2027届新高考生物热点冲刺复习重组DNA技术的基本工具

2027届新高考生物热点冲刺复习

重组DNA技术的基本工具发光树棉花棉铃虫导入抗虫基因1.DNA是遗传物质，不同个体可以转移。2.测定氨基酸序列的方法，胰岛素氨基酸序列的测定。3.DNA双螺旋结构模型，遗传物质自我复制的假说。4.实验证明DNA的半保留复制。不久，克里克提出中心法则。5.破译氨基酸的密码子。7.发现了第一个限制酶。6.质粒可自我复制，可在细菌细胞间转移。9.成功构建了体外重组DNA分子。10.基因工程正式问世。13.重组人胰岛素被批准上市。1944年1950年1953年1958年1961年1967年1970年20世纪70年代初1972年1973年1982年8.多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶。11.发明了DNA序列分析的方法。1977年14.第一例转基因烟草。1983年15.第一条转基因鱼。1984年16.PCR为获取目的基因提供了有效手段。1985年17.人类基因组计划启动。1990年18.发明多种高通量测序技术。21世纪19.对特定基因的定点插入、敲除或替换。2013年生物化学、分子生物学和微生物学等学科→基因工程。

1.概念：2.基本工具：一、基因工程概念及其基本工具：（P67—73）苏云金杆菌抗虫棉导入抗虫基因

按照人们的愿望，通过______等技术赋予生物____________，创造出更符合人们需要的新的________和________。转基因新的遗传特性生物类型生物产品1.基因工程概念：（1）别

名：（2）原

理：（3）操作对象：（4）操作水平：（5）操作环境：（6）操作目的：（7）优

点：主要在生物体外。基因（具有遗传效应的DNA片段）。DNA分子水平。创造出人类需要的新的生物类型和生物产品。基因重组定向改造生物的遗传特性；克服远缘杂交不亲和障碍。重组DNA技术思考1：基因重组？①减数分裂形成配子时②人为类型思考2：为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？①DNA分子的基本组成单位相同，都是4种脱氧核苷酸；②空间结构相同，都是规则的双螺旋结构。③都遵循碱基互补配对原则。思考3：为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？①基因是控制生物性状的独立遗传单位；②基因的表达过程相同；③生物界共用一套遗传密码。思考4：基因工程的基本步骤？DNA双螺旋的直径只有2nm，操作的“分子工具”？苏云金杆菌普通棉花(无抗虫特性)抗虫基因导入棉花细胞提取抗虫棉：含Bt抗虫蛋白将体外重组DNA分子导入受体细胞准确切割DNA分子将DNA片段连接起来2.基本工具：（1）分子手术刀——限制性内切核酸酶：（2）分子缝合针——DNA连接酶：（3）分子运输车——载体：（1）分子手术刀——限制性内切核酸酶：①简

称：②来

源：③化学本质：③种

类：④命

名：⑤作

用：⑥识别序列：⑦作用结果：限制酶主要是原核生物。蛋白质数千种（一类酶）生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母（1）分子手术刀——限制性内切核酸酶：⑤作用：5'3'5'3'TAGGTATCCA能够识别双链DNA分子的特定脱氧核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。磷酸二酯键专一性思考1：限制性酶与一般酶的共同点？思考2：限制性酶切细菌本身的DNA？为什么？存在作用？噬菌体侵染细菌催化作用、专一性、活性受温度、PH的影响。不会：

①通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。

②通过长期的进化，细菌DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列。作用：用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。（1）分子手术刀——限制性内切核酸酶：⑥识别序列：⑦作用结果：

大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，（少数4个、8个或其他数量）。中轴线黏性末端平末端产生黏性末端或平末端。SmaⅠ

Eco

RⅠ识别序列：____________；切割部位：____________________5'3'GCTTAA3'5'AATTCG中轴线识别序列：____________；切割部位：____________________5'-GAATTC-3'GA之间的磷酸二酯键黏性末端：_________CC3'5'GGGC5'3'CGGGCC5'-CCCGGG-3'CG之间的磷酸二酯键中轴线平末端5'-AATT-3'①限制酶作用1次，断___个___________，形成___个黏性（平）末端；②____键自动断，但形成平末端时不断氢键！2磷酸二酯键氢⑦作用结果：产生黏性末端或平末端。2现学现用1——P75思考.讨论：

找到两条片段上Eco

RⅠ的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行“切割”、重组。①②③④⑤现学现用1——P75思考.讨论：AATTCTCGGTATGGAGCCATACTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCGGCATAC…3′

GCCGTATG…5′

3′…TATCGTACGATAGGTACTTAA

5′…ATAGCATGCTATCCATG5′…TCCTAG3′…AGGATCTTAAAATTCCATAC…3′

GGTATG…5′③同种限制酶切割不同DNA产生相同的黏性末端→可重新连接成新的DNA分子，但仍可被原来的限制酶切割。思考1：单酶切法重组DNA的结果？①②③④⑤单酶切法重组DNA的局限性：①自身环化、自连；②目的基因反向连接；现学现用3——P75拓展题2：④不同限制酶切割不同DNA可能产生相同的黏性末端→可重新连接成新的DNA分子，可能不会被原来的限制酶切割。同尾酶思考2：选择哪种限制酶来获得Bt基因？

现学现用4——模拟切出苏云金杆菌DNA分子中的“Bt抗虫基因”5’--GGATCCC…TGAATTCAT…CCCGGG…GCTAAGCTTGATCGAATTCAA--3’3’--CCTAGGG…ACTTAAGTA…GGGCCC…CGATTCGAACTAGCTTAAGTT--5’Bt基因原则：切下且不破坏目的基因。BamHⅠ

EcoRⅠ

SmaⅠ

HindⅢ思考1：要获得目的基因，一般需要__个酶切位点、断__个磷酸二酯键、形成__个末端。

244EcoRⅠ

双酶切法优点：防止自身环化、反向连接→简化后续操作，提高重组率。思考1：可否将Bt基因直接导入棉花细胞？植物组织培养资料1：游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解；即便可进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。资料2：1967年，科学家发现一种独立于细菌拟核DNA之外且可以进行自我复制的环状DNA分子——质粒，其可以在细菌之间转移，是基因转移的载体。在之后，科学家又相继在真菌和一些植物细胞中发现了质粒。抗虫棉苏云金杆菌导入棉花细胞思考2：质粒的本质？如何将二者连起来？2.基本工具：（3）分子运输车——载体：①作用：②种类：①质粒：②区别：③条件：将外源基因送入受体细胞，并使其大量复制、表达。苏云金杆菌导入棉花细胞质粒、噬菌体、动植物病毒等。①质粒：②与噬菌体、动植物病毒的区别：裸露的、结构简单、独立于______________或____________之外，并具有

能力的

。真核细胞细胞核原核细胞拟核DNA自我复制

环状双链DNA分子最常用的载体、天然基础上人工改造的。

来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大的差别。③作为载体的条件：

复制原点目的基因插入位点氨苄青霉素抗性基因b.能在受体细胞复制并稳定保存；a.有一个至多个限制酶切割位点；EcoR

ⅠSma

Ⅰ...c.有标记基因；d.对受体细胞无害。（便于目的基因插入）（便于重组DNA分子的筛选）（便于目的基因扩增）

送目的基因，并使目的基因进行大量复制。

思考1：如何筛选出被导入了载体的大肠杆菌？培养加入氨苄青霉素结果：导入重组质粒或普通载体的大肠杆菌存活并繁殖。导入思考2：如何筛选出重组质粒？

氨苄青霉素抗性基因新霉素抗性基因①选用哪种限制酶切割构建重组DNA分子最好？为什么？3种限制酶不是同尾酶防止目的基因和质粒的自身环化；防止目的基因反向连接到载体上。双酶切法：HindⅢ、PstⅠ；思考2：如何筛选出重组质粒？

氨苄青霉素抗性基因新霉素抗性基因3种限制酶不是同尾酶目的基因插入位置②筛选原理及思路：

当质粒上有两个标记基因时，可将目的基因插入其中一个标记基因中，也就是重组质粒上只含1个标记基因，普通质粒上含有2个标记基因。不具有抗性1个抗性2个抗性思考2：如何筛选出重组质粒？

②筛选原理及思路：氨苄青霉素抗性基因新霉素抗性基因目的基因插入位置图1图2

先将受体细胞放在含______的培养基上培养，再通过________法在__________培养基上培养，选择__________________________的细胞即为含目的基因载体的受体细胞。新霉素影印接种氨苄青霉素抗新霉素但不能抗氨苄青霉素资料：LacZ基因表达产生的β-半乳糖甘酶能够分解X-gal

产生蓝色物质，从而使菌落呈蓝色；否则菌落呈白色。无法存活存活；白色存活；蓝色现学现用5——模拟切出苏云金杆菌DNA分子中的“Bt抗虫基因”

5’--…

TG

3’--…ACTTAAAATTCA…--3’GT…--5’Bt基因GTA…GGGCCC…AGCTTAAAATTCAT…CCCGGG…TCG苏云金杆菌思考3：如何将目的基因与“分子运输车”连接起来呢？2.基本工具：（2）分子缝合针——DNA连接酶：①作用：将___________“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个脱氧核苷酸之间的__________。②种类：双链DNA片段磷酸二酯键（氢键自动形成）E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶E.coliDNA连接酶连接平末端的效率要远远低于T4DNA连接酶。DNA连接酶作用没有特异性，可以连接多种末端。限制酶的选择技巧

图甲：目的基因片段图乙：质粒①不能破坏目的基因、标记基因→选择两端的限制酶切割位点；如SmaⅠ（×）；②切割目的基因、质粒的用同种酶或同尾酶→产生相同的黏性末端。方案一：只用PstⅠ切割目的基因和质粒。方案二：同时用EcoRⅠ和PstⅠ切割目的基因和质粒。重组质粒时，同尾酶使切割位点的选择范围扩大。单酶切法：环化、自连、反向连接；双酶切法：防止自身环化、反向连接→简化后续操作、提高重组率。

AATTCA…--3’GT…--5’Bt基因GTA…GGGCCC…AGCTTAAAATTCAT…CCCGGG…TCG5’--…

TG

3’--…ACTTAAAATTCA…--3’GT…--5’Bt基因GTA…GGGCCC…AGCTTAACAT…CCCGGG…TCG5’--…

TG

3’--…ACTTAAAATTDNA连接酶DNA聚合酶磷酸二酯键片段平末端碱基互补配对的黏性末端：将单个脱氧核苷酸连接到已有的核酸片段3’末端。思考4：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？头脑风暴——最大可能挖掘相关酶的考点：①限制酶

②解旋酶

③DNA连接酶

④DNA聚合酶⑤RNA聚合酶

⑥水解酶

⑦逆转录酶作用、结果？限制酶DNA连接酶解旋酶DNA聚合酶项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶DNA酶作用部位作用对象作用结果磷酸二酯键将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键氢键DNA片段DNA单个的脱氧核苷酸DNADNA将两个DNA片段连接成完整的DNA分子切割双链DNA分子将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端将双链DNA分子局部解旋为单链DNA连接酶、限制酶、DNA聚合酶、解旋酶、DNA酶的比较小结：重组DNA技术的基本工具E.coliDNA连接酶③

有一个至多个限制酶切割位点质粒、噬菌体、动植物病毒作用部位：种类DNA连接酶切开DNA分子的磷酸二酯键主要存在于原核生物中具有专一性（能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列）T4DNA连接酶①

对受体细胞无害②

能自我复制或整合到宿主DNA上④

常有特殊的标记基因运载工具条件种类：磷酸二酯键限制酶作用部位：来源：特点：作用结果：产生黏性末端或平末端学以致用：抗虫棉Bt抗虫蛋白苏云金杆菌取出转移

请你描述如何使用这三种工具来获得抗虫棉。思考：如何从细胞中提取DNA，有哪些困难？物理、化学性质差异一、基因工程概念及其基本工具：（P67—75）3.DNA的粗提取与鉴定：（1）实验原理：（2）材料用具：（3）实验步骤：（4）结果分析与评价：3.DNA的粗提取与鉴定：（1）实验原理：①提取原理：②鉴定原理：

DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液。

在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。

3.DNA的粗提取与鉴定：（2）材料用具：①材料的选取：含DNA的生物材料，含量相对较高的成功率更大。鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多、材料易取。3.DNA的粗提取与鉴定：（2）材料用具：研磨液体积分数为95%的酒精2mol/L的NaCl溶液二苯胺②试剂蒸馏水溶解并提取DNA析出DNA溶解DNA鉴定DNA，要现配现用研磨液成分作用SDSEDTATris-HCl缓冲液使蛋白质变性抑制DNA酶稳定DNA试一试：

（1）操作顺序：

（2）每一步的原理或作用？③→②→①→④→⑤3.DNA的粗提取与鉴定：（3）实验步骤：取材研磨过滤/离心DNA粗提取DNA鉴定

称洋葱，切碎，入研钵，倒入研磨液，充分研磨。①研磨的目的：注意事项：破碎细胞，释放DNA。②研磨时间不宜太长、不宜太用力。③可加入纤维素酶、果胶酶。④若是动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。研磨液取材研磨过滤/离心DNA粗提取DNA鉴定方法一：在漏斗中垫上_____过滤研磨液，_____冰箱中静置后取_______；方法二：将研磨液倒入塑料离心管中离心，取________。纱布上清液上清液①纱布不能用滤纸代替：DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。（3）实验步骤：4℃3.DNA的粗提取与鉴定：②低温放置：a.抑制核酸水解酶的活性→抑制DNA降解；b.抑制分子运动→使DNA易形成沉淀析出；c.增加DNA的柔韧性，减少其断裂。③上清液可能含有的杂质：核蛋白、多糖等。上清液

研磨液DNA粗提取DNA鉴定取材研磨过滤/离心3.DNA的粗提取与鉴定：（3）实验步骤：方法一：上清液中加入体积相等的____________溶液，静置2~3min，溶液中出现的____________就是粗提取的DNA。用玻璃棒____________搅拌，卷起丝状物，并用_____吸去上面的水分。方法二：将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的_______（粗提取的DNA）晾干。预冷的酒精白色丝状物沿一个方向滤纸沉淀物①目的：使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。②搅拌时应轻缓、并沿一个方向目的：减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。上清液

研磨液丝状物

沉淀物

3.DNA的粗提取与鉴定：（3）实验步骤：实验组对照组沸水浴加热DNA粗提取DNA鉴定取材研磨过滤/离心将丝状物或沉淀物溶于________________溶液中，加入_______试剂，混合均匀后，将试管置于________加热5min。二苯胺2mol/L的NaCl沸水浴不变蓝呈现蓝色加速颜色反应速度3.DNA的粗提取与鉴定：（4）结果分析与评价：思考1：怎么确认DNA所含杂质较少？若鉴定结果呈现蓝色比较？①观察提取的DNA的颜色，若不是白色丝状物→杂质较多。②若蓝色比较浅→提取的DNA含量低，或实验操作过程出现了失误。思考2：哪些失误可能导致蓝色比较浅？①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分；②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被