羊膜干细胞产品质量控制指南（试行）

羊膜干细胞产品质量控制指南（试行）1范围本指南适用于人羊膜来源的未进行基因修饰的原代、扩增培养羊膜干细胞（包括人羊膜上皮干细胞hAEC、人羊膜间充质干细胞hAM-MSC）产品的生产制备与质量控制，适用于临床研究阶段及上市许可申请阶段的羊膜干细胞产品。本指南不适用于经过基因编辑、基因修饰的羊膜干细胞产品，也不适用于脱细胞羊膜基质等非干细胞类羊膜来源产品。2规范性引用文件下列文件对于本指南的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本指南。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本指南。《中华人民共和国药典》（2020年版三部）《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）》（国家药品监督管理局，2017年）《药品生产质量管理规范》（2010年修订）GB19489-2008实验室生物安全通用要求ISO20399-2022生物技术—细胞疗法—原材料和产品的术语3术语和定义3.1羊膜干细胞（AMSC）：来源于胎盘羊膜组织的成体干细胞，根据来源部位和生物学特性分为人羊膜上皮干细胞（hAEC，来源于羊膜上皮层）和人羊膜间充质干细胞（hAM-MSC，来源于羊膜基质层）两类。3.2三级种子批：指从原代分离细胞依次建立的主种子批、工作种子批、终生产细胞批三级细胞储存体系，用于规模化、连续生产。3.3终产品：指完成生产制备，包装后可直接用于临床输注或制备为最终给药制剂的羊膜干细胞制品。4原材料质量控制4.1供体筛查与入选标准4.1.1入选标准：（1）足月妊娠（胎龄37~42周）剖宫产健康产妇，年龄18~35周岁；（2）无妊娠并发症，包括无子痫前期、妊娠期高血压、妊娠期糖尿病、宫内感染、胎膜早破超过12h等；（3）术前供体血清学及病原体核酸检测结果全部阴性；（4）签署知情同意书，经伦理委员会审查批准。4.1.2排除标准：（1）既往有恶性肿瘤、遗传性疾病、自身免疫性疾病、慢性传染性疾病史；（2）近6个月有输血史、血液制品使用史、疫区旅居史、传染病高危暴露史；（3）合并生殖道感染、产道损伤；（4）检出乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）、梅毒螺旋体（TP）、巨细胞病毒（CMV）、EB病毒、细小病毒B19（B19V）等病原体核酸或抗体阳性；（5）产前检查提示胎儿存在遗传性疾病或发育畸形。4.1.3窗口期管理：对于采集后冻存备用的羊膜组织，需隔离储存至少14天，待供体复查上述病原体检测结果仍为阴性后方可启用，降低窗口期感染风险。4.2羊膜组织采集与运输4.2.1采集要求：剖宫产手术中无菌条件下完整剥离胎盘，分离羊膜层，去除残留血块、母体蜕膜组织，采集后立即放入预冷的（2~8℃）无菌组织保存液中，保存液添加青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml预防运输过程微生物污染。4.2.2运输要求：采集后24h内必须转运至GMP生产制备场所，运输全程维持温度2~8℃，采用经校准的连续温度记录仪实时监控温度，温度波动超出2~8℃范围超过10min的整批羊膜组织予以报废。4.2.3原料验收：生产场所接收羊膜组织后，需核对供体编号、检测报告、运输温度记录，肉眼检查羊膜组织无血肿、坏死、粘连、异常变色，符合要求后方可投入生产。5种子批系统质量控制羊膜干细胞生产必须建立三级种子批体系，各级种子批必须明确来源、传代历史、储存条件、批量，每个种子批需完成相应项目检测合格后方可使用：1.主种子批（MCB）：由原代分离得到的同供体单一批次细胞扩增后分装冻存建立，需完成全项检测：细胞活率、细胞计数、无菌检查、支原体检查、病原体核酸检测、表面标志物鉴定、STR分型鉴定、核型分析、致瘤性试验，所有项目符合标准后方可用于制备工作种子批。主种子批储存于-196℃液氮气相，储存有效期不超过20年，复苏后活率不低于85%。2.工作种子批（WCB）：由主种子批复苏扩增制备，检测项目包括：细胞活率、无菌检查、支原体检查、表面标志物鉴定、STR分型，合格后方可用于生产，工作种子批累计传代次数不得超过P3，群体倍增水平（PDL）不得超过10PDL，复苏后活率不低于85%。3.所有种子批STR分型必须与原供体一致，无其他细胞交叉污染，无异源细胞污染。6生产过程质量控制6.1生产环境与人员要求生产过程必须在符合GMP要求的洁净区进行，细胞分离、培养、收获、分装区域洁净度级别为万级，层流罩等局部操作区域洁净度级别为A级；生产环境微生物监测周期不超过1周，监测标准为：万级洁净区沉降菌（φ90mm培养皿，暴露4h）≤10cfu/皿，浮游菌≤100cfu/m³，表面微生物≤20cfu/接触碟，符合要求方可生产。生产操作人员必须经过GMP、生物安全培训合格，持证上岗，进入洁净区必须遵守无菌操作规范。6.2关键工艺过程控制所有关键工艺参数必须经过工艺验证，明确可接受范围：（1）分离：采用酶消化法分离细胞，常用体系为0.1%GMP级胶原酶IV联合0.05%胰蛋白酶，37℃±1℃振荡消化60~90min，消化结束后终止消化，300g室温离心10min收集细胞沉淀；（2）培养：接种密度控制在1×10^4~5×10^4cells/cm²，培养温度37℃，CO₂浓度5%±0.5%，饱和湿度，每2~3天更换一次培养基；（3）传代：细胞融合度达到80%~90%时进行传代，传代比例控制在1:2~1:3，严禁超过1:4传代；（4）收获：细胞达到预定密度后，胰酶消化收获，离心洗涤去除培养基残留，制备为细胞混悬液。6.3过程杂质控制原代培养阶段可添加抗生素预防污染，传代扩增阶段禁止添加任何抗生素；生产过程使用动物源原材料必须符合中国药典要求，优先使用无动物源、无血清培养基；所有过程添加的试剂必须符合药用级要求，留存来源、批号、质检报告。6.4过程中间检测要求每一代细胞收获后必须完成中间检测，检测项目包括：细胞活率、细胞计数、无菌检查、支原体检查，细胞活率低于90%不得进入下一次传代，无菌或支原体阳性批次立即报废，严禁流入下道工序。终收获后，累计传代次数不得超过P6，群体倍增水平不得超过20PDL，超出范围的批次判定为不合格。7终产品质量控制7.1性状终产品应为均匀混悬的细胞悬液，无肉眼可见的细胞团块、异物、变色、沉淀；pH值应为7.2~7.4；渗透压应为280~320mOsmol/kg；细胞活率≥90%；细胞浓度符合产品规格要求，允许偏差为±10%。7.2鉴别采用流式细胞术检测细胞表面标志物，不同类型细胞符合以下标准：①人羊膜间充质干细胞（hAM-MSC）：CD90阳性率≥95%，CD73阳性率≥95%，CD105阳性率≥95%，CD34阳性率≤2%，CD45阳性率≤2%，HLA-DR阳性率≤2%；②人羊膜上皮干细胞（hAEC）：CD326（EpCAM）阳性率≥90%，CD29阳性率≥90%，CD73阳性率≥85%，CD34阳性率≤2%，CD45阳性率≤2%，HLA-DR阳性率≤5%；STR分型鉴定：采用STR图谱法鉴定，结果与原供体STR图谱一致，无异源细胞、其他供体细胞交叉污染；异体产品需检测母体蜕膜细胞残留，残留比例≤3%。7.3安全性检测1.无菌检查：按照《中国药典》2020版通则1101检测，不得检出需氧菌、厌氧菌、真菌；2.支原体检查：按照《中国药典》2020版通则1102检测，不得检出支原体；3.内毒素检测：内毒素含量≤0.5EU/ml；4.病原体核酸检测：采用高通量测序或荧光定量PCR法检测HBV、HCV、HIV、TP、CMV、EBV、B19V，所有病原体核酸检测均为阴性；5.遗传稳定性：采用G显带核型分析，计数至少20个中期分裂相，染色体数目和结构异常比例≤5%，无致病性染色体畸变；6.致瘤性试验：主种子批及终产品（每20批抽样1批）完成免疫缺陷鼠致瘤性试验，接种1×10^7个细胞后观察16周，无肿瘤形成；软琼脂克隆形成试验克隆形成率≤1%，符合要求。7.4纯度与杂质检测1.细胞纯度：目标细胞比例符合标志物要求，非目标细胞比例≤5%；细胞大小变异系数≤20%，均一性符合要求；2.工艺杂质残留：胎牛血清白蛋白残留≤50ng/ml，胰蛋白酶残留≤10ng/ml，胶原酶残留≤50ng/ml，抗生素不得检出；冻存产品二甲基亚砜（DMSO）终浓度不得超过10%（v/v）；3.不溶性微粒：粒径≥200μm的不溶性微粒≤10个/ml，符合静脉输注要求。7.5生物学效力检测产品需根据预期用途建立特异性生物学效力检测方法，效力活性符合预定标准，通用要求如下：1.hAM-MSC通用效力标准：采用混合淋巴细胞反应检测免疫抑制活性，效应T细胞与hAM-MSC比例为1:1时，hAM-MSC对T淋巴细胞增殖的抑制率≥50%；2.hAEC通用效力标准：采用多向分化诱导试验，成骨分化诱导后茜素红染色阳性率≥80%，上皮细胞标志物CK19表达阳性率≥90%，符合多能性要求。8储存与运输质量控制8.1储存：冻存终产品储存于-150℃以下液氮气相环境，严禁长期储存于-80℃冰箱；新鲜制备未冻存终产品储存于2~8℃，储存时间不得超过24h；储存环境必须持续温度监控，每2h记录一次温度，温度超出范围立即转移产品，评估对产品质量的影响。8.2运输：（1）冻存产品运输采用干冰保温，维持运输温度≤-70℃，全程连续温度记录，运输时间不得超过72h；温度波动超过-70℃±5℃范围超过30min的整批产品报废；（2）新鲜产品运输采用2~8℃保温冰盒，维持温度2~8℃，运输时间不得超过24h；超出时间范围的产品报废。9产品放行与追溯管理9.1产品放行：羊膜干细胞产品必须由经培训合格的质量授权人放行，放行前需审核所有文件：供体筛查记录、伦理审查文件、批生产记录、批检验报告、所有检测原始数据，所有项目符合标准、文件完整方可放行，不合格产品不得放行，按照医疗废物管理规定销毁，留存销毁记录。9.2记录留存：所有生产、检验、放行记录至少保存至产品有效期后5年，临床研究用产品记录保存至临床研究结束后10年。9.3追溯管理：建立全过程追溯体系，每个供体、每批产品赋予唯一识别码，从供体采集、生产、储存、运输、临床使用全环节可追溯，可实现从受者反向追溯至供体，从供体正向追溯至所有受者的双向追溯。9.4不良反应监测：临床研究及上市后产品需建立不良反应监测体系，所有不良事件记录完整，定期上报药品监管部门，重大不良事件24h内上报。10质量控制管理与验证10.1工艺验证：所有生产工艺必须完成工艺验证，连续三批产品所有检测项