

砺坏终止位点的RNA的茎-环结构的抗终止和依赖于蛋白质因子的转录终止。

第六节内含子的剪接、编辑、再编码及化学修饰

1、RNA中的内含子：

真核基因的表达往往伴随着RNA的剪接过程，从mRNA分子中初出被称为内含子的非编码区，并使基因

中被称为外显子的编码区拼接形成成熟的mRNAo

2,mRNA的剪接：

。由snRNP参与的剪接：此种方式存在于绝大多数真核细胞的蛋白质基因中，由五种snRNA及一些剪接

因子在RNA剪接位点上逐步装配形成剪接体而完成的

②自我剪接：由于内含子的RNA具有催化活性，能过进行内含子的自我剪接。

③由蛋白酶参与剪接：主要在tRNA前体中发现。

3,RNA的编辑：是某些RNA特别是mRNA的而一种加工方式，编辑的结果导致DNA所编码的遗传信息发

生改变。生物学意义：校正作用：有些基因在突变过程中丧失的遗传信息可能通过RNA编辑得以修复；

调控翻译：通过编辑可以构建或者除去起始密码子或者终止密码子；扩充遗传信息：能够使基因产物获

得新的结构和功能，有利于生物进化。

4,RNA的再编码：核糖体程序性7/+1移位、核糖体跳跃以及终止子通读都是再编码的表现方式。RNA

的冉编码可以从一个mRNA产生两种或以上的相互关联但又不同的蛋白质，这也可能是蛋白所合成的一

种调节方式。

5、RNA的化学修饰：甲基化、去氨基化、硫代、碱基的同分异构化、二价键的饱和化、核昔酸的替代。

6,核酶是指一类具有催化功能的RNA分子，通过催化靶点RNA链中磷酸二酯键的断裂，特异性的剪接

RNA分子，从而阻断基因的表达。

练习：

1、说明真核细胞与原核细胞在基因转录，翻译及DNA空间结构方面存在哪些差？

答：1真核细胞中，一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，很少存在原核生物中多操纵子形式；

2高等真核细胞大局部DNA是不转录的，真核细胞中有一局部有几个或几十个碱基组成的序列，在基因

组中重复上百次甚至上百万次，另外，真核细胞的基因组中还存在不被翻译的内含子；

3真核细胞的DNA与组蛋白和大量非组蛋白结合，只有很少的一局部DNA是裸露的；

4真核生物能够有序的根据生长发育阶段的需要进行DNA重排,还能在需要时增加细胞内某些基因的拷

贝数，这种能力在缘何生物中是很少见的；

5在原核生物中，转录的调节区都很小，大都位于转录起始位点上游不远处，调控蛋白结合到调节位点

上可直接促进或抑制RNA聚合酶对他的结合。在真核生物中，基因转录的调节区那么大的多，他们可能

远离核心启动子达几百甚至上千对，虽然这些调节区也能与蛋白质结合,但不是直接影响启动子区对RNA

聚合前的接受程度，而是通过改变整个所控制基因5'上游区DNA构型来影响它与RNA聚合酶的结合能

力。

6真核生物的RNA在细胞核中合成，只有转运穿过核膜到达细胞质后，才能翻译成蛋白质。原核生物中

不存在这样的限制。

7许多真核生物的基因转录后只有经过复杂的成熟后剪接过程.才能被顺利的翻译成蛋白质。原核生物

中就没这么复杂。

2,简述原核生物转录起始与转录终止过程中涉及到的主要蛋白质和核酸结构及其具体作用。

答：转录的起始阶段：涉及到的主要蛋白是RNA聚合酶：RNA聚合酶中的。因子负责模板链的选择和转

录的起始。在此阶段，启动子能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确结合，启动子的结构影响它与RNA

聚合醐的亲和力，从而影响基因表达的水平。除启动子外，增强子对基因的转录也有很大的影响。增强

子无论在转录起始位点的上游还是下游，都有转录增强作用。

终止阶段：P因子参与的终止：P因子能过催化NTP水解促使新生的RNA链从三元转录复合物中解离出

来，从而终止转录。不依赖于p因子的终止；模板DNA上存在终止转录信号一终止子，经止位点上游一

般都存在一个富含GC的二重对称区，该段的DNA转录产生的RNA容易形成发卡式结构。在终止位点前

面有一段4-8个A组成的序列，因此转录产物的3'端为寡聚U,这种结构特征的存在决定了转录的终

止。

第四章生物信息的传递从mRNA到蛋白质

，翻译是指将mRNA链上的核昔酸序列从一个特定的起始位点开始，按3个核甘酸代表一个氨基酸的原

那么，依次合成一条多肽链的过程。

第一节遗传密码一-三联子

1、mRNA链上每3个核苦酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这3个核昔酸就称为一个密码，也叫

三联子密码。翻译时从起始密码子AUG开始，沿着mRNA链上的核昔酸序列从一个特定的起始位点开始，

按3个核昔酸代表一个氨基酸5"-3”的方向连续阅读密码子，直至终止密码子为止，生成一条具

有特定序列的多肽链一蛋白质。

2、遗传密码的性质：

。密码的连续性：一个密码子接一个密码子连续的阅读直至终止密码

②密码的简并性：由一种以上密码子编码同一种氨基酸的现象称为简并，对应于同一氨基酸的密码子称

为同义密码子。

③密码的通用性和特殊性：遗传密码无论在体内还是在体外，也无论是对病毒、细菌、动物还是植物而

言都是通用的。特殊性，支原体中终止密码子UGA被用来编码色氨酸。

。密码子与反密码子的相互作用：在蛋白质生物合成过程中，tRNA的反密码子在核糖体内是通过碱基的

反向配对与mRNA上的密码子相互作用的。在密码子与反密码子配对过程中，前两对严格遵守碱基配对

原则，第三对碱基有一定的自由度，可以“摆动”，因而使其些tRNA可以识别1个以上的密码子。

第二节tRNA

3tRNA在蛋白质合成过程中处于关键地位，它不但为每个三联密码子翻译成氨基酸提供了接合体，还

为准确无误的将所需的氨基酸运送到核糖体上提供了运送载体，所以，它又被称为第二遗传密码。

2、tRNA的结构:

受体臂〔acceptstem,也被称作aminoacidstem）是一**1^7个碱基长的臂，其中包含5'端，与有3'

端羟基〔0H〕〔能结合氨基酸于其上〕的3，端。受体皆有可能含有非Watson-Crick所发现的碱基对。.CCA

尾〔CCAtail〕是tRNA分子3'端的CCA序列，在翻译时，帮助酶识别tRNA。

D臂［Darm］是在一个环〔Dloop〕的端部4个碱基的臂，通常含有二氢尿喀口定（dihydrocridineL

反密码子臂（anticodonarm］有5个碱基，包括反密码子（anticodonL每一tRNA包括一个特异的三

联反密码子序列，能够与氨基酸的一个或者多个密码子匹配。例如赖氨酸〔lysine〕的密码子之一是AAA,

相应的tRNA的反密码子可能是UUU〔一些反密码子可以与多于一个的密码子匹配被称为“摆动

T臂〔Tarm〕是5个碱基的茎，包括序列TWC。

3、tRNA的功能：运输的工具转运氨基酸；解读mRNA的信息。

4tRNA种类：

①起始tRNA和延伸tRNA：能特异性的识别mRNA模板上起始密码子的tRNA叫tRNA,其他的统称为延伸

tRNA

②同工tRNA：代表同一种氨基酸的tRNA叫同工tRNA

③校正tRNA：分为无义突变和错义突变校正。

在蛋白质的结构基因中，一个核昔酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子，使蛋白质

合成提前终止，合成无功能或无意义的多肽。这种突变称为无义突变。无义突变的校正tRNA可改变反

密码子区校正无义突变。错义突变是由于结构基因中某个核苔酸的变化使一种氨基酸的密码变成另一种

氨基酸的密码。错义突变的校正tRNA通过反密码子区的改变把正确的氨基酸加到肽链上，合成正常的

蛋白质。

5,氨酰tRNA合成酶：是一类催化氨基酸与tRNA结合的特异性酶，由它决定氨基酸能否与对应的tRNA

结合，既能识别tRNA,又能识别氨基酸，对两者都具有高度的专一性。

催化反响；AA+tRNA+ATPAA-*RNA+AMP+PPi

第三节核糖体

3核糖体的结构：

。核糖体由大小两个亚基组成。每个亚基都含有一个相对分子质量较大的tRNA和许多不同的蛋白质分

子。

②核糖体蛋白。核糖体上有多个活性中心，每个中心都由一组特殊的核糖体蛋白质构成，形成一个多种

酶的结合体，单个酶或蛋白质只有在这个总体结构上才拥有催化性质，他们共同承当了蛋白质生物合成

的任务。

③核糖体RNAo

2,核糖体的功能：

合成的场所，选择对信息专一的AA-tRNA；

同时容纳另一种携带肽链的tRNA,既肽基-tRNA

核糖体包括至少五个活性中心：

mRNA结合部位、结合或接受AA-tRNA部位、结合或接受肽基TRNA的部位、肽基转移部位及形成肽键的

部位。

第四节蛋白质合成的生物学基质

1、氨基酸的活化：氨基酸必须在氨酰-tRNA合成酶的作用下生成活化氨基酸-AA-tRNA

2、翻译的起始：

。原核生物翻译的起始：

需要的7种成分：30s小亚基、模版mRNA、fMet-tRNA三个翻译起始因子IF-1、IF-2、IF-3、GTP、

50s大亚基、Mg*

第一步：30s小亚基首先与翻译起始因子IF7、IF-3结合，通过SD序列与mRNA模版结合；

第二步：在IF-2和GTP的帮助下，fMet-tRNA伍'进入小亚基的P位tRNA上的反密码子与mRNA上的起

始密码子配对；

第三步：带有tRNA、mRNA三个翻译起始因子的小亚基复合物与50s大亚基结合，GTP水解，释放翻译起

始因子。

②真核生物翻译的起始：

真核生物蛋白质生物合成的起始基质与原核生物根本相同，其差异主要是核糖体较大，有较多的起始因

子参与，其mRNA具有m7GpppNp帽子结构，Met-tRNA-不甲酰化，mRNA分子

5,端的帽子和3'端多聚A都参与形成翻译起始复合物。

3,肽链的延伸：

。后续AA-tRNA与核糖体结合：起始复合物形成以后，第二个AA-tRNA的结合。AA-tRNA与EF-Tu•GTP

形成复合物，进入核糖体的A位，水解产生GDP并在EF-Ts的作用下释放GDP并使EF-Tu结合另一分子

GTP,进入新一轮循环。

②肽键的生成：在核糖体•mRNA-AA-tRNA复合物中，AA-tRNA占据A位，fMet-tRNAk占据P位。在

肽基转移酶的催化下，A位上的AA-tRNA转移到P位，与fMet-tRNA'出上的氨基酸生成肽键。起始tRNA

完成使命后离开核糖体P位点，A位点准备接受新的AA-tRNA,开始下一轮反响。

③移位：核糖体通过FF-G介导的GTP水解所提供的能量向mRNA模板？'末端移动一个密码子，使二肽

基TRNA完全进入P位，准备开始新一轮的肽链延伸。

4,肽链的终止：

肽链延伸过程中，当终止密码子UAA、UAG、UGA出现在核糖体的A位时，没有相应的AA-tRNA能与其结

合，而释放因子能识别这些密码子并与之接合，水解P位上的多肽链与tRNA之间的二酯键，然后，新

生成的肽链和tRNA从核糖体上释放，核糖体大小亚基解体，蛋白质合成结束。

5、蛋白质前体的加工：新生的多肽链大多是没有功能的，必须经过加工修饰才能转变为有活性的蛋白

质：N端千Met或Met的切除、二硫键的形成、特定氨基酸的修饰、切除新生肽链中的非功能片段

6、蛋白质的折叠：新生肽链在细胞内的特定部位，在多种蛋白质的帮助下卷曲成正确构象，大多数蛋

白质的折叠是边翻转边折叠的。至少两类因子参与了折叠过程；酶、分子伴侣。

7、蛋白质合成抑制剂：主要是一些抗生素，如口票吟霉素、链霉素、四环素、氯霉素、红霉素。抗生素

对蛋白质合成的作用可能是阻止mRNA与核糖体结合(氯霉素)或阻止AA-tRNA与核糖体结合〔四环素〕

或干扰AA-tRNA与核糖体结合而产生错读〔链霉素

第五节蛋白质转运机制

，翻译转运同步机制：

一般认为，蛋白质定位的信息存在于该蛋白质自身结构中并且通过与膜上特殊受体的相互作用得以表

达。这就是信号肽假说的根底。这一假说认为，蛋白质跨膜转运信号也是由mRNA编码的。在起始密码

子后，有一段编码疏水性氨基酸序列的RNA区域，被称为信号序列。信号序列在结合核糖体上合成后便

于膜上特定的受体相互作用，产生通道，允许这段多肽在延长的同时穿过膜结构。囚此，这种方式是边

翻译边跨膜转运。

2,翻译后转运机制：

①线粒体蛋白质跨膜转运：蛋白质从核糖体释放后才开始转运。通过线粒体膜的蛋白质在转运之前大多

以前体形式存在，它大多由成熟蛋白和位于N端的前导肽共同组成。蛋白质通过线粒体的内膜的转运是

一种需能过程。蛋白质通过线粒体内膜转运时，首先由膜外的Tom受体复合蛋白识别与Hsp70或MSF等

分子伴侣相结合的待转运多肽。通过Tom和Tim组成的膜通道进入线粒体内腔。

②前导肽的作用与性质：

前导肽对线粒体蛋白的识别和跨膜运转起着关键的作用

性质：带正电荷的碱性氨基酸含量较为丰富，它们分散十不带电的氨基酸序列之间；缺少帚负电荷的酸

性氨基酸；羟基氨基酸含量较高；有形成两亲a螺旋结构的能力。

③叶绿体蛋白质的跨膜转运：叶绿体定位信号肽一般有两局部，第一局部决定该蛋白能否进入叶绿体基

质，第二局部决定该蛋白能否进入内囊体。

3、核定位蛋白的转运基质：核糖体蛋白首先在细胞质中合成，运转到细胞核内，在核仁中装配成40S

和60S核糖体亚基，然后运回细胞质中行驶蛋白质合成机器的功能。

4,蛋白质的降解：大肠杆菌中，蛋白质的降解是通过一个依赖于ATP的蛋白酶〔Lon〕来实现的。当细

胞中出现错误的蛋白或半衰期很短的蛋白质时，该酶就被激活。Lon蛋白每切除一个肽键要消耗2分子

的ATPO成熟多肽N端第一个残基对蛋白质的稳定性有重要影响。

练习：

h真核生物蛋白质的翻译后的加工有哪些？

答：〔1〕信号肽的切除：蛋白质除游离胞浆内发挥作用外，还有一局部要分泌到细胞外和定位于膜系统

中起作用。每个需要运输的多肽都含有一段氨基酸序列称为信号肽，引导多肽到不同的转运系统，到达

目的地后，信号肽被切除。

〔2〕二硫键的形成：在mRNA分子中，没有胱氨酸的密码子，而不少蛋白质分子中含有胱氨酸二硫键，

有的还有多个，且二硫键是蛋白质的功能基团，它是通过两个半胱氨酸的筑基氧化而成的，有的在切除

肽段前就形成。

(3)蛋白质的折叠：肽链的折叠在肽链的合成没有结束前就已经开始。核糖体可保护30-40个氨基酸

长的肽链，当肽链从核糖体中暴露便开始折叠，使线形多肽呈现一定的空间结构。

〔4)糖基化作用使多肽变成糖蛋白，糖蛋白中的糖苔键有两芟：一类是肽链上天冬酰胺侧链上的N原

子与寡聚糖核之间构成N-糖昔键；另一类是肽链上丝氨酸、苏氨酸侧链上的氧原子与寡聚糖核之间构成

的0-糖昔键。

15〕非末端氨基酸残基的修饰：丝氨酸苏氨酸残基的磷酸化；赖氨酸谷氨酸等的甲基化；谷氨酸天冬

氨酸的粉基化。

(6)末端修饰：真核生物多肽的N-末端都是甲硫氨酸，通常N-末端的第一个甲硫氨酸以及更多的N-

末端残基要被除去。

〔7〕前体修饰：有些蛋白质生物合成时是以前体蛋白或多蛋白形式出现的，通过蛋白酶的切割，成为

较小的活性分子。

2、蛋白质合成过程如何保证其翻译的正确性？

(1〕氨基酸与tRNA的专一结合，保证tRNA携带正确的氨基酸；

12〕校正作用：氨酰-tRNA合成酶和tRNA的校正作用；对占据核糖体A位的氨酰TRNA的校对；变异

校对即基因内校对和基因间校对等多种校正作用可以保证翻译的正确；

13〕携带氨基酸的tRNA对mRNA的识别，mRNA上的密码子与tRNA上的反密码子的相互识别，保证了遗

传信息准确无误的翻译；

14〕起始因子和延伸因子的作用，起始因子保证了只有起始氨酰-tRNA能进入核糖体P位与起始密码子

结合，延伸因子的高度专一性，保证了起始tRNA携带的fMet不进入肽链内部。

15〕核糖体三位点模型的E位与A位的相互影响，可以防止不正确的氨酰TRNA进入A位，从而提高翻

译的正确性。

3、简述原核和真核细胞在蛋白质翻译过程中的差异。

11〕原核生物和真核生物和核糖体不同：原核生物为70s型，而真核生物为80s型。

12〕模板不同：原核生物的mRNA为多顺反子，而真核生物的mRNA为单顺反子；

〔3〕起始氨酰tRNA不同：原核生物的为f而真核生物的为Met-tRNA”

(4)原核生物mRNA上可能与16SrRNA配对的SD序列，而真核生物没有这样的序列；

〔5〕延伸因子不一样：原核生物每次反响都需要3个延伸因子。真核生物只需要EF-1、EF-2

〔6〕终止因子不同：细菌内部存在三种不同的终止因子，分别是RF1、RF2、RF3；真核细胞只有一个终

止因子eRFo

第五章现代分子生物学研究方法

DNA、RNA及蛋白质操作技术

(1)DNA根本操作技术

，核酸凝胶电泳技术：

。原理：电泳分子在电场的作用下迁移速率与电场强度及电泳分子本身所带的电荷成正比。由于糖-磷

酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向

正电极方向迁移。在一定的电场强度下，电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型，

②凝胶浓度越高，孔隙越小，其分辩能力就越强，反之，浓度越低，孔隙就增大，分辨能力也随之减弱。

③在凝胶电泳中，适量参加浸乙咤EB,染料对核酸分子进行染色，其能插入到DNA或RNA分子的相邻碱

基之间，并在300nm波长的紫外灯下发出荧光。

。脉冲凝胶电泳PFGE：用于别离超大相对分子质量DNA。由于凉脂糖凝胶的电场方向、电流大小、作用

时间都在变化，与相对分子质量较小的DNA相比，相对分子质量交大的DNA需要更多的脉冲次数来更换

其构型和方向。

2、细菌转化transformation

。是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。

②CaCI?法是制备大肠杆菌感受态最常用的化学方法，将快速生长的大肠杆菌置于经低温预处理的低

渗溶液中，便会造成细胞膨胀，细胞膜通透性发生改变，极易于外源DNA相粘附并在细胞外表形成复合

物。此时，将该体系转移到42℃下作短暂的热刺激，外源DNA就可能被细胞吸收。

③电击法：锐利的电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，并由此形成纳米级疏水孔洞。随着跨膜电压增加,

一些较大的疏水性孔洞就会变为亲水性孔洞.在孔洞开放的时候，介质中的DNA很容易通过孔洞进入进

入细胞质。

3,聚合酶链反响技术PCR

标准的PCR过程分为三步：

ODNA变性〔909-969〕：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA

②.退火［25匕-65(〕：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

①延伸〔70℃-759〕：在Taq酶〔在72℃左右，活性最正确〕的作用下，以dNTP为原料，从引物的5'

端T3,端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一

倍。

实时定量PCR；

PCR:PolymeraseChainReaction利用带荧光检测的PCR仪对整

个PCR过程中扩增DNA的累积

30-40cyclesof3steps:

速率绘制动态变化图，从而消

Step1:denaturation除了在测定终端产物丰度时有

较大变异系数的问题。

1minut94℃

师而1曲1111「印1川|1IIMTHITH而inIIIIIrrniii।I「IIIniTaqMan探针：是一段被设计成

可以与靶DNA序列中间部位结

11nli

合的单链DNA,并且该单链DNA

序列的5'和3'端带有短波长

和长波长的两个不同荧光基

Step2:annealing

团。这两个基团由于距离靠的

45seconds54℃太近，在荧光共振能量转移作

用下会发生荧光猝灭，因而检

1kliforwardandreverse

3111nli5.primers!!!测不到荧光。随着PCR反响的

进行，TaqMan探针结合到目的

DNA上，并且会被具有外切酶活

5

mrnrniiniiETii।们"1^丽师!丁印山「「|「1「川ysten3•extension性的TaqDNA聚合酶逐个切除

1，、1,-皿川Huoiiiiiiiiiijiihf呼

而降解。被切下来的荧光基团

ii1、1》//2minutes72℃

解除了荧光猝灭的束缚，会在

onlydNTPs

激发光下发出荧光，因此，所

(And>3clzI发出的荧光强度直接反映了扩

增DNA的总量。

TaqMan探针三个要素：一端的短波长荧光基团菱形；一段目的DNA特异的碱基序列；另一端长波长荧

光基团小圆形。

4,基因组文库的构建

把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。聚集包含基因

组中所有DNA序列的克隆，这样的克隆片段总汇，称为基因组DNA文库。在基因组文库构建中采用两种

策略提高文库代表性：一是用机械切割法或限制性内切酶切割法随机断裂DNA,以保证克隆的随机性。

而是增加文库重组克隆的数目，以提高覆盖基因组的倍数。

(2)RNA根本操作技术

1、总RNA提取：

目前实验室最常用的方法是用异硫番酸肥-苯酚抽提法。Trizol试剂是使用最广泛的抽提RNA专用试剂,

主要由苯酚和异硫氨酸胭组成，可以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的RNA释放出来，并使

核糖体蛋白与RNA分子别离，还能保证RNA的完整。

2、RNA的纯化：

实验室常用寡聚dT-纤维素柱色谱法获得高纯度的mRNA。该方法利用mRNA3'端含有ployA+的特点，

当RNA流经再聚dT纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异性的结合在柱上，在用低盐溶液

或蒸储水洗脱mRNAo经过两次寡聚dT纤维素柱后可得到较高纯度的mRNAo

3、cDNA的合成:

第一条cDNA的合成是以mRNA为模板，反转录成cDNA,由反转录酶催化，该酶合成DNA时需要引物引导,

常用的引物是。lig。dT。第二条cDNA是以第一条链为模板，由DNA聚合酶催化。

4.基因文库的筛选：

。核酸杂交法：用放射性标记的特异DNA探针适用于高密度的菌落杂交筛选。将一张圆形纤维素膜放在

一个装有琼脂培养基的培养皿外表，将带筛选菌落从其生长的平板上转移到硝酸纤维素模上，进行适当

温育。同时保存原来的菌落做对照。取出已长有菌落的膜，用碱液处理，使菌落发生裂解，DNA随之变

竹。接着用蛋白酶K处理硝酸纤维素膜去除蛋白质，形成菌落DNA的印记℃烘烤滤膜，将DNA固定在滤

膜上。将滤膜与放射性标记的DNA或RNA探针杂交，通过放射性自显影显示实验结果。在X线片上显黑

色斑点的就是实验中寻找的目的克隆，可以通过对应平板上的位置找到相应克隆。

②PCR筛