2026年高考生物压轴强化训练：基因工程与PCR压轴必考（6大题型突破+压轴强化训练）原卷版+解析

压轴题05基因工程与PCR压轴必考

（6大题型精析）

基因工程与PCR是高考生物压轴核心模块，选择+非选择双重考杳，非选择常以科研

情境大题形式出现，是拉开分数差距的关键，需重点突破。

核心考向：1.基因工程核心工具与步骤；2.PCR技术原理与操作；3.目的基因的检测与

鉴定；4.基因工程与育种、疾病治疗的实践结合；5.基因工程的伦理与安全问题；6.基因工

命题预测程与其他生物技术（如细胞工程、胚胎工程）的综合应用。

2026命题趋势：强化科研真实情境创设，多取材于基因编辑、转基因作物培育、基因治

疗等前沿领域，跨模块、跨学科融合趋势明显，侧重考查科学思维、实验设计与知识迁移能力。

备考关键：夯实核心概念与操作流程，精练情境类真题，熟练”步骤分析、原理阐释、实验设

计”三类答题模板，规范术语表达，提升压轴题解题效率。

1.基因工程核心工具辨析

2.基因工程核心步骤分析

3.PCR技术原理与操作

高频考法

4.目的基因的检测与鉴定

5.基因工程的实践应用与伦理

6.基因工程与其他生物技术综合

・知识技法•思维

A题型01基因工程核心工具辨析

类别具体内容

1.限制酶：识别特定核甘酸序列，切割磷酸二酯键，产生黏性末端或平末端，具有特异性；2.DNA

连接酶：连接DNA片段的磷酸二酯键，区分E-coliDNA连接前（仅连黏性末端）和T4DNA连

重点知识接酶（连黏性末端和平末端）；.载体：常用质粒（小型环状DNA,含启动子、终止子、标记基

因、目的基因插入位点），此外还有噬菌体、动植物病毒，需具备自我复制、多克隆位点、标记

基因等条件

1.工具功能区分：限制酶“切割”、DNA连接酶“连接”、载体“携带目的基因”，避免功

答题技巧

能混淆；2.标记基因答题要点：明确其作用是“筛选含目的基因的受体细胞”，常见类型（抗

类别具体内容

生素抗性基因、荧光蛋白基因）及筛选原理；术语规范:表述时需明确酶的具体作用对象（如“限

制能切割特定核苜酸序列”），载体的关键组成部分不可遗漏

A题型02基因工程核心步骤分析

类别具体内容

1.目的基因获取：从基因文库中获取、PCR扩增、人工合成（化学合成法，适用于已知核昔酸

序列的短基因）：基因表达载体构建（核心步骤）：目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在、

复制、表达和发挥作用，构建过程为“限制能切割载体和目的基因一DNA连接能连接形成重

重点知识组载体”；3.目的基因导入受体细胞：植物（农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法）、动

物（显微注射法）、微生物（感受态细胞法，用Ga?，处理）；4.目的基因的检测与鉴定：分子

水平（DNA分子杂交一检测目的基因是否导入；分子杂交一检测目的基因是否转录；抗原-抗

体杂交一检测目的基因是否翻译）、个体水平（抗虫、抗病等性状鉴定）

1.步骤逻辑梳理：按“获取一构建一导入一检测”顺序记忆，明确每一步的核心目的；2.导

入方法匹配受体细胞：看到“双子叶植物”优先想到农杆菌转化法，“动物细胞”对应显微

答题技巧注射法，“微生物细胞”对应感受态细胞法；3.检测方法区分：“是否导入”看DNA分子杂

交，“是否转录”看分子杂交，“是否翻译”看抗原-抗体杂交，答题时明确“检测对象一

检测方法一结果判断”

A题型03PCR技术原理与操作

类别具体内容

1.原理：DNA半保留复制，需模拟体内DNA复制的条件（模板、引物、原料、酶）；2.核心

条件：模板DNA（含目的基因）、一对引物（分别结合目的基因两端，方向相反）、dNTP（原料）、

Taq酶（热稳定DNA聚合酶，耐高温）、缓冲液；3.过程：变性（90-95℃,DNA双链解旋为

重点知识

单链）一复性（55-60℃,引物与单链结合）一延伸（72℃,Taq酶催化子链合成），循环多次

实现目的基因扩增；＞4.特点：特异性强（依赖引物与模板的特异性结合）、快速高效（循环30

次可扩增数百万倍）

1.条件答题模板：“物质+作用”，如“Taq酶一一耐高温，催化DNA子链合成”“引物

■定位目的基因，启动DNA复制”；2.过程温度与结果对应：变性（高温解旋）、复性（中

答题技巧温结合）、延伸（适温合成），避免温度与过程混淆；＞3.扩增倍数计算：若初始模板为n个，

循环n次后，目的基因数约为nX2n（不考虑误差）；4.与体内DNA复制对比：突出PCR的

“耐高温陋”“人工合成引物”“体外恒温循环”特点

A题型04目的基因的检测与鉴定

类别具体内容

1.分子水平检测（核心）：DNA分子杂交：探针与受体细胞DNA杂交，检测目的基因是否导

入；-分子杂交（RNA杂交）：探针与受体细胞mRNA杂交，检测目的基因是否转录；抗原-

重点知识抗体杂交：检测目的基因是否翻译出蛋白质；.个体水平鉴定：通过观察受体细胞或个体的性状

（如抗虫性、抗病性、产特定蛋白质），验证目的基因是否发挥功能；3.探针特点：放射性同

位素或荧光标记的、与目的基因互补的单链DNA或RNA

答题技巧1.检测层次区分：“导入一转录一翻译一功能”，层层递进，答题时明确检测的层次和对应的

类别具体内容

方法；2.探针答题要点：明确探针的“标记方式”和“特异性结合对象”（如“与目的基

因互补的单链DNA探针，用放射性同位素标记”）：3.结果表述规范：如“DNA分子杂交出

现杂交带一目的基因已导入”“抗原-抗体杂交出现杂交带一目的基因已翻译”

A题型05基因工程的实践应用与伦理

类别具体内容

1.实践应用：-农业：培育抗虫（Bt毒蛋白基因）、抗病、抗逆（耐盐碱、抗除草剂）、优

质（高产、高品质）转基因作物：-医药：生产胰岛素、干扰素等药物，进行基因治疗（治疗

重点知识遗传病，如血友病、先天性免疫缺陷病）；-环保：培育降解污染物的转基因微生物；2.伦理

与安全问题：食品安全（转基因食品的安全性）、生态安全（转基因生物对•生态系统的影响）、

伦理争议（如基因编辑婴儿），相关法规与监管

1.应用情境匹配：看到“抗虫作物”想到Bt毒蛋白基因，“胰岛素生产”想到基因工程菌，

“遗传病治疗”想到基因治疗；2.伦理问题答题模板：“观点+理由”，如“支持转基因作

答题技巧物培育一一可提高粮食产量，缓解粮食短缺问题；需加强监管一一避免对生态环境造成潜在

影响”；3.表述客观：分析应用价值时突出优势，讨论安全问题时不绝对化，体现科学辩证思

维

A题型06基因工程与其他生物技术综合

类别具体内容

1.与细胞工程结合：转基因植物培育需结合植物组织培养（将导入目的基因的受体细胞培育为

完整植株）；转基因动物培育需结合动物细胞培养、胚胎移植；2.与胚胎工程结合：转基因动

重点知识物培育中，将含目的基因的受精卵培育为早期胚胎，再进行胚胎移植获得转基因个体；3.与基

因编辑技术结合：CRISPR-C&S9技术编辑日的基因后，通过基因工程导入受体细胞，实现基因的

定向改造

1.综合题逻辑梳理：明确不同技术的“角色”，如“植物组织培养一一为转基因植物培育

提供完整植株培育技术”“胚胎移植一一为转基因动物培育提供胚胎着床和发育的途径”：.

流程表述规范：按“技术顺序+核心步骤”作答，如“转基因抗虫棉培育流程：获取Bt毒

答题技巧

蛋白基因一构建基因表达载体一导入农杆菌一农杆菌转化棉花细胞一植物组织培养一抗虫鉴

定”；关键技术关联：突出不同生物技术之间的衔接点（如“受精卵”是转基因动物培育与

胚胎工程的核心衔接对象）

—•典例•靶向•突破•一

A即型01基因工程核心工具辨析

聚乙烯型塑料应用广泛，但其难降解的特性带来了诸多环境问题。聚酯酰胺（PEAs）的可水降解性使其有望成

为聚乙烯的替代品。某科研团队利用大肠杆菌构建能合成PEAs的工程菌，如图1表示合成PEAs相关基因

连接形成的DNA片段，其中①②③④为引物，图2为载体质粒结构示意图。回答下列问题：

①

5'r

下游PEAs合成串联基因上游

3“5'

LacZ基因四环素抗性基因

图1图2

注:Pl、P2表示启动了;“-1〃表示折制作用。

⑴利用PCR技术扩增PEAs合成串联基因时，为保证PEAs基因能高效表达，应将强启动子碱基序列的

端与引物—连接，另一个用于扩增的引物是—。在PCR反应体系中，一般要添加Mg2+,目的是

(2)研究人员将强启动子修饰后的PEAs合成串联基因插入图2载体质粒的位点1和位点2之间。图中的LacZ

基因编码产生的酶可以分解X-gal,产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。为了筛选出含有PEAs

合成串联基因的大肠杆菌，应在培养基中加入，并选把_______的菌落。

⑶为了避免工程菌在使用后逃逸造成环境污染，研究人员利用CRISPR/Cas9系统为工程菌增加了自毁保护体

系，机理如图2所示。研究结束后，在培养液中加入B物质，B物质通过_______,使gRNA基因和Cas9

基因表达，gRNA和Cas9蛋白形成复合物后，gRNA通过________识别目标DNA,Cas9蛋白对目标DNA

进行剪切，最终使大肠杆菌死亡。gRNA基因可设置为(填"毒蛋白基因”或“生长必需基因")的特异性序

列。

⑷有人提出还可以在A蛋白基因上游增加一个温度诱导自毁体系，这样做的优点是。

A四型02基因工程核心步骤分析

香菇是具有丰富营养价值和药用价值的食用真菌，被称作"山珍之王"。研究人员发现香菇体内的Lp-11蛋白

具有抑制肿瘤细胞生长并诱导细胞凋亡的作用。为了获得大量纯净的Lp-11蛋白，研究人员操作流程如图1,

序号①-④表示各个环节。回答下列问题：

尸。:启动子限制能识别序列及切割位点:

“i：发刷原点BamHI

Mun\MunI:CAATTG

/%R：氨甘青霉素抗性基因Xho\

后":卡那霉素抗性基因Xho\：CTCGAG

KanH

cDNAEcoRI：GAATTC

AmpK

0②ET32a质SalilGTCGAC

EcoRi

BamMX：GGATCC

b§HQ1OH

转聚方向一►提纯

Lp-U基因重组表达载体—＞重组大肠杆菌一OLp-11蛋白

图1④⑤

注:pET32a质粒上的KanR中沿转录方向标注的5个限制酶的酶切位点之间的距离依次为40bp、30bp、90bp、

50bp,bp表示碱基对。

⑴图1过程①需要在_____酶的作用下进行。①②过程获取的目的基因不含（答出2点）。

（2）为使目的基因与pET32a质粒（长度为5900bp）正确连接，在设计PCR引物时可将引物的（3或

5,）端添加限制的的识别序列，与a链和b链相结合的引物上添加的分别是限制酶、的识别序

列。若计划用1个Lp-11基因为模板获得n个Lp-11基因，则PCR过程中消耗的引物总量是______个。

⑶图1的④过程，通常先用_____将受体细胞处理成感受态，此时细胞的特点是。受体菌应筛选出

（填"具有”或“不具有〃）氨茉青霉素抗性的大肠杆菌。

⑷为了检测目的基因是否插入到pET32a质粒中，利用目的基因两端添加的限制酶切割质粒，然后对产物进

行电泳，结果如图2。样品最可能是插入了目的基因的重组质粒。

M样品1样品2样品3样品4样品5

点样孔

6000bp

5700bp

400bp

120bp

图2

除题型03PCR技术原理与操作

某自花、闭花传粉植物的花瓣末端展开如匙，称为匙瓣，具有较高的观赏价值。研究人员通过诱变获得一

个纯合平瓣突变体甲，并对其进行了相关研究。回答下列问题：

甲WT

M泳道1泳道2泳道3泳道4泳道5

2000bp1-11_____11_____11_____1

1960bpl960bp1960bp

1500bp1一~11530bp1530bp

lOOObpc=iHOObpHOObpHOObp

图1

⑴为确定匙瓣野生型（W）和平瓣突变体甲未发生染色体变异，可通过分析其来判断。将纯合匙瓣

野生型和平瓣突变体甲杂交得到%若Fi的表型为,则可确定该突变为显性突变。

⑵若已确定平瓣为显性性状，控制该植物花瓣形状的基因为B/匕，将Fi与突变体甲等量间行种植，且二者

产生后代的过程中不发生变异，每株收获等量的后代，利用图1PCR技术扩增这些后代的基因B/b,电泳检

测PCR产物，得到的电泳条带不可能是图1中的泳道_______（从泳道1〜5中选择），子代中基因型不同

的个体的比例为,其中表现为平瓣的个体所占比例为。

⑶图2为研究人员对基因B、b编码链的部分测序结果。据图可知，基因B是基因b发生碱基对的

导致的，使，导致基因b编码的肽链变短、蛋白质功能下降，最终导致花瓣由匙瓣变成平瓣。

.第1位碱基|第220位碱基

b基因序歹IJ5-ATGGAAGAGCTCACGGCTTTTGTATCC.......CACGTAGACAA-3'

B基因序歹IJ5-ATGGAAGAGCTCACGGCTTTGTATCC........CACGTAGACAA-3'

图2

注：终止密码子：UAA、UAG、UGA

I►题型04目的基因的检测与鉴定

异丁胺是一种重要的化工原料•，其胞内合成代谢途径见图8。通过微生物发酵生产异丁胺时常难以兼顾菌株

生长和产物合成间的平衡，研究人员尝试利用基因工程技术提高菌株的生产能力。回答卜.列问题：

朝萄俄

'vlmDM

CO#NADH—巴人------。丙承酸f--------、异丁胺

（1）据图8推测，真核细胞中TCA循环发生在线粒体（填”基质〃或"内膜。将asgltA基因导入菌株中，

其转录形成的RNA能与gltA基因的mRNA结合形成部分双链，gltA基因表达的（填“转录”或”翻译〃）

过程受阻，减少丙酮酸进入TCA循环，积累丙酮酸用于异丁胺的生产，但此时菌株的生长未受明显影响。

⑵为实现利用温度对大肠杆菌代谢的调控，研究人员构建了两种质粒（图），并分别以红色荧光蛋白mCherry

和绿色荧光蛋白GFP为模式蛋白，检测质粒的调控能力。

08丙第酸

—GpdhR蛋白

Pireboi.J■

质粒1

注：PRM为持续性表达启动子，PR和Pire-box为特异型启动子（分别被Q蛋白二聚体和pdhR蛋白识别并抑

制），T符号代表抑制，I代表终止子。

①为了使细胞中质粒1中mCherry蛋白的表达同时受到温度和丙酮酸的调控，可在质粒2的一处（填

或“B〃）插入pdhR基因，将改造后的质粒1和质粒2导入敲除pdhR基因的大肠杆菌获得菌株L1,菌株L1

在30团时会发出___色荧光。

②3dhR蛋白无法结合天然启动子Ptre.在Ptre后插入box序列即可得到质粒1中的启动子Ptrc-boxo研究

人员通过右图实验（如图）证明pdhR蛋白可以直接结合启动子Ptrc-box,由此推测，实验中P是指无荧光

标记的（填“Ptebox〃或“无关启动子〃），并在泳道5的方框中补充可能的条带宽度。

泳道II2345

pdhR|+++4-

Ptrel---4-

荧光标记|

+++++

的Pgbox।

P|+10X-

电

泳

方

向

注：+表示添加，-表示未添加；

10X表示添加含量：是标记探针的10倍；

条带1/2都可检测到荧光

（3）已知丙酮酸在细胞内积累到2g/L时，才能解除pdhR对Ptrc-box的抑制作用;asgltA转录形成的RNA的

抑制作用可长时间维持。请完善以下表格，以实现动态调节大肠杆菌的代谢途径从而提高异丁胺的产量。

操作目的

获得在生长阶段（37回）

对菌株L1的质粒和遗枳累丙酮酸并抑制生

传物质进行改造：产，而在生产阶段

（300）抑制生长的工

程.菌。

控制发酵温度先为370,当监测到_____时将温

度切换为300o

A题型05基因工程的实践应用与伦理

下图为某家系中甲病（基因为A、a）和乙病（基因为B、b）两种单基因遗传病的系谱图，己知齐5无乙病致

病基因，乙病在男性中的发病率为0.2,不考虑基因突变和染色体变异，请回答下列问题:

□O正常男女

物如患甲病男女

6・•患乙病男女

a«0察患两种病男性

12345678

⑴甲病的遗传方式为，调查此病的发病率关键是___________。团-5的基因型为。

⑵若耳1与人群中正常女性婚配，生育一个同时患甲乙病的孩子的概率为；若（3］与耳7婚配，

生育一个同时患甲乙病的孩子的概率为o

⑶运用生物学所学知识结合此题分析，优生优育的措施o（答2点）

⑷已知甲乙病有关基因碱基序列情况，及限制酶M和限制酶N作用位点，现探究某位患甲病的女性的基因

型，请设计基于PCR和电泳技术的实验方案，询要写出实验过程、预期结果及结论。

5'AAGGTTAAGCTTAACCTT3，

A基因..lOObp...…200bp...限制醉M

3,TTCCAATTCGAATTGGAA5'

AAGCTT

5'AAGGTTATGCTTAACCTT3，TTCGAjA

a基因.lOObp...…200bp...

3,TTCCAA.…

TACGAATTGGAA5'

5ZGGACTTTACGTTGAGGTG3'限制酶N

B基因.150bp...…250bp...I

3'CCTGAAATGCAACTCCAC5'

ACGT

TGCA

5,GGACTTTACGTTGACGTG3r

b基因.150bp....….250bp...

3'CCTGAA

ATGCAACTGCAC5'

①请写出该实验的主要操作步骤中的四个关键阶段：

②预期结果及结论：若电泳得种条带，则其基因型为。（请写出所有的情况）

A题型06基因工程与其他生物技术综合

顺的是一种抗肿瘤药，普遍用于肺癌等癌症的治疗，但长期使用会使癌细胞产生耐药性。科研人员研究了

miRNA,糖酵解与乳腺癌细胞（MCF7）耐药性之间的关系。

⑴在氧气充足条件下，正常细胞主要通过有氧呼吸第阶段产生ATP。但某些肿瘤细胞即使在有氧条

件下，也主要通过糖酵解产生ATP,被称为有氧糖酵解。

⑵为获得耐药性较强的MCF7细胞，可在MCF7培养液中加入顺钳，当存活的细胞达到一定数量后，用

处理并传代培养。每次传代时，增加培养液中顺德的剂量。

⑶检测MCF7耐药株与非耐药株在顺的处理后的乳酸产量，结果如下图1。由图1可知，耐药株的有氧糖酵

解强度_______非耐药株。

(

U

U

I

・

O

U

I

U

)

非耐药株耐药株

图1

⑷耐药株中miR-485-5p(一种miRNA,可与靶基因的mRNA结合)的表达量明显低于非耐药株。为研究

miR-485-5p与M基因的关系，在MCF7细胞中过表达或敲低miR-485-5p后，电泳分离细胞裂解物，用抗M

蛋白抗体检测，结果如下图2。

对照组敲低组

M蛋白|—'―一IM蛋白—■

内参内参

非耐药株耐药株

图2

图2结果表明miR-485-5p,得出此结论的依据是。

(5)在MCF7细胞中过表达或敲低M基因，检测乳酸产量，结果如下图3。过表达M基因时非耐药株对顺伯

的抗性增强，敲低M基因时耐药株对顺钳的抗性减弱。

■对照组

…80「口敲低M组

w□过表达M组

s

・

o40

l

u

)

0□

非耐药株耐药株

图3

综合上述研究，说明MCF7产生耐药性的机制

□r11

1.关于“琼脂糖凝胶电泳”实验，下列叙述错误的是（）

A.根据待分离DNA片段的大小，需用缓冲液配制0.8%〜1.2%的琼脂糖溶液

B.向琼脂糖溶液中加入适量的核酸染料后，需在沸水浴内加热至琼脂糖熔化

C.将PCR产物和载样缓冲液混合后，需用微软移液器将混合液缓慢注入加样孔

D.待指东剂前沿迁移接近凝胶边缘时，需及时断电并取出凝胶置「紫外灯下观察

2.小麦因M基因存在易被布氏白粉菌感染而患白粉病，导致严重减产。科研人员利用农杆菌转化法，

gRNA-Cas9复合体可对DNA的特定序列识别并剪切，因此将gRNA基因和Cas9蛋白基因导入到小麦中，对

M基因进行敲除，使其无法表达。其中PAM序列可帮助复合体定位目标DNA序列3,端。相关过程如图1所

PAM序列PAM序列

•-----1J----*

5,-AGATGCATATC(XGGAGATrGGGT(Xn,GCGTGA)XXjr3/

3,-TCTACGTATAG<KK：(4rCrAACqCAGG^CGCAClkjCG-5,

匚目标Avail限制解

DNA醉切位点

图1图2

（l）gRNA中的识别序列与目标DNA的相应序列特异性结合遵循原则，Cas9蛋白作用的化学键是

（2）为了不破坏其他正常基因，需要设计•gRNA精准识别的靶向序列。科研人员对小麦M基因测序，部分结

果如图2所示。若在后续利用限制酶Ava团进行辅助检测，则gRNA上的靶向序列应设计为5'3,（写

出12个碱基）。

⑶利用图3中的载体1与载体2构建携带gRNA基因和Cas9蛋白基因的最终表达载体，应选择使用的限制

酶有,最终表达载体还应具备的基本元件有（写出两点）。表达载体导入农杆菌后,

利用含的培养基筛选出阳性菌落。

SpcI5'-ACTAGT-3'

SpeI3'-TGATCA-5'

5'-G(3TAGC-3'

NheI

5'-GGTCTCN-3'

BsaI

3'-CCAGAGNNNNN-5,

SpeIBamHIIt

51-GGATCC-3'

BamHI3'-CCTAGG-5'

注：IB、RB分别为农杆菌中T-DNA的

左边界和右边界。右侧为几种限制酶的

识别序列和切割位点，N代表任一碱基

图3

⑷对转化成功的小麦植株M基因相关序列进行PCR扩增，用限制酶Ava团酶完全酶切并电泳检测。电泳时需

要用缓冲液来配制琼脂糖凝胶。若检测结果出现1个条带，则该植株为M基因（填

“敲除”或"未敲除”）的植株。

3.苏氨酸是常用工业原料，目前主要通过大肠杆菌发酵生产。当细胞中苏氨酸含量较高时，会抑制苏氨酸

合戊能基因的转录。A基因编码的A蛋白位于大肠杆菌细胞膜上，可将苏氨酸运出细胞。我国研究者尝试利

用基因工程技术提高菌株生产能力。

识别序列剪切序列转录方向引物2

-GGTCTCN：NNNNN-3'5'AGCGTGCT.........ATTTGGTCG3/

BsaI...........；.

-CCAGAGNNNNN：N-5,3'TCGCACGA.......TAAACCAGC5Z

引物1基因A

注：N代表任意碱基

核酸酪Bsa团具有偏移剪切特性，其识别序列及切割位点如图1所示。

⑴Bsa回酶切DNA中的键，产生（类型）末端。Bsa!3酶切图1中载体产生的末端

（填"相同"或"不相同"或“不完全相同”）o

⑵为构建A基因一RFP（红色荧光蛋白）基因表达载体，需在图1中载体的Bsa0酶切点处插入基因A。为保

证基因A对应的基因序列与载体正确连接，应在扩增该基因时通过引物添加相关序列，则引物2的序列为

5,3y写出前12个碱基）。若要通过PCR检测A基因一RFP基因表达载体构建是否成功，应选择图

1中的引物组合O

⑶筛选导入A基因一RFP基因表达载体的大肠杆菌工程菌时，若选用缺少苏氨酸的完全培养基能否达到目的,

请做出判断并说明原因___________________________________..

⑷为探窕外源A基因表达水平对工程菌苏氨酸产量的影响，分别将利用三种具有持续表达活性的启动子的

A基因一RFP基因表达载体导入大肠杆菌菌株W中，获得三种工程菌，相关处理及结果如图2。

4RFP20

载体1基因终止子终止子-•

基因1500灵

苏1000

*5光

-•500

60强

雪40

•度

A■

RFP广

终止子15020

载体2基因终止子基因相

1I

•对

附■

O

■值

■.■

RFP菌株

载体3J-03、金终止子J-03终止子w八W

载

含-03

载

'-002俏

皑

启动W启动子,基因(线

图2

①图中菌株W-01、菌株W-02、菌株W-03三组实验的荧光强度相对值可反映。

②工程菌W-01苏氨酸产量显著高于菌株W的原因是＜，

4.低温逆境胁迫是造成农作物减产的主要因素之一。植物冷诱导基因（COR）是由冷胁迫调节的一类基因,

能在低温等条件下被激活产生冷调节蛋白，提高植物的抗寒性。研究人员欲借助农杆菌转化法将COR基因

导入马铃薯细胞，以获得抗冻的马铃薯品种。结合下列图解，问答下列问题。

'引物1引物3一^0"K比

------引物2用物4----------

转录的模板链

图ICOR基因

MfeIEco\<I

I

SmaI5'-CCCGGG-3'

MfeI5'-C/\ATTG-31

Kpn\5'・GGTAC%・3'

*

右边界

注:LB、RB分别为T・DNA的左、EcoRI5'-GAATTC-3'

hyg为潮盘索抗性基因Acc65IS'-GGTACC-S*

Kan「为卡那双素抗性基因

图3相关限制前以别序列及切割位点

图2Ti质粒

⑴若采用PCR技术对n个COR基因进行扩增，第3次循环需要个引物1和个引物2。

（2）启动子可分为组成型启动子（每种组织器官中均发挥作用）、组织特异型启动子（特定组织器官中才能

发挥作用）和诱导型启动子（特定条件刺激才能发挥作用）。为使马铃薯块茎在低温刺激下才启动COR基

因的表认，构建的基因表达我体中含有的启动子类型应包括o终止于相当于•盏红色信号灯，可使

停止催化相关核昔酸链的延伸。

⑶构建基因表达载体时，若遇到平末端与黏性末端无法连接，可先用Klenow酶（具有与DNA聚合酶作用

相似的特性）将黏性末端补平，或先用T4DNA聚合酶将3，-黏性末端切平，然后再与平末端连接。现已知COR

基因的A端已被限制酣Kpn团切割，B端已被限制幅EcoR团切割,为使COR基因与质粒正确连接，需选用

酶对COR基因的端进行加工处理；不选用另一种酶的原因是。

⑷筛选被农杆菌成功转化的马铃薯细胞时，需使用含的选择培养基。

5.弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）最具代表性的特异性抗原是CD20,超过95%的DLBCL病例强表达CD20。

抗原蛋白CD19在正常B细胞和DLBCL细胞表面都可稳定、高密度表达，也是B细胞受信号通路的重要组成

部分。双靶点嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法是未来治疗DLBCL的发展方向，科学家将患者T细胞改

造成同时表达CD19抗原受体和C320抗原受体（对应基因简称为CAR基因）的CAR-T细胞。其基本流程

如图1、2所示：

患者体内

pEFIaCAR基因NeoRMS

注:箭头所示为启动子或基因片段及其转录方向；pEFIa是

一种核糖体蛋白基因的启动子；NeoR是新霉素抗住基因

图2

⑴从患者体内获取的T细胞主要有辅助性T细胞（Th）和细胞毒性T细胞（Tc）,由Th细胞改造完成的CAR-T

细胞受到抗原刺激后，可分泌，促进正常B细胞的增殖分化；由Tc细胞改造完成的CAR-T细胞裂解

DLBCL细胞需要受到的双信号刺激才能进行。

（2）CD19CAR-T细胞长期激活可能导致正常B细胞耗竭，影响体液免疫功能。为降低该风险，结合题H信息，

从图2和图3中选择部分或全部元件，设计新的基因表载体，在答题卡相应位置画出元件排列顺序示意

图(一个基因单独或多个基因拼接共用一个启动子为一个元件)，并辅以必要的文字说明

vp3基因nTA基因pTRE

注:vp3基因表达可送导细胞凋亡：nTA基因表达产物结合四环

素类抗生素后，能激活TRE启动子(pTRE)下游的基因表达

图3

⑶图4为利用无缝克隆(In-Fusion)技术构建含CAR基因的重组质粒流程图，其中In-Fusion的可以将任

何具有相同15~2Obp末端序列的线性DNA分子进行无缝连接，实现高效稳定的同源重组。

①图中过程用是利用PCR技术将质粒线性化，为了保证扩增后的产物是图中所示的线性质粒，应该选择引物

。CAR基因序列可以由生物科技公司合成，扩增CAR基因时，引物F和R序列要依据的末

端序列设计。

②为了筛选、鉴定构建成功的重组质粒，科研人员进行了如下操作：将重组质粒导入大肠杆菌，菌液涂布

到含的培养基中，培养适宜时间后，挑取菌落并加入等进行菌落PCR,并通过电泳鉴定PCR

产物。

③与传统构建重组质粒的方法相比，In-Fusion技术的优点有。(答出两点即可)

方案二：载体中

元件组合1元件组合2

出现元件组合1和元件组合2,治疗完成后服用四环素诱导CAR-T细胞调亡: