植物病毒课件

植物病毒

第一节概述一、定义病毒(virus)是包被在蛋白或脂蛋白保护性外壳中，只能在合适的寄主细胞内完成自身复制的一个或多个基因组的核酸分子。“分子寄生物”

与其它生物的主要区别：

1.个体微小，其结构简单，无细胞形态；

2.专性寄生物，其繁殖需要寄主提供原料和场所。

按寄主不同，病毒分为寄生植物的植物病毒、寄生动物的动物病毒、真菌病毒以及寄生细菌的噬菌体等。二、危害及作用

数量上占植物病害的第二位。生产上危害较大的植物病毒病害有：烟草花叶病、黄瓜花叶病、马铃薯病毒病、玉米矮花叶病等。

有可利用的价值，提高花卉观赏性，特别在开发基因工程的载体、转基因植物研究等方面，发挥了很大的作用。1576年,郁金香碎色花三、植物病毒学研究历史1886年梅耶尔(Mayer)证明了烟草花叶病害的摩擦传染性;1892年伊凡诺夫斯基(Ivanowski)发现了烟草花叶病的病原可以通过细菌过滤器；1898年伯吉林克(Beijerinck)又发现该病原不是微生物，而是一种传染性活液（contagiumvirumfluidum)，这就是Virus一词的来源；1935年，美国科学家斯坦利（Stanley）获得了烟草花叶病毒的蛋白结晶,认为病毒是可在活细胞内增殖的蛋白（1946年获NobelPrizeinChemistry)。1936年英国科学家鲍登(Bawden)证明提纯的TMV中含有核酸；l939年Kausch通过电子显微镜观察到植物病毒的形态；1971年Diener

发现了很小的RNA（250-400bps)称为类病毒（viroid);1982年发现仅有蛋白质的朊病毒。

1981年，在巴黎举行的第五届病毒学大会上，法国病毒研究所所长阿尔．沃夫A.Lwoff，认为病毒不是生物，他的观点如下：

生长和分裂独立进化独立的生命体活的原生生物＋＋＋＋细胞＋－－＋线粒体和叶绿体＋－－－膜＋－－－染色体、质体含核酸－－－－病毒－－－－综上所述，认为病毒是有机物，而不是生物。四、命名种名：寄主英文俗名＋症状＋virus

烟草花叶病毒Tobaccomosaicvirus，缩写为TMV；黄瓜花叶病毒Cucumbermosaicvirus，缩写为CMV。属名为专用国际名称(英文或拉丁文)，典型成员:寄主名称缩写十主要症状缩写十virus。黄瓜花叶病毒属为Cucu—mo—virus；烟草花叶病毒属为Toba—mo—virus。第二节形态、结构与组分一、形态

基本形态为球状、杆状和线条状。需电镜观察，度量尺度为纳米(nm)。球状病毒的直径20一35nm，少数70-80nm。杆状病毒多为20-80nm×100-250nm，两端平齐；少数两端钝圆，线状病毒多为11—13nm×750nm，个别可以达到2000nm以上。还有少数病毒与以上形态不同，它们有的看上去是两个球状病毒联合在一起，被称为双生病毒(或双联病毒)；有的像弹头，被称为弹状病毒；还有丝线状病毒，柔软不定形。狂犬病毒二、结构

中间核酸，外为蛋白质衣壳，由许多蛋白质亚基组成，杆状或条状病毒的核酸和蛋白质亚基均呈螺旋状排列，粒体空心。

TMV棒状，CMV球状。

球状病毒：20面体或多面体，蛋白质亚基为60个或60的倍数，蛋白质亚基在每个面上不呈螺旋状排列，镶嵌在表面，粒体中心也是空的。TwinnedIcosahedralVirions(18x30nm)三、组分

核酸和蛋白质，核酸在内部，外部由蛋白质包被，称为外壳，有的病毒粒体中还含有少量的糖蛋白或脂类。核酸5--40%，蛋白质60-95%，还有水分和矿物质等。正单链RNA(+ssRNA）：单链RNA可直接翻译形成蛋白质，>60%植物病毒，CMVTMVPVXPVY

负单链RNA(-ssRNA)：先转录成互补链（正链），才能翻译成蛋白。WRDV(小麦丛矮病毒)双链RNA(dsRNA)：负链先转录成正链RNA，才能翻译成蛋白，RDV，dwarf单链DNA(ssDNA):

先合成互补链，形成双链DNA，然后转录成RNA，进行翻译。beetcurlytopvirus双链DNA(dsDNA)：互补双链DNA，CaMV，Cauliflower花椰菜。1、核酸类型化学组成(RNA或DNA)、结构(单链或双链)、复制中的功能

一种植物病毒的基因组只能有一种类型的核酸组成，但可分装在不同的病毒粒体中。2、核酸的多分体现象(multipartitegenome)

病毒的基因组分布在不同的核酸链上，分别包装在不同的病毒粒体里。多分体病毒Multicomponentviruses+ssRNA植物病毒所特有：单分体病毒TMV、PVY

双分体病毒TRV、WYMV

三分体病毒CMV

3、卫星要依赖其它病毒才能存在的小病毒或核酸，称为卫星(satellite)，自身能编码衣壳蛋白的称为卫星病毒。不能编码衣壳蛋白的称为卫星核酸。由于植物病毒的卫星核酸都是RNA，故称为卫星RNA(sRNA)。它们依赖的病毒称为辅助病毒(heIpervirus)。

卫星RNA与辅助病毒包被在同一衣壳内，能抑制辅助病毒的复制，降低其浓度，改变致病力。可以进行生物防治及基因工程抗病毒育种。BBSV病毒粒子与RNA100nm新疆分离物宁夏分离物(蔡祝南,1999)第三节复制和增殖

病毒利用寄主活细胞内的各种物质，依据自身的遗传组成分别合成核酸和蛋白组分，再组装成子代粒体，这种特殊的繁殖方式称作复制增殖(multiplication)复制增殖主要包括：病毒核酸的复制（信息传递）基因组遗传信息的表达转录：mRNA翻译:蛋白质一、病毒基因组的复制

多为RNA复制RNA，有些病毒的RNA在病毒编码的反转录酶的作用下，反转录出互补的DNA植物提供复制场所、原材料和能量、寄主编码的部分酶等病毒自身提供核酸模板和专化性的聚合酶VIRALGENOMEREPLICATION+RNA-RNA+RNA-RNA+RNA-RNA+/-RNA+RNA+/-RNA+/-DNA+RNA+/-DNA+DNA-DNA+DNA二、基因组信息的表达1.转录：mRNA的合成＋ssRNA病毒核酸可直接作为mRNA使用DNA病毒需要寄主提供转录酶－ssRNA病毒随身携带复制酶，首先转录为正链RNA需要寄主提供场所和原料、能量

2.翻译：蛋白质的合成寄主提供核糖体、氨基酸、tRNA、ATP基因少：一般RNA病毒为4-5个，多的高达12个翻译策略：多组分、亚基因组RNAs、多聚蛋白、通读、移码产物：衣壳蛋白、移动蛋白、病毒编码的复制酶或转录酶传播辅助蛋白内含体（inclusion)三、增殖TMV(+ssRNA病毒)的增殖过程脱壳(RNA释放)合成RNA聚合酶负链RNA复制/转录全长+ssRNA亚基因组RNA翻译：CP,MP装配

DNA--RNA--蛋白质，按中心法则进行，由于病毒结构简单，因此，增殖不同于普通细胞。主要是进行复制，转录和翻译。变异：每个变异类群称为一个株系，是病毒种以下的分类单位。有自然发生突变和人工诱变两类，Ｘ射线，Υ射线，高温，亚硝酸等均可引起变异。

第四节植物病毒病的症状

一、外部症状(Symptom)

多为系统发病，表现为变色、畸形，少数引起坏死、腐烂萎蔫极少发生。变色：花叶(mosaic)，黄化(yellow)。坏死(necrosis)：也称作枯斑反应，如TMV侵染心叶烟表现为坏死枯斑，马铃薯Ｙ病毒的某些株系侵染烟草可产生脉(vein)坏死。

畸形：抑制型：矮化(dwarf)，卷叶(leaf-roll)，蕨叶(fern-leaf)。刺激型：丛生(rosette)，肿瘤(tumor)。二、内部变化

1.组织变化：坏死：如烟草花叶病毒侵染心叶烟引起薄壁组织坏死，侵染大豆引起顶芽和侧枝坏死。引起黄化症状的病毒病多是因输导组织、韧皮部坏死引起。增生：植物体内代谢失调，产生激素引起。2.细胞的变化：花叶和斑驳是由叶绿素遭到破坏所致。内含体(inclusion)：某些植物被病毒侵染后，在病组织中产生的一种特殊结构，存在于细胞质或细胞核中，通常由病毒粒体和寄主物质构成。

不同属的植物病毒往往产生不同类型、不同形状的内含体。

①可作为一种诊断的指标。

②并不是所有的病毒病都有内含体。靠内含体诊断有一定的局限性，有些必须发育到一定阶段才形成，同时一种病毒还可有多种形态的内含体。四、症状变化：病毒病症状因病毒、寄主和环境而改变。1.病毒：

①株系(Strain)：同一种病毒在致病性上有差异。“病毒的生理小种”，为了便于与真菌生理小种的区别，称为株系。有弱株系和强株系(症状表现明显，危害较大)。如：TMV弱株系侵染烟草引起轻微斑驳，强株系则引起严重花叶。

②交互保护作用(crossprotection)：

同一种病毒的弱株系先接种植物后，就可以保护寄主免受病毒强株系的严重伤害，即先侵染的病毒可以保护植物不再受亲缘关系较近的另一种病毒的侵染。

如果两种病毒无亲缘关系则没有这种保护作用。

2.寄主：①一种病毒在不同寄主上可表现不同症状。

如：TMV普通烟──全株型花叶症状心叶烟──局部性坏死枯斑②潜伏侵染：当病毒感染某些植物后，可以侵染但不表现症状的现象。如：小麦黄矮病毒在除小麦之外的禾本科作物上不表现症状。3.环境因素：

①温度：〉35℃或〈10℃病害症状轻微，特别是对于花叶病，如油菜花叶病和TMV。隐症：已经表现病毒病症状的植株，由于环境条件改变，症状消失的现象。在条件合适时又可重新表现症状。

隐症：条件不同。潜伏侵染：寄主不同。

②光照：过强、过弱都会影响症状的表现。多数在光弱时花叶病症状容易表现，接种易成功。1、传播指从一植株转移或扩散到其它植株的过程。2、移动指从植物的某一部位到其他部位的过程。根据传播方式不同，可以分为介体和非介体传播两类。传播实验是鉴定病毒的必要手段，了解病毒的传播规律也是病害防治的基础。

近距离主要靠活体接触摩擦而传播，远距离则依靠寄主繁殖材料和传毒介体的传带。第五节传播和移动一、介体传播1、介体种类主要有昆虫、螨类、线虫、真菌、菟丝子等。在传毒介体中，昆虫是最主要的介体，其中70%为同翅日的蚜虫、叶蝉和飞虱，而又以蚜虫为最主要的介体，大部分昆虫传毒的资料来源于蚜虫传毒。蚜虫200种蚜虫传160多种病毒叶蝉(Leafhopper)RDV可经卵传40代飞虱(Planthopper)WRDV螨类(Mite)和线虫(Nematode)真菌(Fungus):菟丝子(Dodder)2、介体与所传病毒的关系

①根据病毒是否在昆虫体内循环划分为循回型病毒和非循回型病毒。

病毒经介体口针、消化道进入血液循环后到达唾液腺，再经口针传播的过程称为循回(circulative)。病毒不在介体体内循环称为非循回型。

循回型病毒分为增殖型和非增殖型。

②

根据介体持毒时间长短分为持久性(persistent)、半持久性(semipersistent)和非持久性(nonpersistent)三种。

三、非介体传播1、机械传播(Mechanicaltransmission)：

“汁液摩擦传播”。指田间接触或室内的摩擦接种。

主要为植株间接触、农事操作、农机具及修剪工具污染、人和动物活动等造成。如烟草花叶病毒属(Tobamovirus)和马铃薯X病毒属(Potexvirus)只有此种传播方式。病毒存在于表皮细胞、浓度高、稳定性强。引起花叶型症状的病毒或由蚜虫、线虫传播的病毒较易机械传播，而引起黄化型症状和存在于韧皮部的病毒难以机械传播。LeafBeforeRubbingLeafAfterRubbing2、无性繁殖材料和嫁接传播在植物体内除生长点外各部位均可带毒

在以球茎、块根为繁殖的作物中特别重要，如马铃薯、大蒜、郁金香等，如母株受侵染则无一幸免。这些无性繁殖材料都可以带毒。嫁接是园艺上非常普通的农事措施之一，也是证明疑难病原物侵染性的重要方法之一。嫁接可以传播任何种类的病毒、植物菌原体和类病毒病害。3、种子传播主要特点为早期侵染和远距离传播。约1／5病毒可种传。带毒种子是检疫的重要对象，如烟草环斑病毒、菜豆普通花叶病毒均可在豆科种子中存活5年以上。种子还可能成为病毒越冬的场所，如CMV可在多种杂草种子中越冬。母株早期受侵染，病毒侵染花器,进入种胚才能产生带毒种子，仅种皮或胚乳带毒不能种传。种传病毒大多可机械传播，花叶症状。随着种子逐渐成熟，带毒率降低；刚采收的种子带毒率高，经贮存逐渐降低。四、病毒的移动病毒的移动都是被动的，自身不具有主动转移的能力。1、细胞间的移动－－胞间联丝

胞间联丝是植物细胞间物质运输的通道。2、长距离移动--韧皮部，有些可在木质部。

TMV在叶片和植株内转移的过程：病毒接种在番茄中部复叶尖端的小叶的侧面，经过1～3天，病毒分布到整个小叶；经过3～5天病毒则经过叶脉、叶柄及茎部的维管束系统到达根部和顶部；25天左右病毒已经在全株分布。病毒随同化物质输送的主导方向运转TMV-番茄(Samule,1934)第六节分类与鉴定国际病毒分类委员会(InternationalCommitteeonTaxonomyofviruses，ICTV)1966-2005年先后发表“病毒分类与命名”报告八次，2005年第八次报告中增加许多新的科属。植物病毒实现了按科、属、种分类。近代病毒分类体系趋于将病毒这类非细胞结构的分子寄生物列为独立的“病毒界”，下分为RNA病毒和DNA病毒两大类。但为方便及习惯，仍按寄主种类分为动物病毒、植物病毒、微生物病毒等实用系统分类。一、分类1、依据

①核酸类型(DNA或RNA)；②核酸是单链(singlestrand,ss)or双链(doublestrand,ds)；③是否存在脂蛋白包膜；④病毒形态；⑤核酸分段状况(即多分体现象)等。

植物病毒分在15个科73个属中（2000）2、病毒类似物

①一些无衣壳蛋白、RNA具有双链结构的称为类病毒(viroid)。

引起病害的症状主要有畸形、坏死、变色等。马铃薯纺锤块茎病(PSTVd)Spindletuber②没有核酸只有蛋白质的侵染因子称为朊病毒(prion)。

以上病毒都归入亚病毒(subviruses)，而由核蛋白体构成的病毒则称为真病毒(euviruses)。二、鉴定原理

植物病毒鉴定的主要目的是确定一种病毒在分类系统中的地位，由于植物病毒个体微小，结构简单，对寄主的依赖性强，鉴定工作难度大，技术性强，对工作条件的要求高。常用方法有生物学实验、血清学检测和电子显微镜观察等。1、生物学实验目的：确定病原的侵染性、传播方式、寄主范围和所致病害的症状类型。鉴别寄主：指用来鉴别病毒或其株系的具有特定反应的植物。凡是病毒侵染后能产生快而稳定、并具有特征性症状的植物都可作为鉴别寄主。

组合使用的几种或一套鉴别寄主称为鉴别寄主谱。鉴别寄主谱中一般包括可系统侵柒的寄主、局部侵染的寄主和不受侵染的寄主。LeafBeforeRubbingLeafAfterRubbing

2、电子显微镜技术

与光学显微镜相比，电子显微镜使用光源的波长更短(属于短波电子流)，因此分辨率也大大提高(比光学显微镜高千倍以上)。但是电子束的穿透力低，样品厚度必须在10～100nm之间。所以电镜观察需要特殊的载网和支持膜，需要复杂的制样和切片过程。

病毒观察最常用的是负染技术和免疫电镜技术。

所谓负染，是指通过重金属盐在样品四周的堆积而加强样品外围的电子密度，使样品显示负的反差，衬托出样品的形态和大小。与超薄切片(正染色)技术相比，负染不仅快速简易，而且分辨率高，目前广泛用于生物大分子、细菌、原生动物、亚细胞碎片、分离的细胞器、蛋白晶体的观察及免疫学和细胞化学的研究工作中，尤其是病毒的快速鉴定及其结构研究所必不可少的一项技术。3、血清学技术原理为抗原与抗体的特异性结合。常用方法是琼脂双扩散和酶联免疫吸附测定法。抗血清制备：利用植物病毒衣壳蛋白的抗原(antigen)特性，可以制备病毒特异性的抗血清(antiserum)。先将纯化的植物病毒注射小动物(兔子、小白鼠、鸡等)，一定时间后取血，获得抗血清。血清制备的关键是病毒的纯化，纯度高的病毒才能获得特异性强的抗血清。琼脂双扩散法：在琼脂凝胶中，抗体和抗原互相扩散，在适当的位置形成沉淀，沉淀线的形状说明抗原和抗体的相互关系。酶联免疫吸附法(EnzymeLinkedImmuneSorbentAssay，ELISA)

：利用了酶的放大作用，使免疫检测的灵敏度大大提高。

一灵敏度高，检测浓度可达1-10ng／m1;二快速，结果可在几个小时内得到；三专化性强，重复性好；四检测对象广，可用于粗汁液或提纯液，对完整的和降解的病毒粒体都可检测，一般不受抗原形态的影响；五适用于处理大批样品，所用基本仪器简单，试剂价格较低,且可较长期保存。

ELISA是实现“快速、准确、经济”检测的最好手段之一。

4、核酸杂交及PCR技术

核酸检测技术是鉴定植物病毒的更可靠方法，常用的主要有核酸杂交和聚合酶链式反应(PCR)方法。核酸杂交主要在DNA和RNA之间进行，依据是RNA与互补的DNA之间存在着碱基的互补关系。在一定的条件下，RNA--DNA形成异质双链的过程称为杂交。其中已知核酸序列片段叫做杂交探针(Probe)，由于大多数植物病毒的核酸是RNA，其探针为互补DNA(complementaryDNA，cDNA)，也称为cDNA探针。核酸检测不仅可以检测到目标病毒的核酸，而且还可以检测出相近病毒(或核酸)间的同源程度。RiceBlackStreakedDwarfVirus

RBSDV基因组dsRNA电泳图左：1.2%琼脂糖凝胶电泳右：10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)

聚合酶链式反应(PCR)是在短时间内大量扩增核酸的有效方法，用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。从已知序列合成两段寡聚核苷酸作为反应的引物，它们分别与模板DNA两条链上的各一段序列互补且位于待扩增DNA区段的两侧。反应时，加热变性、退火、延伸。如此反复进行变性、退火和DNA合成这一循环。每完成一个循环，理论上就使目的DNA产物增加1倍，在正常反应条件下，经25—30个循环扩增倍数可达百万。

PCR扩增在检测标本中病原的核酸序列、由少量RNA生成cDNA文库、生成大量DNA以进行序列测定、突变的分析等方向已经得到广泛的应用。5、稳定性1）稀释限点(DilutionEndPoint，DEP)

保持病毒侵染力的最高稀释度。

用10-1，10-2，10-3……表示，它反映了病毒的体外稳定性和侵染能力，也象征着病毒浓度的高低。TMV稀释限点为l0-4一10-7，CMV稀释限点为l0-3～l0-6，PVY稀释限点为10-2～l0-6(依株系而变)。2）钝化温度(ThermalInactivationPoint,TIP)

处理10min病毒丧失活性的最低温度。番茄斑萎病毒45℃；烟草花叶病毒97℃；而大多数植物病毒在55—70℃之间，PVY钝化温度50～65℃，3）体外存活期(Longevityinvitro，LIV)

室温下(20～22℃)病毒保持侵染力的最长时间。

大多数病毒的存活期在数天到数月。TMV一般在几个月以上，但在干燥的叶片中可以存活50多年；CMV存活期为1～10天，PVY体外存活期2～4天。

三、重要的植物病毒

（一）、TMV

Tobamovirus典型种为烟草花叶病毒(TMV)。直杆状，直径18nm，长300nm寄主范围较广，世界性分布；引起烟草、番茄等作物的花叶病，发生普遍严重。抵抗力强。体外存活期一般在几个月以上。在干燥的叶片中可以存活50多年；稀释限点为l0-4一10-7，钝化温度90℃左右。植株间接触传播，不需要介体．在农事操作中沾染了病株汁液的手或工具通过接触烟苗的微伤口侵入。由于病毒的抗逆力很强，混有病株残体的肥料、种子、土壤和带病的其它寄主植物及野生植物，甚至烤过的烟叶、烟末都可以成为病害的初侵染来源。CUCUMBERMOSAICVIRUS

TypememberofCucumovirusgenusVerywidehostrange(morethan1000species)TwomajorserotypesTransmittednon-persistentlybyaphids

TripartitegenomesimilartoBromemosaicvirus（二）、CMV

Cucumovirus典型种，黄瓜花叶病毒粒体球状，直径28nm。寄主广泛，67科470种植物。CMV病毒粒体的热钝化温度为55-70℃，CMV稀释限点为l0-3-l0-6，而CMV存活期为1—10天。介体昆虫主要是棉蚜和桃蚜，口针型传毒．非持久性．也可经汁液接触而机械传播。生产上通常采用冶蚜防病。栽种抗病或抗蚜品种，以及栽种屏障作物等限制蚜虫传毒的一些措施。POTATO