荧光原位杂技技术和其临床应用

荧光原位杂交技术及其临床应用

荧光原位杂交（FISH)将分子带进细胞遗传学领域

荧光原位杂技技术和其临床应用1/50荧光原位杂交技术90年代以后,伴随分子生物学技术提升以及向各学科渗透,出现了一个新利用分子伎俩分析染色体异常方法,即:染色体荧光原位杂交(FISH)技术,该技术不但可用于中期分裂相,还可在间期细胞显示杂交信号,尤其适合用于那些培养难以成功各种组织细胞。荧光原位杂技技术和其临床应用2/50由细胞到DNA分子荧光原位杂技技术和其临床应用3/50荧光原位杂交技术基本概念

1.脱氧核糖核酸(DNA)分子2.脱氧核糖核酸(DNA)探针3.脱氧核糖核酸(DNA)变性4.脱氧核糖核酸(DNA)杂交荧光原位杂技技术和其临床应用4/50荧光原位杂交原理FISH基本原理是用已知标识单链核酸为探针,按照碱基互补标准,与待检材料中未知单链核酸进行特异性结合,形成可被检测杂交双链核酸。荧光原位杂技技术和其临床应用5/50荧光原位杂交技术

荧光原位杂交技术（简称FISH)是用细胞遗传学和分子生物学原理，经过荧光标识核酸探针与细胞内核酸序列杂交。借助荧光显微镜，在细胞和（或)组织中观察并分析细胞内杂交于靶序列各种彩色探针信号，以取得细胞内多条染色体或各种基因状态信息。荧光原位杂技技术和其临床应用6/50荧光原位杂交示意图荧光原位杂技技术和其临床应用7/50常见荧色物荧色物激发（nm）散发（nm）DAPI达比350470FITC异氰酸荧光素490525TexasRed德克莎斯红颜料596615荧光原位杂技技术和其临床应用8/50荧光显微镜系统荧光原位杂技技术和其临床应用9/50探针标识种类及比较

1.探针标识方法主要有两类：

（1)直接标识法，就是荧光素经过一些方法直接连接到核酸序列上。

（2)间接标识法，就是把地高辛或生物素等半抗原连接到核酸序列，然后在杂交过后检测阶段，加入标识有荧光素对应半抗原抗体参加反应进行检测。

荧光原位杂技技术和其临床应用10/50探针标识种类及比较2.这两种标识方法相比较而言各有利弊。直接法方便、快捷且背景低，信号强度不及间接法强;间接法含有信号放大系统，信号强检测灵敏度高，不过间接法杂交过后检测步骤繁琐，背景信号强。近年来荧光亮度和抗淬灭性不停改进和提升,直接标识荧光探针越来越成为首选,并采取各种不一样颜色荧光,方便在同一标本上同时检测各种异常.其荧光强度和信号大小都易于在普通荧光显微镜下观察,操作过程中也不需要严格避光,鉴于直接标识法已经能够取得较满意信号，当前临床检测用探针多为直接标识法标识。荧光原位杂技技术和其临床应用11/50临床惯用探针

临床使用探针都是以DNA为主。

惯用探针主要有：（1)着丝粒探针。CEP:ChromosomeEnumerationDNAProbes（2)位点特异型探针。LSI:Locusspecificidentifier（3)染色体涂染探针。WCP:WholeChromosomePaints荧光原位杂技技术和其临床应用12/50着丝粒探针a.高度重复序列DNA,重复数百次至数千次，其靶序列通常是在染色体p11-q11区域及异染色质区域。

b.特点:信号强

c.应用(a)标识染色体识别。

(b)染色体数目异常检测。

(c)间期细胞遗传学研究和临床诊疗。

荧光原位杂技技术和其临床应用13/50着丝粒探针染色体着丝粒异染色质域荧光原位杂技技术和其临床应用14/50位点特异型探针a.标识了荧光信号DNA片段代表了某一个或几个基因位点全部序列。主要用以染色体DNA克隆序列定位和靶DNA序列拷贝数及结构改变检测。

b.特点：信号较小。

c.应用:

（a)定位DNA片段。

（b)确定染色体微小缺失与重复。

（c)间期细胞染色体数目异常诊疗。荧光原位杂技技术和其临床应用15/5016号和22号染色体探针信号位点特异型探针荧光原位杂技技术和其临床应用16/50染色体涂染探针a.涂染探针是针对某一整条染色体设计探针，涂染探针主要用于常规显带技术无法确定染色体重排和标识染色体确实定。能对整条染色体进行荧光标识b.特点：结果轻易判读。然而，整条染色体涂染

探针不能分辨同一染色体臂间易位及染色体倒位。c.应用：（1)染色体数目和结构异常分析。

（2)白血病及其它肿瘤染色体诊疗

和研究。荧光原位杂技技术和其临床应用17/50染色体涂染探针:染色体结构异常分析荧光原位杂技技术和其临床应用18/50FISH技术包含以下几个步骤1)备制玻片2)标本变性3)探针变性4)杂交5)DAPI复染5)荧光显微镜观察FISH结果荧光原位杂技技术和其临床应用19/50羊水标本采集a.在B超腹部探头引导下行羊膜腔穿刺,抽

取羊水20ml,其中15ml用于常规羊水细胞培

养,5ml用于FISH检测。荧光原位杂技技术和其临床应用20/50未培养羊水细胞制片

取羊水5ml,1800rpm离心弃上清,加1mg/mlHank's胶原酶B5ml,37℃水浴30min,1800rpm离心去上清,加0.075MKCl5ml,37℃水浴低渗20min,加甲醇:乙酸=3∶1固定液2ml预固定,1800rpm离心去上清,加5ml固定液轻轻混匀,固定10min,1800rpm离心去上清,再重复固定1次,制成细胞悬液,滴片备用。荧光原位杂技技术和其临床应用21/50杂交前预处理

将玻片于2×SSC溶液中浸泡10min，然后放入0.1MHCl浸泡10min，再放入2×SSC溶液中浸泡5min，然后放入预热到37℃0.01MHCl(放入玻片前，0.01MHCl中预先加入20mg/ml胃蛋白酶160μl)中消化8～10min，经过2×SSC溶液再次浸泡5min后，用70%、85%、100%乙醇中梯度脱水，每次3min，自然晾干，56℃烤片2min。荧光原位杂技技术和其临床应用22/50标本变性

玻片置73℃变性液(70%甲酰胺)中5min，然后分别置于－20℃70%、85%、100%冰乙醇中各脱水各3min，自然晾干，45～50℃烤片。荧光原位杂技技术和其临床应用23/50探针变性

按照百分比(杂交缓冲液:探针:水=7∶2∶

1)混合,离心1～3s,73℃变性5min,45～50℃放置5～10min。(允许FISH探针和目标DNA同时联合变性)荧光原位杂技技术和其临床应用24/50杂交

将10μl探针置于杂交区内,覆盖盖玻

片,封片胶封边,置保湿盒恒温42℃杂交10～16h。荧光原位杂技技术和其临床应用25/50洗脱

拆片，在46℃水浴中，50%甲酰胺/2×SSC液洗涤3次，每次7min;2×SSC液洗涤10min;0.1%np－40/2×SSC洗涤5min。室温70%乙醇洗涤3min，暗处自然晾干。荧光原位杂技技术和其临床应用26/50DAPI染色和荧光镜检DAPI染色和荧光镜检:每片加DAPI10μl,盖上盖玻片,染色15～20min,结果用荧光显微镜观察,选择背景洁净、杂交信号清楚形态圆形或近于圆形细胞记数,并照像。荧光原位杂技技术和其临床应用27/50临床试验中FISH结果判别

每张羊水玻片最少计数50个细胞，判断

标准为:若正常细胞数≥90%则判为正常，若

异常细胞数≥60%则判为异常，若异常细胞数

大于15%而且小于60%，则需要重新检测并加

倍计数到100以上。荧光原位杂技技术和其临床应用28/50FISH检测结果

采取双色13/21号染色体荧光探针检测13号、21号染色体正常胎儿可见2个绿色荧光信号和2个红色荧光信号。荧光原位杂技技术和其临床应用29/50FISH检测结果

13号染色体正常可见2个绿色荧光信号,21号染色体三体胎儿可见3个红色荧光信号。荧光原位杂技技术和其临床应用30/50FISH用于产前诊疗主要探针

染色体数目异常是临床上最主要染色体病,其中13号、18号、21号、X、Y染色体数目异常最为常见,因为13,18,21,X和Y这5种染色体非整倍体异常约占全部染色体异常65％～80％,占染色体异常造成出生缺点85％～95％,所以FISH用于快速产前诊疗主要是针对这5种染色体设计使用荧光标识探针。荧光原位杂技技术和其临床应用31/50FISH用于产前诊疗指征a.妊娠妇女血清学筛查风险高危者（大于等于1/270)及临界风险者(小于1/270至大于等于1/1000)。b.妊娠妇女到预产期时高龄年纪≥35岁。c.双亲之一为易位携带者。d.不良孕产史。e.超声检验胎儿异常者。荧光原位杂技技术和其临床应用32/50FISH敏感度和特异度均较高FISH用于产前诊疗检测敏感度和特异度均较高。

例1.有报道FISH检测4500例未培养羊水细胞，对于常染色体敏感度为92.6%，特异度为100％；性染色体敏感度为100％，特异度为99.9%。

例2.Tepperberg等总结美国25个试验室应用FISH检测5348例羊水资料，结果敏感度为99.6%，特异度为99.98%，阳性预测值为99.8%，阴性预测值为99.96%。

例3.Caine等回顾性分析24742例FISH检测羊水间期细胞敏感度为99.54%，特异度为99.97%，阳性预测值为99.54%，阴性预测值为99.97%；

由此可见，FISH用于快速产前诊疗准确性较高。荧光原位杂技技术和其临床应用33/50FISH产前诊疗技术临床应用染色体数目异常是引发新生儿先天性遗传病主要原因之一。传统羊水细胞培养、染色体核型分析是宫内产前诊疗胎儿染色体疾病主要方法,但该方法所需时间长、技术难度大、易受培养条件影响。对未经培养羊水间期细胞进行荧光原位杂交检测,快速诊疗胎儿常见三体型及性染色体数目异常,含有快速、简便、敏感、特异性强等优点。荧光原位杂技技术和其临床应用34/50FISH产前诊疗技术临床应用价值

正常情况下羊水失败率约为0.5%，超出妊娠24周后培养失败率升至10%。FISH检测成功率年后陆续有大样本研究报道了较为一致成功率，约为95%～98％。后伴随商品化探针上市，操作程序规范化后失败率大大降低。传统核型分析最少需要15mL羊水标本，而FISH只需3～5mL羊水。荧光原位杂技技术和其临床应用35/50FISH产前诊疗技术在国外应用FISH技术最先在美国用于产前诊疗，而到年鉴于FISH技术含有高度敏感性和特异性，美国医学遗传学会（ACMG)宣告FISH技术能够用于常见染色体数目异常确实诊。今后，FISH技术在一些发达国家被广泛用于快速产前诊疗。检测结果普通能够在24～48h就能够取得，且检测结果与核型分析结果一致性能够到达99.5％以上。荧光原位杂技技术和其临床应用36/50产前诊疗技术临床应用价值

在过去30年中视核型分析为产前诊疗"金标准”。FISH技术与核型分析相比，可快速得到结果，该优势能填补其在诊疗准确性方面欠缺，尤其是伴随FISH探针商品化及试验方法日臻完善，FISH可靠性逐步证实，间期细胞核FISH技术能够提供可靠产前诊疗结果，结果直观且便于解释，满足了临床需要，有利于临床决议和减轻孕妇过于焦虑情绪。荧光原位杂技技术和其临床应用37/50FISH与母源细胞污染

羊膜腔穿刺时母源细胞污染可影响标本质量,造成误诊发生。提议发生严重母血污染时不要进行FISH检测。影响FISH结果母体细胞起源羊膜腔穿刺中母体淋巴细胞,这些细胞在体外培养时不会生长。出现母体细胞污染原因很大程度上与临床标本采集时操作相关。所以临床羊膜腔穿过程中应尽可能避开胎盘穿刺,对最初抽出2～4mL羊水改行其它检测。荧光原位杂技技术和其临床应用38/50稽留流产与染色体异常

孕早期胚胎染色体异常是稽留流产最重要原因原因之一，自然流产中胚胎染色体异常占50%左右，而胚胎染色体数目异常，包含整倍体和非整倍体，为其发生主要原因。

荧光原位杂技技术和其临床应用39/50FISH应用于流产胚胎绒毛

绒毛染色体检验是诊疗胎儿染色体异常可靠依据。因为绒毛染色体制备成功率易受其取材时间及标本质量影响,常造成标本分裂相少或染色体形态不佳等情况,给诊疗带来困难。而FISH分析无需作细胞培养及显带分析,仅作细胞计数,其优势是不但适合用于分裂中期染色体,也适合用于间期核及细胞周期全部阶段。荧光原位杂技技术和其临床应用40/50FISH应用于流产胚胎绒毛

选取13.16、18、21、22、X和Y染色体上探针对未培养绒毛组织进行荧光原位杂交来诊断染色体异常，杂交信号明亮,敏感度高,特异性强，克服了流产绒毛组织易污染造成细胞培养不成功，核型分析困难等造成结果难出尴尬局面。荧光原位杂技技术和其临床应用41/50FISH应用于流产胚胎绒毛

胎儿本身遗传学异常才是造成早期流产主要原因,绒毛染色体FISH分析可对自然流产原因及时作出遗传学方面判断,尤其是对高危原因流产绒毛常规行染色体FISH检测是有必要。对习惯性自然流产高危原因及其临床绒毛染色体分析研究,不但能够为稽留流产病因学研究提供理论依据,而且对患者再次妊娠治疗也含有指导作用,所以开展流产胚胎绒毛组织FISH染色体检验是相当有意义。荧光原位杂技技术和其临床应用42/50流产胚胎绒毛FISH图16号染色体探针信号三个（绿色)22号染色体探针信号三个（红色)荧光原位杂技技术和其临床应用43/50流产胚胎绒毛FIS