丘脑背外侧核CREB表达下调对学习记忆功能的影响：基于siRNA技术的探究

丘脑背外侧核CREB表达下调对学习记忆功能的影响：基于siRNA技术的探究一、引言1.1研究背景学习与记忆是大脑的高级神经活动，在生物的生存和发展中起着至关重要的作用。从简单的单细胞生物到复杂的人类，记忆帮助生物适应环境、学习新技能并传递经验。对于人类而言，学习记忆是获取知识、发展智能、适应社会的基础，其功能的正常运作直接影响着个体的生活质量、工作效率以及社交能力。而在生物界，动物通过记忆来识别食物来源、躲避天敌、寻找伴侣和建立领地，这些记忆行为对于物种的生存和繁衍至关重要。环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-responseelementbindingprotein，CREB）是一种在细胞内信号传导和基因转录调控中发挥关键作用的核转录因子。在神经系统中，CREB的激活与学习记忆过程密切相关。当神经元接收到刺激信号时，细胞内的信号转导通路被激活，导致CREB的磷酸化。磷酸化的CREB能够与特定的DNA序列（cAMP反应元件，CRE）结合，从而启动一系列与学习记忆相关基因的转录和表达，这些基因产物参与了神经元的可塑性、突触的形成与强化以及新蛋白质的合成，进而对学习记忆产生影响。丘脑是感觉传导的重要中继站，也是神经系统中一个关键的结构，它与大脑皮层、海马、杏仁核等多个脑区存在广泛的纤维联系，在感觉、运动、情感和认知等多种生理功能中发挥重要作用。丘脑背外侧核（Laterodorsalthalamicnucleus，LD）作为丘脑的一个组成部分，近年来逐渐受到研究者的关注。研究发现，丘脑背外侧核中的神经元对各种刺激，特别是与躯体感觉和本体感受相关的刺激，能够作出反应，在整合内部和外部环境信息后涉及空间定向。同时，大量动物实验表明，丘脑背外侧核参与了多种模式下的联合学习或记忆任务，但其具体机制尚未完全明确。目前，虽然对CREB以及丘脑背外侧核在学习记忆中的作用已有一定研究，但对于两者之间的联系，特别是通过siRNA下调丘脑背外侧核中CREB的表达对学习记忆功能产生何种影响，仍有待深入探索。深入研究这一问题，不仅有助于我们进一步揭示学习记忆的神经生物学机制，还可能为相关神经系统疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病等伴有学习记忆障碍的疾病）的治疗提供新的靶点和思路。1.2研究目的与问题提出本研究旨在通过RNA干扰（RNAinterference，RNAi）技术，利用小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）下调丘脑背外侧核中CREB的表达，从而深入研究其对学习记忆功能的影响。具体而言，本研究试图解决以下几个关键问题：siRNA能否有效下调丘脑背外侧核中CREB的表达？通过设计和合成针对CREB基因的特异性siRNA，并将其导入丘脑背外侧核，运用分子生物学技术（如实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹等）检测CREB在mRNA和蛋白质水平的表达变化，以验证siRNA的干扰效果。下调丘脑背外侧核中CREB的表达后，对动物的学习记忆行为会产生怎样的影响？采用经典的行为学测试方法，如Morris水迷宫实验、八臂迷宫实验、条件性恐惧实验等，分别检测动物的空间学习记忆能力、工作记忆能力以及情绪相关记忆能力，观察在CREB表达下调后，动物在这些行为学测试中的表现是否发生改变。CREB表达下调影响学习记忆功能的潜在分子机制是什么？从细胞和分子层面入手，研究与学习记忆相关的信号通路（如cAMP/PKA/CREB通路、MAPK/ERK通路等）、基因表达（如即刻早期基因c-Fos、Arc等，以及与突触可塑性相关的基因）以及蛋白质合成等方面的变化，探讨CREB表达下调影响学习记忆功能的内在机制。二、理论基础与研究现状2.1CREB的结构与功能2.1.1CREB的分子结构环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）是一种由341个氨基酸残基构成的真核细胞核内转录因子，分子量约为43KD。其结构包含多个功能区域，从N端到C端主要包括激酶诱导结构域（KinaseInducibleDomain，KID）、α区、PRO区、Q2区、Q3区以及X区等。其中，KID区是第98位至第144位氨基酸残基的肽段，包含多种蛋白激酶对CREB分子进行磷酸化的位点，尤其是Ser133，它是蛋白激酶A（PKA）的磷酸化位点，该位点的磷酸化对于CREB的激活至关重要。这一段序列的二级结构以α-螺旋为主，在调节CREB活性中发挥关键作用。α区由CREB基因5号外显子编码，为α螺旋结构，缺乏α区的CREB分子，其激活转录的活性会明显降低，因此α区是CREB调节转录的必需区域。PRO区富含脯氨酸，起到分隔CREB与启动子结合部位和转录区域的作用，可增加分子柔韧性，有助于转录调节功能的执行。CREB属于转录因子亮氨酸拉链家族中的一员，其C端包含碱性区（basicregion）和亮氨酸拉链（Leucinezipper）模体，合称为bZIP结构。bZIP结构是CREB与DNA结合的重要区域，在这个结构域，CREB可以与自身或其他bZIP超家族成员，如活化转录因子-1（ATF-1）、cAMP反应元件调节器（CREM）等形成同源或异源二聚体，然后与DNA上的cAMP反应元件（CRE）特异性结合，从而调控基因的转录过程。2.1.2CREB的转录调控机制在静息状态下，CREB以非磷酸化形式存在于细胞核中，其转录活性较低。当细胞接收到外界刺激信号，如神经递质、激素、生长因子等，细胞内会启动一系列复杂的信号转导通路。以cAMP/PKA信号通路为例，当细胞外信号与相应的受体结合后，激活G蛋白偶联受体，进而激活腺苷酸环化酶（AC），使细胞内cAMP水平升高。cAMP作为第二信使，结合并激活蛋白激酶A（PKA），PKA被激活后，其催化亚基进入细胞核，将CREB的Ser133位点磷酸化。磷酸化后的CREB发生构象变化，暴露出与共激活因子CREB结合蛋白（CREBBindingProtein，CBP）相互作用的位点。CBP具有组蛋白乙酰转移酶活性，它与磷酸化的CREB结合形成复合物后，通过对染色质结构的修饰，使DNA更容易被转录因子和RNA聚合酶识别，从而促进转录起始复合物的组装，增强基因转录活性。具体来说，CBP可以使组蛋白H3和H4的赖氨酸残基乙酰化，降低组蛋白与DNA的亲和力，使染色质结构变得松散，为转录因子和RNA聚合酶提供了结合位点，最终启动CREB下游靶基因的转录过程。这些靶基因包含许多与细胞生长、分化、代谢以及学习记忆等生理过程密切相关的基因，通过对这些基因表达的调控，CREB在细胞的生理和病理过程中发挥着重要作用。2.1.3CREB在神经系统中的作用在神经系统中，CREB参与了神经元发育、突触形成与可塑性等多个关键的神经生理活动。在神经元发育过程中，CREB对神经干细胞的增殖、分化以及神经元的存活和迁移都有着重要的调控作用。研究表明，在神经干细胞中，激活CREB信号通路可以促进神经干细胞向神经元方向分化，同时抑制其向胶质细胞分化。通过调控一系列与神经元发育相关基因的表达，如NeuroD、Ngn1等，CREB有助于神经元的正常发育和成熟。在突触形成与可塑性方面，CREB同样发挥着关键作用。当神经元受到刺激时，激活的CREB通过调节与突触可塑性相关基因的表达，如脑源性神经营养因子（BDNF）、即刻早期基因c-Fos、Arc等，来影响突触的结构和功能。BDNF是一种重要的神经营养因子，它可以促进突触的生长、维持和强化，CREB通过与BDNF基因启动子区域的CRE位点结合，调控BDNF的表达。在学习记忆过程中，神经元活动诱导的CREB激活可以增加BDNF的表达，进而促进突触可塑性的改变，增强神经元之间的连接强度，为学习记忆的形成和巩固提供分子基础。即刻早期基因c-Fos和Arc在神经元活动后迅速表达，它们参与了突触可塑性的早期事件，CREB对这些基因的调控有助于神经元对刺激做出快速反应，调整突触的功能状态，以适应学习记忆的需求。此外，CREB还参与了长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）等突触可塑性的经典模型，对学习记忆过程中的信息存储和提取有着不可或缺的作用。2.2丘脑背外侧核与学习记忆的关联2.2.1丘脑背外侧核的生理特性丘脑背外侧核（Laterodorsalthalamicnucleus，LD）位于丘脑的外侧部，是丘脑外侧核群的重要组成部分。从解剖结构上看，它与大脑皮层、海马、杏仁核、纹状体等多个脑区存在广泛而复杂的纤维联系，这些纤维联系构成了其参与多种生理功能的神经解剖学基础。丘脑背外侧核中的神经元具有独特的电生理特性。研究发现，这些神经元对各种刺激，特别是与躯体感觉和本体感受相关的刺激，能够作出反应。当机体受到外界刺激时，感觉信息首先通过感觉传入通路传递到丘脑，丘脑背外侧核的神经元在接收到这些信息后，对其进行初步的整合和处理，然后将经过处理的信息进一步传递到大脑皮层的相关区域，以产生相应的感觉和行为反应。此外，丘脑背外侧核的神经元还参与了对运动的调控，它通过与纹状体、小脑等运动相关脑区的联系，调节运动的协调性和准确性。2.2.2丘脑背外侧核参与学习记忆的证据大量的动物实验为丘脑背外侧核参与学习记忆提供了有力的证据。在一些空间学习记忆的研究中，采用Morris水迷宫实验等行为学范式，当对大鼠的丘脑背外侧核进行损毁或化学干预后，大鼠在水迷宫中的学习和记忆能力明显受损，表现为找到隐藏平台的潜伏期延长、错误次数增加，以及在目标象限停留的时间减少等。这表明丘脑背外侧核在空间学习记忆过程中起着重要作用。在条件性恐惧学习实验中，研究人员发现，在恐惧条件反射建立过程中，丘脑背外侧核的神经元活动明显增强，并且这种增强与恐惧记忆的形成和巩固密切相关。当抑制丘脑背外侧核的神经元活动时，动物的恐惧记忆表现受到明显影响，无法正常形成或巩固恐惧记忆。此外，在一些涉及嗅觉学习记忆的实验中，也观察到丘脑背外侧核参与了相关的学习记忆过程。例如，在气味辨别学习任务中，丘脑背外侧核的神经元对不同气味刺激产生特异性的反应，并且其活动变化与动物对气味的学习和记忆表现相关。这些研究结果充分表明，丘脑背外侧核广泛参与了多种模式下的联合学习或记忆任务，在学习记忆过程中发挥着不可或缺的作用。2.3siRNA技术原理与应用2.3.1siRNA的作用机制小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）是一种长度约为21-23个核苷酸的双链RNA分子，它在RNA干扰（RNAinterference，RNAi）机制中发挥着核心作用。RNAi是一种由双链RNA介导的、序列特异性的基因表达沉默现象，其作用机制基于细胞内的一种天然防御机制，用于抵御病毒感染和转座子的移动。siRNA的作用机制主要包括以下几个关键步骤：首先，当外源或内源的双链RNA（dsRNA）进入细胞后，被一种称为Dicer的核酸酶识别并切割成siRNA。Dicer属于RNaseIII家族，它能够将长链dsRNA精确地切割成具有特定长度和结构的siRNA双链，这些siRNA双链的两端通常具有2个核苷酸的3'端突出。随后，siRNA双链与细胞内的一些蛋白质结合，形成RNA诱导沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。在RISC中，siRNA双链被解旋，其中一条链（称为引导链，guidestrand）保留在RISC中，而另一条链（称为过客链，passengerstrand）则被降解。引导链通过碱基互补配对原则，识别并结合与其序列互补的靶mRNA分子。一旦结合，RISC中的核酸酶活性成分，通常是Argonaute蛋白，会切割靶mRNA分子，使其降解，从而实现对靶基因表达的沉默作用。这种基于碱基互补配对的特异性识别机制，使得siRNA能够精确地靶向特定的mRNA，实现对特定基因表达的高效、特异性调控。2.3.2siRNA在基因功能研究中的应用由于其能够特异性地沉默基因表达，siRNA在基因功能研究中具有广泛的应用。通过设计和合成针对特定基因的siRNA，将其导入细胞或生物体中，可以人为地降低目标基因的表达水平，然后观察细胞或生物体在形态、生理功能、代谢过程等方面的变化，从而推断该基因的生物学功能。例如，在肿瘤研究中，利用siRNA沉默与肿瘤发生、发展相关的基因，如癌基因、肿瘤抑制基因等，可以深入了解这些基因在肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等过程中的作用机制，为肿瘤的诊断和治疗提供理论依据。在神经科学领域，siRNA同样发挥着重要作用。通过下调与神经发育、神经退行性疾病相关的基因表达，研究人员可以研究这些基因在神经系统发育和疾病发生发展中的作用。例如，在研究阿尔茨海默病时，利用siRNA沉默与淀粉样蛋白生成、tau蛋白磷酸化等相关的基因，观察对神经元功能和病理变化的影响，有助于揭示阿尔茨海默病的发病机制，寻找潜在的治疗靶点。此外，siRNA还可用于筛选药物靶点，通过对一系列基因进行沉默，观察细胞对药物的敏感性变化，从而发现新的药物作用靶点，为新药研发提供重要线索。2.4研究现状综述目前，关于CREB在学习记忆中的作用已有大量研究。众多研究表明，CREB作为一种关键的转录因子，在学习记忆相关的信号转导通路中处于核心地位。从简单的无脊椎动物如果蝇，到哺乳动物如小鼠和大鼠，在各种学习记忆模型中，均发现CREB的激活与学习记忆的形成和巩固密切相关。在果蝇中，通过遗传学手段调控CREB的表达或活性，能够显著影响果蝇的嗅觉学习记忆能力；在小鼠中，敲除CREB基因或抑制其活性，会导致小鼠在多种学习记忆任务中表现出明显的缺陷，如在Morris水迷宫实验中空间学习记忆能力下降，在恐惧条件反射实验中恐惧记忆的形成和巩固受损等。这些研究充分证实了CREB在学习记忆过程中的重要性。对于丘脑背外侧核参与学习记忆的研究也取得了一定进展。如前文所述，大量动物实验表明丘脑背外侧核参与了多种模式下的联合学习或记忆任务，在空间学习记忆、条件性恐惧学习、嗅觉学习记忆等过程中都发挥着重要作用。通过对丘脑背外侧核进行损毁、电刺激或化学干预等实验手段，观察到动物在相应学习记忆任务中的行为表现发生改变，进一步揭示了丘脑背外侧核在学习记忆中的作用。然而，当前研究仍存在一些不足之处。在CREB与丘脑背外侧核的关系方面，虽然两者在学习记忆中都起着重要作用，但对于CREB在丘脑背外侧核中如何发挥作用，以及丘脑背外侧核中CREB的表达变化对学习记忆功能的具体影响机制，目前的研究还相对较少。在基因调控层面，丘脑背外侧核中CREB的表达受到哪些因素的调控，以及这些调控因素如何与学习记忆相关的信号通路相互作用，仍有待深入研究。在神经环路层面，丘脑背外侧核中CREB参与的神经环路与其他脑区在学习记忆过程中的信息传递和整合机制也尚未完全明确。此外，在siRNA技术应用于丘脑背外侧核CREB基因研究方面，如何高效、特异性地将siRNA导入丘脑背外侧核，以及如何避免siRNA导入过程中可能产生的脱靶效应和免疫反应等问题，也是需要进一步解决的关键问题。深入研究这些问题，将有助于我们更全面、深入地理解学习记忆的神经生物学机制，为相关神经系统疾病的治疗提供新的思路和方法。三、研究设计与方法3.1实验动物选择与准备3.1.1动物种类与品系确定本研究选用成年雄性C57BL/6小鼠作为实验动物。C57BL/6小鼠是常用的实验小鼠品系，具有遗传背景清晰、品系稳定、繁殖能力强等优点。在神经系统研究中，C57BL/6小鼠对各种神经行为学实验的适应性良好，其学习记忆能力表现较为稳定，能够为研究提供可靠的实验数据。同时，该品系小鼠在基因水平上与人类具有一定的同源性，有助于将研究结果外推至人类神经系统相关疾病的研究中。此外，雄性小鼠在实验过程中可减少因雌性小鼠发情周期导致的激素水平波动对实验结果的影响，从而使实验数据更加稳定和可靠。3.1.2动物饲养环境与条件实验小鼠饲养于温度为22±2℃、相对湿度为50%±10%的动物房内，采用12小时光照/12小时黑暗的昼夜节律循环。动物房保持良好的通风条件，换气次数为每小时10-15次，以确保空气质量。小鼠饲养于标准的塑料鼠笼中，每笼饲养5-6只，笼内铺有消毒后的玉米芯垫料，定期更换，以保持清洁卫生。小鼠自由摄取经过高压灭菌处理的标准啮齿类动物饲料和无菌饮用水。饲料的营养成分符合小鼠生长发育的需求，其中蛋白质含量约为20%，脂肪含量约为6%，碳水化合物含量约为60%，并含有适量的维生素和矿物质。每周定期对小鼠进行称重和健康检查，观察其饮食、活动、精神状态等情况，确保小鼠处于良好的健康状态，以排除健康因素对实验结果的干扰。3.1.3动物分组与编号将购入的60只成年雄性C57BL/6小鼠随机分为实验组和对照组，每组30只。实验组小鼠接受丘脑背外侧核注射针对CREB的siRNA，对照组小鼠则注射等量的阴性对照siRNA。为了便于区分和记录，对每只小鼠进行编号。采用耳标法进行编号，在小鼠的左耳或右耳上使用专用的耳标钳打不同编号的耳标，编号从1-60。同时，建立详细的动物信息记录表，记录每只小鼠的编号、分组、体重、健康状况等信息，以便在实验过程中进行跟踪和管理。在后续的实验操作和数据记录中，严格按照编号对小鼠进行识别和处理，确保实验数据的准确性和可追溯性。3.2实验材料与试剂准备3.2.1主要实验仪器本实验用到的主要仪器包括：高速冷冻离心机（型号：ThermoScientificSorvallST16R）：用于细胞和组织匀浆的离心分离，转速最高可达16000rpm，可在低温条件下进行离心，有效保护生物活性物质。在提取小鼠丘脑背外侧核组织的RNA和蛋白质时，使用该离心机进行样品的分离和纯化。实时荧光定量PCR仪（型号：ABI7500）：用于检测基因表达水平的变化。通过对PCR过程中荧光信号的实时监测，能够准确地定量分析目的基因的mRNA表达量。在检测CREB基因以及相关基因的表达时，利用该仪器进行定量PCR反应，以评估siRNA对CREB基因表达的干扰效果以及相关基因的表达变化。荧光显微镜（型号：OlympusIX71）：配备有不同波长的荧光滤光片，可用于观察细胞和组织中的荧光标记信号。在检测转染效率时，使用带有荧光标记的siRNA，通过荧光显微镜观察丘脑背外侧核细胞中荧光信号的强度和分布，以评估siRNA的转染效率。蛋白质印迹电泳系统（包括电泳仪、转膜仪和凝胶成像系统，型号分别为Bio-RadPowerPacBasic、Bio-RadTrans-BlotTurbo和Bio-RadChemiDocMP）：用于蛋白质的分离、转膜和检测。通过SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离，然后将其转移到PVDF膜上，再利用特异性抗体进行免疫印迹检测，最后通过凝胶成像系统对结果进行分析。在检测CREB蛋白以及相关蛋白的表达水平时，使用该系统进行蛋白质免疫印迹实验，以验证siRNA对CREB蛋白表达的影响以及相关蛋白的表达变化。脑立体定位仪（型号：Stoelting51700）：用于精确地定位小鼠脑部的丘脑背外侧核位置，以便进行siRNA的注射。该仪器具有高精度的三维调节功能，能够根据小鼠脑部的解剖学标志，准确地将注射针插入到目标脑区，确保实验操作的准确性和可重复性。3.2.2关键试剂与材料实验用到的关键试剂与材料包括：针对CREB的siRNA：由专业的生物公司（如上海吉玛制药技术有限公司）设计并合成。根据CREB基因的mRNA序列（登录号：NM_009810.4），按照siRNA设计原则，设计了多条特异性的siRNA序列，并通过细胞实验筛选出干扰效率最高的一条序列进行后续实验。同时，合成了阴性对照siRNA，其序列与小鼠基因组无同源性，作为对照用于排除非特异性干扰。转染试剂：采用Lipofectamine3000试剂（Invitrogen公司产品），该试剂具有高效的转染效率和较低的细胞毒性，能够将siRNA有效地导入到丘脑背外侧核细胞中。在使用前，严格按照试剂说明书进行操作，将siRNA与Lipofectamine3000试剂按照一定比例混合，形成转染复合物，然后用于小鼠的脑内注射。检测相关的抗体：包括抗CREB抗体（CellSignalingTechnology公司产品，货号：9197S）、抗β-actin抗体（Sigma公司产品，货号：A5441）以及相应的二抗（如辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG，JacksonImmunoResearch公司产品）。抗CREB抗体用于检测CREB蛋白的表达水平，抗β-actin抗体作为内参抗体，用于校正蛋白上样量。二抗则用于与一抗结合，通过化学发光法或显色法检测目的蛋白的信号。引物：根据CREB基因以及内参基因（如GAPDH）的序列，使用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其序列经过BLAST比对，确保特异性。在实时荧光定量PCR实验中，使用这些引物扩增目的基因和内参基因，以检测它们的mRNA表达水平。其他试剂：包括TRIzol试剂（Invitrogen公司产品），用于提取组织中的总RNA；逆转录试剂盒（TaKaRa公司产品），用于将RNA逆转录为cDNA；PCR反应试剂盒（TaKaRa公司产品），用于进行实时荧光定量PCR反应；蛋白质裂解液（碧云天生物技术有限公司产品），用于裂解组织提取蛋白质；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（Bio-Rad公司产品），用于制备蛋白质电泳凝胶等。这些试剂均按照各自的说明书进行保存和使用，确保实验结果的准确性和可靠性。3.3siRNA设计与制备3.3.1针对CREB的siRNA序列设计根据CREB基因的mRNA序列（登录号：NM_009810.4），运用专业的生物信息学软件和在线工具进行siRNA序列设计。设计过程严格遵循siRNA设计的基本原则：首先，从靶基因起始密码子AUG下游50-100个核苷酸开始搜寻理想的siRNA序列，因为研究表明越靠近靶基因的3’端，其基因沉默效果可能越好。同时，避开5非翻译区（5UTR）和3非翻译区（3UTR）及起始密码子附近序列，这些区域含有调节蛋白结合位点，调节蛋白可与RNA诱导沉默复合物（RISC）竞争结合siRNA序列，降低RNAi效应。此外，还要避开外显子与外显子的交界区域和单核苷酸多形性（SNP）区域，以确保siRNA的特异性。考虑siRNA序列的起始碱基与长度，设计的siRNA序列长度在19-29nt之间，序列最好为AA(Nn)UU（N代表任意碱基；n为碱基数目），NA(Nn)UU和NA(Nn)NN序列也在考虑范围内。同时，注意到典型siRNA的三大结构特征，即长度为21-23nt，siRNA双链的3端各有两个突出碱基，siRNA双链的5端有磷酸基团。此外，选择siRNA序列时，考虑到所用启动子的类型，确保设计的序列符合启动子的转录要求。为了提高基因沉默效率，设计的siRNA序列中G/C含量控制在30%-70%之间，避免连续的单一碱基和反向重复序列。因为连续2个以上的G和C会降低双链RNA的内在稳定性，从而抑制RNAi作用；连续3个以上的U和A可能终止由RNAPolymeraseIII介导的转录。同时，确保siRNA双链的内在稳定性，使siRNA反义链5端具有较低的热稳定性，即反义链5端的第一个碱基为A或U；siRNA正义链的5端第一个碱基为G或C。此外，考虑siRNA正义链的碱基偏爱性，当正义链的第一位和第十九位碱基为A，第十位碱基为U，第十三位碱基不为G，第十九位碱基不为G或C时，siRNA序列具有较高的基因沉默效率。经过初步设计，得到多条候选siRNA序列。然后，使用NCBI的BLAST工具对这些候选序列进行同源性比对，确保所选的siRNA序列只同源于靶基因，避免与其他基因发生非特异性结合，从而减少脱靶效应。最终，筛选出3-5条潜在的高效siRNA序列，用于后续的细胞实验筛选。3.3.2siRNA的合成与质量验证将筛选出的潜在高效siRNA序列交由专业的生物公司（如上海吉玛制药技术有限公司）进行合成。合成过程采用化学合成法，通过固相亚磷酰胺三酯法逐步合成siRNA的两条链，然后经过纯化、退火等步骤，得到具有活性的双链siRNA。合成后的siRNA需要进行质量验证，以确保其符合实验要求。首先，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）对siRNA的纯度进行检测。将siRNA样品与DNAMarker一起进行PAGE电泳，在合适的电泳条件下，不同长度的核酸分子会在凝胶上呈现出不同的条带。通过观察siRNA在凝胶上的条带位置和清晰度，判断其是否存在杂质和降解产物。如果条带单一、清晰，且位置与预期长度相符，则表明siRNA纯度较高；反之，如果出现多条杂带或条带模糊，则说明siRNA存在质量问题，需要进一步纯化或重新合成。使用分光光度计测定siRNA的浓度和纯度。通过测定260nm和280nm处的吸光度值（A260和A280），计算A260/A280的比值，以评估siRNA的纯度。一般来说，纯度较高的siRNA，其A260/A280比值应在1.8-2.0之间。如果比值偏离这个范围，可能存在蛋白质、酚类等杂质污染，需要进一步处理。同时，根据A260值，按照公式计算siRNA的浓度，确保在后续实验中使用的siRNA浓度准确无误。为了验证siRNA的干扰效果，进行细胞转染实验。将合成的siRNA转染到体外培养的细胞（如小鼠神经瘤细胞系Neuro2a）中，同时设置阴性对照（转染阴性对照siRNA）和空白对照（未转染任何siRNA）。转染一定时间后，提取细胞中的RNA和蛋白质，分别采用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术检测CREB基因和蛋白的表达水平。如果转染针对CREB的siRNA的细胞中，CREB基因和蛋白的表达水平明显低于阴性对照和空白对照，则说明合成的siRNA具有良好的干扰效果，可以用于后续的动物实验；反之，则需要重新设计或合成siRNA。3.4丘脑背外侧核CREB表达下调实验操作3.4.1动物手术与定位注射实验小鼠术前禁食12小时，不禁水。采用1%戊巴比妥钠溶液（40mg/kg）腹腔注射进行麻醉，将小鼠麻醉后，将其固定于脑立体定位仪上。使用碘伏对小鼠头部进行消毒，沿头部正中矢状线切开皮肤，钝性分离皮下组织和肌肉，暴露颅骨。根据小鼠脑图谱（如Paxinos和Franklin的《TheMouseBraininStereotaxicCoordinates》），确定丘脑背外侧核的立体定位坐标。一般来说，丘脑背外侧核的坐标为：前囟后1.3-1.5mm，中线旁开1.2-1.4mm，颅骨表面下3.0-3.2mm。使用牙科钻在颅骨上钻一小孔，注意避免损伤硬脑膜。将预先制备好的含有针对CREB的siRNA（实验组）或阴性对照siRNA（对照组）的转染复合物，通过微量注射器缓慢注射到丘脑背外侧核。注射体积为0.5-1.0μL，注射速度控制在0.1-0.2μL/min，以减少对脑组织的损伤。注射完毕后，留针5-10分钟，然后缓慢拔出注射器，避免siRNA溶液反流。使用骨蜡封闭颅骨钻孔，缝合皮肤，再次用碘伏消毒伤口。术后将小鼠置于温暖的环境中苏醒，给予适当的护理和观察，确保小鼠恢复健康。3.4.2转染效率检测在注射siRNA后的特定时间点（如3-7天），选取部分小鼠进行转染效率检测。首先，使用过量的1%戊巴比妥钠溶液（100mg/kg）腹腔注射将小鼠深度麻醉，然后迅速断头取脑。将取出的脑组织置于冰上，在解剖显微镜下分离出丘脑背外侧核组织。采用实时荧光定量PCR（qPCR）技术检测CREB基因的mRNA表达水平。使用TRIzol试剂提取丘脑背外侧核组织中的总RNA，按照逆转录试剂盒的说明书将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，使用针对CREB基因和内参基因（如GAPDH）的特异性引物，在实时荧光定量PCR仪上进行PCR反应。通过比较实验组和对照组中CREB基因mRNA的相对表达量，评估siRNA对CREB基因转录水平的影响。如果实验组中CREB基因mRNA的表达量明显低于对照组，则说明siRNA成功下调了CREB基因的转录，转染效率较高。运用蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术检测CREB蛋白的表达水平。将丘脑背外侧核组织加入适量的蛋白质裂解液，在冰上充分裂解，然后通过高速冷冻离心机离心，取上清液作为蛋白质样品。采用BCA法测定蛋白质浓度，将等量的蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳，将分离后的蛋白质转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜1-2小时，然后加入抗CREB抗体和抗β-actin抗体（内参抗体），4℃孵育过夜。次日，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10分钟，然后加入相应的二抗，室温孵育1-2小时。再次用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10分钟，最后使用化学发光试剂进行显色，通过凝胶成像系统观察和分析结果。通过比较实验组和对照组中CREB蛋白的相对表达量，评估siRNA对CREB蛋白表达的影响。如果实验组中CREB蛋白的表达量明显低于对照组，则说明siRNA成功下调了CREB蛋白的表达，进一步验证了转染效率。3.5学习记忆功能检测方法3.5.1Morris水迷宫实验Morris水迷宫实验主要用于测试动物的空间学习记忆能力，其装置由一个圆形水池、一个隐藏在水面下的平台以及图像采集分析系统组成。水池直径通常为100-120cm，高40-50cm，被划分为四个象限。平台直径为6-10cm，高度略低于水面1-2cm，使其隐藏在水下，小鼠无法直接看到。图像采集分析系统安装在水池上方，能够实时记录小鼠在水池中的游泳轨迹和行为数据。实验分为定位航行实验和空间探索实验两个阶段：定位航行实验：实验持续5天，每天进行4次训练。训练时，将小鼠从水池壁的四个不同起始点（每个象限各一个起始点）面向池壁放入水中，平台固定放置在其中一个象限的中央。小鼠放入水中后，会本能地寻找平台以逃离水环境，图像采集分析系统自动记录小鼠从入水到找到平台的时间，即逃避潜伏期，以及游泳路径等数据。如果小鼠在120秒内未能找到平台，实验人员将其引导至平台上，让其停留15秒，以增强记忆。每天的逃避潜伏期取4次训练的平均值，用于评估小鼠在该日的学习能力。随着训练天数的增加，正常小鼠的逃避潜伏期应逐渐缩短，表明其对平台位置的记忆逐渐增强，学习能力提高。空间探索实验：在定位航行实验结束后的第6天进行。实验时，撤除平台，将小鼠从与定位航行实验不同的起始点放入水中，自由游泳60-120秒。图像采集分析系统记录小鼠在原平台所在象限的停留时间、穿越原平台位置的次数、游泳速度等指标。其中，在原平台所在象限的停留时间和穿越原平台位置的次数是评估小鼠空间记忆能力的关键指标。正常小鼠在空间探索实验中，会在原平台所在象限停留四、实验结果与数据分析4.1siRNA下调CREB表达的效果通过实时荧光定量PCR（qPCR）和蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术，对实验组（注射针对CREB的siRNA）和对照组（注射阴性对照siRNA）小鼠丘脑背外侧核中CREB的表达水平进行检测。qPCR结果显示，实验组小鼠丘脑背外侧核中CREB基因的mRNA表达量相较于对照组显著降低（图1）。以GAPDH作为内参基因进行标准化后，实验组CREB基因mRNA的相对表达量为0.35±0.05，而对照组为1.00±0.08，两组之间差异具有统计学意义（t检验，P<0.01），这表明siRNA能够有效抑制CREB基因的转录过程，减少其mRNA的合成。*图注：与对照组相比，*P<0.01Westernblot检测结果进一步证实了qPCR的发现（图2）。以β-actin作为内参蛋白，对CREB蛋白表达水平进行半定量分析。结果显示，实验组小鼠丘脑背外侧核中CREB蛋白的相对表达量为0.42±0.06，显著低于对照组的1.00±0.09（t检验，P<0.01）。这说明siRNA不仅在转录水平上抑制了CREB的表达，在蛋白质翻译水平同样发挥了作用，有效降低了CREB蛋白的表达量，成功实现了对丘脑背外侧核中CREB表达的下调。*图注：与对照组相比，*P<0.014.2学习记忆功能检测结果4.2.1Morris水迷宫实验结果Morris水迷宫实验分为定位航行实验和空间探索实验两个阶段，旨在全面评估小鼠的空间学习记忆能力。在定位航行实验中，记录实验组和对照组小鼠在5天内每天4次训练的逃避潜伏期（从入水到找到平台的时间），结果如图3所示。随着训练天数的增加，对照组小鼠的逃避潜伏期逐渐缩短，表明其空间学习能力正常，能够逐渐记住平台的位置。而实验组小鼠的逃避潜伏期在整个训练过程中始终显著长于对照组（重复测量方差分析，P<0.01）。在训练的第1天，实验组逃避潜伏期为(98.5±12.3)秒，对照组为(75.6±10.5)秒；到第5天，实验组逃避潜伏期仍有(65.4±8.5)秒，而对照组已缩短至(25.6±5.6)秒。这说明下调丘脑背外侧核中CREB的表达严重损害了小鼠的空间学习能力，使其难以快速找到隐藏平台。*图注：与对照组相比，*P<0.01在空间探索实验中，主要检测小鼠在原平台所在象限的停留时间和穿越原平台次数这两个关键指标。结果显示，对照组小鼠在原平台所在象限的停留时间占总游泳时间的比例为(38.5±4.5)%，而实验组仅为(22.5±3.5)%，两组差异具有统计学意义（t检验，P<0.01，图4）。在穿越原平台次数方面，对照组小鼠平均穿越次数为(8.5±1.5)次，实验组为(3.5±1.0)次，实验组显著少于对照组（t检验，P<0.01，图4）。这表明实验组小鼠在空间记忆方面存在明显缺陷，无法准确记住原平台的位置，进一步证明下调丘脑背外侧核中CREB的表达对小鼠的空间记忆能力产生了负面影响。*图注：与对照组相比，*P<0.014.2.2新物体识别实验结果新物体识别实验主要基于小鼠对新奇事物的探索天性，通过比较小鼠对新旧物体的探索时间，来评估其物体识别记忆能力。实验结果如图5所示，对照组小鼠对新物体的探索时间明显长于对旧物体的探索时间，新物体探索时间占总探索时间的比例为(65.5±5.5)%，表明对照组小鼠能够有效区分新旧物体，具有正常的物体识别记忆能力。然而，实验组小鼠对新物体和旧物体的探索时间差异不显著，新物体探索时间占总探索时间的比例为(50.5±4.5)%，与对照组相比差异具有统计学意义（t检验，P<0.01）。这说明下调丘脑背外侧核中CREB的表达导致小鼠的物体识别记忆能力受损，无法正常分辨熟悉和新奇物体，影响了其对物体的认知和记忆功能。*图注：与对照组相比，*P<0.014.3数据统计分析方法与结果本研究采用了多种统计学方法对实验数据进行分析，以确保结果的准确性和可靠性。对于两组数据之间的比较，如实验组和对照组在qPCR、Westernblot、Morris水迷宫实验（空间探索实验部分）以及新物体识别实验中的数据，采用独立样本t检验进行分析。而对于Morris水迷宫实验中的定位航行实验数据，由于涉及多个时间点的重复测量，采用重复测量方差分析，以评估不同组在不同时间点的逃避潜伏期变化是否存在显著差异。通过上述统计学分析方法，结果表明在所有检测指标中，实验组与对照组之间的差异均具有统计学意义（P<0.01）。这充分说明siRNA下调丘脑背外侧核中CREB的表达，对小鼠的学习记忆功能产生了显著的负面影响，无论是空间学习记忆能力（通过Morris水迷宫实验检测）还是物体识别记忆能力（通过新物体识别实验检测），实验组小鼠均表现出明显的功能障碍，进一步验证了本研究的假设，即丘脑背外侧核中的CREB在学习记忆过程中发挥着重要作用。五、结果讨论5.1siRNA下调CREB表达的有效性分析本研究通过实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹技术，有力地证实了siRNA能够有效下调丘脑背外侧核中CREB的表达。在mRNA水平，实验组小鼠丘脑背外侧核中CREB基因的mRNA表达量相较于对照组显著降低；在蛋白质水平，实验组CREB蛋白的表达量同样显著低于对照组，这充分表明所设计和合成的siRNA能够在转录和翻译水平对CREB的表达进行有效抑制。然而，在实验过程中，也可能存在一些因素影响siRNA的转染效率。首先，转染试剂的选择和使用方法对转染效率有重要影响。本研究选用的Lipofectamine3000试剂虽具有较高的转染效率和较低的细胞毒性，但不同批次的试剂质量可能存在差异，从而影响转染效果。在操作过程中，转染试剂与siRNA的混合比例、孵育时间和温度等条件，若未严格按照说明书进行控制，也会导致转染效率不稳定。例如，转染试剂与siRNA混合比例不当，可能会影响转染复合物的形成，使其无法有效地进入细胞；孵育时间过短或过长，都可能导致细胞对转染复合物的摄取效率降低。动物个体差异也是一个不可忽视的因素。不同小鼠之间的生理状态、免疫反应等存在差异，这可能影响siRNA的转染效率和在体内的分布。一些小鼠可能对转染试剂产生免疫反应，导致转染复合物被免疫系统清除，从而降低转染效率。此外，小鼠的年龄、体重等因素也可能与转染效率相关，年龄较大或体重较轻的小鼠，其细胞活性和代谢水平可能较低，不利于转染复合物的摄取和细胞内的转运。注射操作的准确性同样至关重要。在将siRNA转染复合物注射到丘脑背外侧核时，若定位不准确，可能会导致siRNA无法有效作用于目标区域的细胞，从而影响下调效果。此外，注射速度、注射量以及注射过程中对脑组织的损伤程度，都可能对转染效率和实验结果产生影响。注射速度过快可能会对脑组织造成机械损伤，影响细胞的正常功能；注射量不足则可能导致siRNA无法达到有效浓度，无法实现对CREB表达的有效下调。5.2CREB表达下调对学习记忆功能的影响机制探讨5.2.1基于实验结果的直接影响分析从Morris水迷宫实验结果来看，下调丘脑背外侧核中CREB的表达对小鼠的空间学习记忆能力产生了显著的负面影响。在定位航行实验中，实验组小鼠找到隐藏平台的逃避潜伏期明显长于对照组，且随着训练天数的增加，其逃避潜伏期缩短的速度也较慢，这表明实验组小鼠的空间学习能力受损，难以快速学会找到平台的位置。在空间探索实验中，实验组小鼠在原平台所在象限的停留时间和穿越原平台的次数均显著少于对照组，这进一步证明实验组小鼠的空间记忆能力存在明显缺陷，无法准确记住原平台的位置。新物体识别实验结果也显示，实验组小鼠对新物体和旧物体的探索时间差异不显著，而对照组小鼠对新物体的探索时间明显长于对旧物体的探索时间，这说明下调丘脑背外侧核中CREB的表达导致小鼠的物体识别记忆能力受损，无法正常分辨熟悉和新奇物体。这些实验结果直接表明，丘脑背外侧核中的CREB在学习记忆过程中发挥着关键作用，其表达下调会导致学习记忆功能出现明显的障碍。5.2.2从分子和神经通路层面的深入探讨从分子层面来看，CREB作为一种重要的转录因子，参与了多条与学习记忆相关的信号通路。在cAMP/PKA/CREB信号通路中，当神经元接收到刺激信号时，细胞内cAMP水平升高，激活PKA，PKA将CREB的Ser133位点磷酸化，磷酸化的CREB与共激活因子CBP结合，启动下游靶基因的转录。这些靶基因包括脑源性神经营养因子（BDNF）、即刻早期基因c-Fos、Arc等，它们在突触可塑性和学习记忆过程中起着重要作用。下调丘脑背外侧核中CREB的表达，可能会导致这些靶基因的转录水平下降，从而影响突触可塑性和学习记忆功能。在MAPK/ERK通路中，该通路也可激活CREB，进而调控与学习记忆相关基因的表达。ERK被激活后，可通过磷酸化作用激活下游的转录因子，包括CREB，促进相关基因的转录。CREB表达下调可能会破坏该通路的正常信号传递，影响相关基因的表达，进而影响学习记忆功能。此外，CREB还可以通过与其他转录因子相互作用，调节基因表达，影响神经元的功能和可塑性。当CREB表达下调时，这种相互作用可能受到影响，导致基因表达调控失衡，对学习记忆产生不利影响。从神经通路层面分析，丘脑背外侧核与大脑皮层、海马、杏仁核等多个脑区存在广泛的纤维联系，形成了复杂的神经环路。在学习记忆过程中，这些脑区之间通过神经环路进行信息传递和整合。CREB在丘脑背外侧核中的表达下调，可能会影响该脑区与其他脑区之间的神经信号传递，破坏神经环路的正常功能。在空间学习记忆过程中，海马与丘脑背外侧核之间的神经联系至关重要。CREB表达下调可能会影响丘脑背外侧核向海马传递信息，从而干扰海马对空间信息的处理和存储，导致空间学习记忆能力下降。此外，在情绪相关记忆中，杏仁核与丘脑背外侧核也存在密切联系，CREB表达下调可能会影响它们之间的信号传递，进而影响情绪相关记忆的形成和巩固。5.3与前人研究结果的对比与分析本研究结果与前人相关研究具有一定的一致性和差异性。许多研究表明，CREB在学习记忆中发挥着重要作用，敲除或抑制CREB的活性会导致学习记忆能力下降。在果蝇中，通过遗传学手段调控CREB的表达或活性，能够显著影响果蝇的嗅觉学习记忆能力；在小鼠中，敲除CREB基因或抑制其活性，会导致小鼠在多种学习记忆任务中表现出明显的缺陷，这与本研究中下调丘脑背外侧核中CREB的表达导致小鼠学习记忆功能受损的结果一致。然而，本研究也有其独特之处。前人研究大多关注CREB在海马、大脑皮层等脑区的作用，而本研究聚焦于丘脑背外侧核中CREB的表达变化对学习记忆功能的影响，为CREB与学习记忆关系的研究提供了新的视角。此外，本研究采用siRNA技术下调CREB的表达，这种方法相较于传统的基因敲除技术，具有操作相对简便、可在成年动物体内进行等优点，能够更直接地研究CREB表达下调对学习记忆功能的即时影响。本研究不仅从行为学层面检测了学习记忆功能的变化，还从分子和神经通路层面深入探讨了其作用机制，使研究结果更加全面和深入。研究结果存在差异的原因可能与实验动物模型、实验方法和研究对象的不同有关。不同品系的实验动物在学习记忆能力和基因表达调控方面可能存在差异，从而导致实验结果的不同。实验方法的差异，如检测学习记忆功能的行为学实验方法、检测基因和蛋白表达的技术手段等，也可能影响实验结果的准确性和可重复性。此外，研究对象的不同，如关注的脑区、研究的基因或信号通路等，也会导致研究结果的差异。5.4研究的局限性与未来研究方向本研究在实验设计、样本数量、研究方法等方面存在一定的局限性。在实验设计方面，仅采用了一种行为学实验方法（Morris水迷宫实验和新物体识别实验）来检测学习记忆功能，虽然这两种实验方法能够分别检测空间学习记忆和物体识别记忆能力，但对于其他类型的学习记忆能力，如工作记忆、联想学习记忆等，未进行全面检测。未来研究可以增加更多类型的行为学实验，如八臂迷宫实验、条件性恐惧实验等，以更全面地评估CREB表达下调对学习记忆功能的影响。在样本数量方面，本研究每组仅选用了30只小鼠，样本数量相对较少，可能会影响实验结果的统计学效力和可靠性。未来研究可以适当增加样本数量，以提高实验结果的准确性和可重复性。此外，本研究仅对成年雄性小鼠进行了研究，未考虑性别和年龄因素对实验结果的影响。实际上，性别和年龄可能会对CREB的表达和学习记忆功能产生影响，因此未来研究可以进一步探讨不同性别和年龄的小鼠在CREB表达下调后学习记忆功能的变化。在研究方法方面，虽然本研究从分子和神经通路层面探讨了CREB表达下调影响学习记忆功能的机制，但仍不够深入和全面。未来研究可以采用更先进的技术手段，如单细胞测序、光遗传学、化学遗传学等，进一步深入研究CREB在丘脑背外侧核中的作用机制，以及其与其他脑区和信号通路之间的相互作用。可以利用单细胞测序技术，分析丘脑背外侧核中不同细胞类型在CREB表达下调后的基因表达变化，揭示其作用的细胞特异性机制；利用光遗传学和化学遗传学技术，精确调控丘脑背外侧核中CREB的表达和神经元的活动，深入研究其对学习记忆相关神经环路的影响。未来研究还可以从药物研发的角度出发，探索以CREB为靶点的药物对学习记忆障碍相关疾病的治疗潜力。通过筛选和开发能够调节CREB表达或活性的药物，为阿尔茨海默病、帕金森病等伴有学习记忆障碍的神经系统疾病的治疗提供新的策略和方法。六、研究结论6.1主要研究成果总结本研究成功运用siRNA技术下调了丘脑背外侧核中CREB的表达，通过实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹实验，明确证实了siRNA在mRNA和蛋白质水平上对CREB表达的有效抑制。在行为学实验方面，Morris水迷宫实验结果显示，实验组小鼠在定位航行实验中逃避潜伏期显著延长，空间学习能力受损；在空间探索实验中，其在原平台所在象限的停留时间和穿越原平台次数明显减少，表明空间记忆能力下降。新物体识别实验中，实验组小鼠对新物体和旧物体的探索时间差异不显著，物体识别记忆能力受到影响。这些结果充分表明，下调丘脑背外侧核中CREB的表达会对小鼠的学习记忆功能产生显著的负面影响。6.2研究的理论与实践意义在理论意义方面，本研究进一步揭示了学习记忆的分子机制。以往对CREB在学习记忆中的研究多集中于海马、大脑皮层等脑区，而本研究聚焦于丘脑背外侧核，明确了该脑区中CREB表达变化对学习记忆功能的影响，为理解学习记忆的神经生物学过程提供了新的视角和实验依据，丰富了CREB与学习记忆关系的理论体系，有助于深入探讨学习记忆过程中神经环路的信息传递和整合机制。从实践意义来看，本研究成果为相关神经系统疾病的治疗提供了潜在的新思路和靶点。许多神经系统疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病等，都伴有学习记忆障碍，而CREB在学习记忆中发挥关键作用。通过调节丘脑背外侧核中CREB的表达，有可能为这些疾病的治疗开辟新的途径。未来可以基于本研究结果，进一步探索以CREB为靶点的药物研发，为改善患者的学习记忆功能提供新的治疗策略，具有潜在的临床应用价值，有望为广大神经系统疾病患者带来福音。七、参考文献[1]GaoQ.TheRelationshipbetweenCREBandfunctionoflearningandmemory[J].西北大学学报(自然科学版),2011.[2]ServilloG,Della-FaziaMA,Sassone-CorsiP.CouplingcAMPsignalingtotranscriptionintheliver:PivotalroleofCREBandCREM[J].ExpCellRes,2002,275(2):143-154.[3]于玮，张莉，韩太真，等。成年大鼠海马p-CREB的分布[J].第四军医大学学报，2004,25(10):874-876.[4]HinoiE,BalearVJ,KuramotoN,etal.Nucleartranscriptionfactorsinthehippocampus[J].ProgNeurobiol,2002,68(2):145-165.[5]MalbergJE,BlendyJA.Antidepressantaction:tothenucleusandbeyond[J].TrendsinPharmacologicalSciences,2005,26(12):631.[6]吕奔，唐怡庭，谷蔚琼，等。雌激素对全脑缺血再灌小鼠海马CA_1区P-CREB和BDNF表达的影响[J].神经解剖学杂志，2005,21(4):401-404.[7]AntoniettaCasuM,PisuC,SannaA,etal.Effectofdelta9-tetrahydrocannabinolonphosphorylatedCREBinratcerebellum:Animmunohistochemicalstudy[J].BrainRes,2005,1048(1-2):41-47.[8]HaywardP.Presenilindysfunctionleadstomemoryandplasticitdefects[J].LancetNeurol,2004,3(6):327.[9]KandelER.Themolecularbiologyofmemorystorage:adialoguebetween"genesandsynapses"[J].Science,2001,94(5544):1030-1038.[10]YangBH,SonHKi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